第5章 目的基因的克隆与基因文库的构建
第讲 目的基因的克隆与分离
第讲目的基因的克隆与分离引言目的基因是指在一项研究中，具有研究意义或实际应用价值的基因。
目的基因克隆和分离是分子生物学研究的重要环节，它们为后续研究提供了基础和保障。
本文将介绍目的基因克隆和分离的方法和技术。
一、目的基因的克隆1. PCR扩增PCR是聚合酶链反应的简称，是一种利用DNA聚合酶酶作用、在体外增加DNA序列数量的技术。
PCR扩增可以在保证目的基因序列一致性的前提下，扩增出足够的DNA量，用于后续实验。
PCR扩增的步骤一般包括模板DNA的选择、引物的设计和勘误、PCR反应体系的搭建等。
2. 基因文库筛选基因文库指的是将一个或多个组织的基因在体外克隆并构建而成的基因库。
基因文库筛选是一种在文库中选取目的基因的方法。
其中最常用的是基于杆菌的蛋白表达文库、细胞质体DNA文库和DNA合成文库。
基因文库筛选的步骤一般包括构建文库、传统筛选和高通量筛选。
3. 限制性内切酶切割限制性内切酶切割是指利用特定的酶切位点将DNA分割成碎片，然后选取目标DNA寻找需要的限制酶切片段的方法。
这种方法可以快速而准确地寻找目的基因，并进行克隆。
限制酶切割的步骤一般包括DNA提取、DNA质量检测、选取限制酶和体外反应等。
二、目的基因的分离1. 分子杂交分子杂交是指在体外或体内使某一脱氧核糖核酸（DNA）与另一种DNA或核酸杂交而形成方法的过程。
它的作用是寻找与目的基因DNA互补的DNA序列，并在该序列中分离目的基因。
分子杂交的步骤主要包括细胞培养和DNA序列的寻找和筛选等。
2. 化学合成化学合成是指通过化学方法合成目的基因的方法。
这种方法可以直接合成目的基因，只要知道目的基因的序列就可以了，不需要进行PCR扩增、克隆等操作。
化学合成的步骤主要包括碱基合成、链延伸、中间产物合成和连接、滤液等。
3. 通量基因测序通量基因测序也称为高通量测序，是一种快速且准确测定DNA或RNA序列的方法。
通过对目的基因进行测序，可以快速分离目的基因。
分子生物学-第5章-分子生物研究法(上)精选全文完整版
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)
一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸 水解酶
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
分类: Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae 自主 复制能力的 DNA分子（ vector），如 病毒、噬菌体 和质粒等小分 子量复制子都 可以作为基因 导入的载体。
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记 实验或用来进行DNA的连接 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸
从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸
从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团
1972 - Paul Berg,
Produced first recombinant DNA using
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术
5.1 重组DNA技术回顾
三大成就 ：
1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体 是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
• 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之 进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续 稳定的繁殖和表达。
DNA文库的构建和目的基因的筛选
第八章 DNA文库的构建和目的基因的筛选第一节 概述基因工程主要是通过人工的方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。
通常将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为目的基因。
因目的基因片段需插入载体，导入宿主细胞内复制，所以对宿主细胞DNA而言，又称它为外源性基因。
目的基因主要是编码蛋白质(酶)的结构基因，诸如抗逆性相关基因、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因以及工业用酶相关基因等。
随着生物长期的进化，生物界积累了大量对人类有用的基因。
它是大自然恩赐于人类的宝贵资源，等待人们去开发利用。
目的基因用途很广，主要有以下几个方面：①研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结构、功能及调控。
②与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治疗对策。
③研究生物种系进化与相关同源性。
④应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。
⑤在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目的基因，以改良品种，促进经济发展。
⑥建立基因疗法院，选用某种正常基因,引入患者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。
根据研究对象的研究目的不同，目的基因可来自原核细胞或真核细胞。
原核生物基因组较简单，较易获得目的基因。
哺乳动物真核细胞基因组庞大复杂，可根据不同的要求选择适宜方法，从中获得目的基因。
要从数以万计的核苷酸序列中挑选出非常小的所感兴趣的目的基因，是基因工程中的第一个难题。
欲想获得某个目的基因，必须对其有所了解，然后根据目的基因的性质制定分离的方案。
目的基因的制备是基因工程研究和应用的关键内容之一。
根据实验需要，待分离的目的基因可能是一个完整的有功能的基因，除了编码区，还包含转录启动区和终止区序列，或者是一个完全的操纵子或基因簇，也可能是只具有编码序列的基因区，甚至是只含启动子或终止子等部件的DNA片段。
分子生物学-10-3-第五章基因文库1-概念和步骤
不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所组建的cDNA也就不同3.代谢或发育特异性
处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同
4.不均匀性在同一个cDNA中，不同类型的cDNA分子的数目是大不相同的，尽管它微量分析
由于PCR技术具有高度敏感性，故可用于微量DNA和RNA的分析检测。
4.DNA序列测定
5.基因突变分析
5、反转录PCR
1.定义：
RT-PCR是指利用反转录酶将RNA反转录(RT)成cDNA(Complementary DNA)，然后以cDNA为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段的技术。用于在RNA水平检测基因表达的情况。克隆特定基因的cDNA序列和检测RNA病毒。
PCR三步曲
–变性90～97℃
–退火45～55℃
–延伸72℃左右
2、几个关键点
1.第一周期中，合成的每一条新生链都超出了另一个引物的位置；
2.在第二个周期中，以第一周期中合成的DNA为模板合成的DNA位于两引物位置之间，这就是所需扩增的特异DNA片段；
3.在第三个周期中，经过同样的变性、复性、延伸步骤进行扩增，以第二轮中的新生链为模板实际克隆数的公式
N=ln(1-p)/ln(1-f)
•式中，N是所需克隆数；P为重组体群体中出现目的基因序列的几率；f为限制片段的平均大小与基因组DNA总量之比。
例：大肠杆菌基因组大小为4.6×106bp,所克隆基因组DNA片段的大小为2×104bp，为采用的方法有：
与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的mRNA获得已知目的基因片段；
利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板，获得已知的2.基因的体外突变
基因工程思考题
《基因工程》思考题第一章绪论1. 简述基因操作、基因重组和基因工程的关系。
2. 为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物？3. 简述基因的结构组成对基因操作的影响。
4. 谈谈你对gene的认识，并简要说说gene概念的演变过程.5. 如何理解gene及其产物的共线性和非共线性？6. 试从理论和技术两个方面谈Gene Engineering诞生的基础.第二章基因工程的基本原理与支撑技术1. 试比较原核基因组与真核基因组的结构和功能特点2. 试比较原核基因和真核基因表达调控的主要方式和特点3. 分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？4. 琼脂糖凝胶电泳中，简述影响DNA在凝胶中迁移速率的因素.5. 小量制备质粒DNA，用质粒中特定的酶切发现切割不动，试分析可能原因及克服方法？6. 在基因操作实践中有哪些检测核酸和蛋白质分子量的常规方法？7. 印迹分子杂交有哪些种类，并说明在什么情况下需要使用这些方法。
8. 核酸分子的标记有哪些方法，各有何特点？9. 由mRNA反转录成cDNA和DNA的PCR扩增是两个完全不同的酶催化反应过程，如何将两个过程联系在一起，实现由mRNA起始扩增出DNA？10. Primer是PCR反应体系的四大要素之一，PCR的许多应用都是通过primer设计来实现的，请问primer设计的一般原则是什么？11. 在PCR反应的后期，或者循环次数过多时，反应体系中就会出现一种所谓的平台效应（Plateau effect），请问什么叫Plateau effect？产生Plateau effect的原因有哪些？12. 在对PCR产物进行电泳检测时，有时会出现拖带或非特异性扩增条带，请分析其原因？如果检测结果是看不到DNA带或DNA带很弱，那又是为什么？13. 通过双向蛋白质电泳发现某蛋白质与某植物的一种表型密切相关，若要利用编码该蛋白质的基因来转基因植物，试问如何分离得到该基因？14. 现有一序列已知的DNA片段和一序列未知的DNA片段，你分别如何设计测序策略？15. 设想一下在什么情况下你希望知道一个基因或一段DNA的序列？16. 什么叫有性PCR？有性PCR导致DNA重组的分子机制跟体内重组有何异同？17. Explain the PCR. List the steps in carrying it out; include all the components and special conditions, explaining why each one is used. Illustrate the process with appropriate labels. Use the correct scientific terminology in your explanation.第三章基因工程操作的基本条件1. 试指出影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素.2. 在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？3. 何谓Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法.4. 某DNA序列中存在DpnI酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？5. 天然的质粒载体（plasmid vectors）通常需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段，引入多克隆位点等。
目的基因的克隆与基因文库的构建
mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，
分离纯化困难
仅限于克隆蛋白质编e Chain Reaction）法，又称为聚合酶
链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序
使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的
基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必
需的双引物
PCR法定向扩增目的基因的基本原理
C PCR法
5‘
5‘
目的基因
5‘
变性
加热
5‘
5‘
引物
退火
5‘
5‘
底物
聚合
5‘
5‘
5‘
5‘
加热
变性
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
克隆入合适的载体
Klenow酶聚合
化学合成法的基本战略
全基因合成
1
混合退火
2
T4-DNA连接酶连接
3
克隆入合适的载体
4
Klenow酶聚合
5
大片段酶促法： 根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段
6
化学合成法的基本战略
全基因合成
上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%
DNA文库的构建和目的基因的筛选
按照外源DNA片段的来源来分：基因组、 片段的来源来分：基因组、 按照外电泳
色 体 文 库 构 建
红色Ura+,Try+转化子菌落（四）基因组的筛选利用同源探针克隆基因
三、cDNA的构建 的构建构建cDNA应满足的条的筛选（一）构建cDNA应满足的条件 构建 应满足的条件
的代表性 重组cDNA的序列完整性 的序制备 的制备 细胞总 及mRNA的分离 的分离 cDNA第一链的合 第一链的合 成 双链cDNA链的合 链的合 双链 成 与载体的连接 噬菌体颗粒的大于研究基因的平均长度 含有相邻DNA片段的独立克隆间 片段的独立克隆间 含有相邻 克隆片段易于从载体上完整卸下最好不带任何载体序列 重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。 重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。ຫໍສະໝຸດ （二）基因组的构建过程
基因组DNA的分离制备 的分离制备 基因组 基因组DNA的片段化 基因组 的片段化 载体制备 重组连接 噬菌体离体包装 重组噬菌体感 X
B
Ori
X
ARS1
pYAC4
酵 母
TRP1 CEN4 Sup4 S E
Sm
基因文库的构建与使用
基因文库的构建与使用在生物科学领域，基因文库的构建和使用是研究基因功能和生物多样性的重要工具。
基因文库是指包含某种生物全部基因的克隆文库，它可以为我们提供深入了解该生物基因组的信息。
本文将详细介绍基因文库的构建与使用，包括基因文库的基本概念、构建方法、使用方法以及优势和展望。
一、基因文库的基本概念和作用基因文库是包含某种生物全部基因的克隆文库，它为我们提供了该生物基因组的全面信息。
构建基因文库的目的是为了方便研究者们筛选、分析和研究基因的功能以及多样性。
基因文库可以用于寻找基因的新颖功能、发现新的药物靶点以及为基因组编辑和改造提供资源。
二、构建基因文库的方法构建基因文库主要包括以下步骤：1、基因组文库的构建：首先需要获得该生物的基因组，然后将基因组进行分解，形成一系列重叠的DNA片段。
这些片段经过纯化、扩增和克隆到特定的载体中，形成基因组文库。
2、表达文库的构建：为了筛选出具有特定功能的基因，还需要构建表达文库。
表达文库中的基因需要在特定的细胞或组织中表达，以便研究者们能够确定基因的功能。
在构建基因文库时，需要考虑到基因的种类、基因表达水平以及克隆载体的选择等因素。
这些因素都会影响到基因文库的质量和实用性。
三、基因文库的使用方法使用基因文库可以方便地筛选和研究基因的功能。
以下是如何使用基因文库的一般步骤：1、选择相应的基因文库：首先需要选择包含所需基因的文库。
如果研究目标是寻找特定功能的基因，可以选择包含该功能基因的文库。
2、筛选候选基因：根据研究目标，可以在文库中进行筛查，挑选出可能具有所需功能的候选基因。
3、验证基因功能：通过实验验证挑选出的候选基因是否具有所需功能。
这可以通过表达和检测候选基因在细胞或整体生物中的功能来实现。
4、利用基因文库进行基因组编辑：基因文库也可以为基因组编辑提供资源和指导。
通过比对和分析基因文库中的序列，可以确定目标基因的精确位置和剪切位点，从而实现精准的基因组编辑。
分子生物学第五章课后思考题答案【修订版】
分子生物学第五章作业1、哪些重要的科学发现和实验推动了DNA重组技术的产生及发展？答：近半个世纪来，分子生物学主要取得了三大成就：第一，20世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。
但事实上，DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。
其中，限制性内切核酸酶和DNA连接酶等工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。
DNA重组技术的产生及发展过程中比较重要的科学发现和实验如下：1957年A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。
1965年S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由"质粒"DNA所决定。
1967年年世界上有五个实验室几乎同时宣布发现了DNA连接酶。
1970 年H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。
H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。
1972-1973 年H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。
1978 年首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。
1981 年R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。
1982 年美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。
第五章_cDNA文库的构建
通常由以下原因造成:
• prey蛋白的非特异性结合；
• 无需与诱饵蛋白结合就能诱导报告基因的转录。
三、cDNA噬菌体展示
• 将编码特异蛋白的基因序列插入噬菌体基因组， 并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因相融合。重组
噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有杂合
外壳蛋白的噬菌体颗粒，直接用于捕获靶蛋白库 中与外源蛋白质相互作用的蛋白质。
表达亦不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因 转录而来的。 5. 各cD纯化载体DNA片段的制备。
2.双链cDNA 的合成。
1）单链cDNA 的合成：反转录法
3’
第二链合成
• 剩下的cDNA单链的3’末端可能形成一个弯回来的 双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条 cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。
5’
cDNA第一链 DNA聚合酶 cDNA第二链合成 cDNA第一链 cDNA第二链
5’ 3’
• 用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA 中基因，仅代表某种生物的一小部分
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
遗传信息，且只代表正在表达的基因的遗传信息：
2. 器官特异性 不同器官或组织的功能不一样，因而有的结 构基因的表达就具有器官特异性，故由
处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因
群同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。 • 不能杂交的cDNA即为特异表达的A基因的cDNA单链。 • 用羟磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行 扩增、克隆、测序。
A组织
总mRNA（A）
含蛋白A的mRNA
B组织
总mRNA（B）
不含蛋白A的mRNA
总cDNA第一链
内含蛋白A 的cDNA
[转载]基因文库构建的过程、原理及方法
![[转载]基因文库构建的过程、原理及方法](https://img.taocdn.com/s3/m/75baf7f9162ded630b1c59eef8c75fbfc77d94c1.png)
[转载]基因⽂库构建的过程、原理及⽅法原⽂地址：基因⽂库构建的过程、原理及⽅法作者：蓝茶基因⽂库构建的过程、原理及⽅法1 cDNA ⽂库的构建1.1 cDNA ⽂库构建的基本原理与⽅法cDNA ⽂库是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA ⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合。
经典 cDNA ⽂库构建的基本原理是⽤ Oligo(dT) 作逆转录引物，或者⽤随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得⽂库。
其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取⽅法的选择主要根据不同的样品⽽定)，要构建⼀个⾼质量的 cDNA ⽂库，获得⾼质量的 mRNA 是⾄关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细⼩⼼。
由于 RNA 酶存在所有的⽣物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建⽴⼀个⽆ RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。
在获得⾼质量的 mRNA 后，⽤反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(⽤RNA 酶 H 和⼤肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使⽤ T4 噬菌体多核苷酸酶和⼤肠杆菌 DNA 连接酶进⾏的修复反应)，合成接头的加⼊、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插⼊⽚断，扩增 cDNA ⽂库、对建⽴的 cDNA ⽂库进⾏鉴定。
这⾥强调的是对载体的选择，常规⽤的是λ噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可⽤来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳⼤⽚段的外源 DNA。
1.2 cDNA 全长⽂库经典 cDNA ⽂库的构建虽然⾼效、简便，但⽂库克隆的⽚段⼀般较⼩，单个克隆上的 DNA⽚段太短，所能提供的基因信息很少，⼤多需要⼏个克隆才能覆盖⼀个完整的全基因的 cDNA。
为了克隆到真正的 cDNA 全长，建⽴富含全长的 cDNA⽂库具有重要意义。
基因文库的构建
出于压缩重组克隆的数量，用于基因组构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体
由于绝大多数真核生物的几种载体的最大装载量如下：
质粒
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
ABC
DEF G
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
A
1
1
1
1
B
1
11
1
C
1
1111D Nhomakorabea1
1
11
1
E
1
1
1
1
F
1
1
11
G
1
1
1
1
01 04 12 06 13 14 02 14 07 19 11 15 05 08 16 0的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排 列成一个像天然染色体DNA上所表现出的信息基因的基本概念 基因的构建程序 基因组重组克隆的排序
基因的基本概念基因库与基因
基因库（gene pool） 特定生物e bank） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式 存序列为探针，进行第二步走 读，直至线型染色体DNA的端点
染色体走读法（chromosome walking）
亚克隆旁测序列
基因工程 第五章目的基因的获取
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入1220个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶 合成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA mRNA 5’ TTTTTTT cDNA 反转录酶 Oligo dT引物
5’
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) ：
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。
随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。 ② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。
（Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法 （1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp 的随机片断。
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
1. 优点 由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。 2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I
BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。 （1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度。
基因文库的构建
（2）cDNA与载体相连
cDNA与一个载体在T4连接酶作用下以粘末端 互相连接，即为重组DNA 分子。
（3）导入宿主细胞 重组体在一定条件下导入宿主细胞培
养或保存。 宿主细胞必须是来自一个细胞的克隆
体的寡核苷酸链为探针）
2. mRNA比基因组中基因少, 因此筛选某一特 定功能基因工作量较小。
3. mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数, 利 于获得较多的模板。（转录特征）
4. 可在原核细胞中表达有生物活性蛋白
5. 不同种类不同状态的细胞的cDNA不同 6. 不能研究基因组的结构功能
构建cDNA1.制备mRNA凝胶阻滞法
DNase Ⅰ足迹法
4.7.1 凝胶阻滞实验
又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay），是在80年代初期出现的用于 在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊 的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点， 也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质定长度的DNA片段克隆到某种载体上发育时期所转录的mRNA 经逆转录形成的cDNA片段与某种载体ene pool)：某一生物群体所拥有的全部基因。
4. 筛选目的基因
原核细胞不可用来作为基因的表达系统 （无转录后加工）。
原核细胞基因库——只能用核酸探针杂 交筛选目反转录酶的作 用下将点：
1. cDNA无内含子, 长度较基因组基因小, 使操皿内所形成的菌落或噬菌斑）转印到硝酸 纤维素膜上，碱解后加带标记的探针进行杂交，能显 示特异结合探针的点（克隆）便是目的基因所在处。 确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取，再用限制性 酶切出cDNA基因片断，即为目的基因。（如图）
溶菌、使DNA 暴露
第五章目的基因的获取
目的标签法、非目的标签法
五、图位克隆（mapbased cloning）获 得目的基因
图位克隆：又叫定位克隆，1986年首先由剑
桥大学的Alancoulson提出。
根据目的基因在染色体上的位置进行分离基因，
无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先
六、mRNA差别显示技术（mRNA differential display）获得差异表达的基因
mRNA差别显示技术：对组织特异性 或诱导专一性表达基因进行分离的有效方 法之一。将mRNA逆转录和PCR技术相 互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技 术，也称为DDRT-PCR，
DDRT-PCR理论基础
3’ 5’
template templat因库（gene pool）：特定生物体全基因组的
集合（天然存在）e bank） 通过克隆的方法将某一基因组DNA或mRNA 保存于适当宿主菌中形成的转化子群。所有重 组DNA组合代表该基因组的全序列。
探针：目的基因局部片段、由氨基酸序列
获得的简并序列、近缘物种的同源序列
四、转座子标签法获得目的基因
（一）转座子的相关知识
转座子（transposon,Tn）:指位于染色体上
可以从基因组的一个位置转移到另一个位置的 DNA片段或基因。（jumping gene）
简单转座子：除转座所需基因外不携带任何
实验结果： 240组在能分出20000多条带！ 如果每条带相当于一种特定mRNA， 20000 mRNA基本上反映了一种特定细 胞中全部的mRNA。
DDRT-PCR操作步骤
*差异分离目的基因程序
利用两组细胞mRNA经过DDRT-PCR
后，分析比较cDNA种类的差异，分别回收 cDNA测序隆新基因。
DNA文库的构建和目的基因
（二）基因组DNA的不完全酶切
1、根据实验需要选择合适的限制性内切酶 2、分离目的酶切片段大小的确定
a) 克隆单个基因：< 10 kb b) 克隆基因族：< 20kb 3、DNA不完全酶切条件的确定 a) 确定限制酶用量，改变酶切时间 b) 固定酶切时间，改变限制酶的用量
（三）酶切• 外源基因：插入到载体内的那个特定 的片段基因。
• 目的基因：那些已被或者准备要分离、 改造、扩增或表达的特定基因或DNA片 段。
对于高等真核生物而言，基因组DNA 十分庞大,基因可达数万个，且基因组成 结构复杂，除编码序列，还有非编码序 列及调控序列，基因间还存在大量的间 隔序列和重复序列，因此，单个目的基 因在整个基因组中所占的比例极其微小， 除少数例外，绝大多数基因难以直接分 ，其复杂程度是蛋白质和 mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列。 采用电泳 分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这是从染 色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。
• 2) DNA片段或cDNA片段与经特殊处理 的载体连接形成重组DNA；
• 3)重组DNA转化宿主细胞或体外包装后 侵染受体菌；
• 4)阳性重组菌落或噬菌斑的选择。
目的基因）第一节 基因组DNA的构建
一、基因组DNA的类型 根据所选用的载体可以分为： 质粒序
①载体DNA的制备； ②高纯度大相对分子质量基因组DNA的
提取和大片段的制备； ③高纯度大相对分子质量基因组DNA的2)cDNA (cDNA library) ：
• 是指将某种生物体基因组转录的全部 mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与 克隆载体重组，储存于某种受体ntary DNA，互补 DNA)：是由生物的某一特定器官或特定 发育时期细胞内的mRNA经体外反转录 后形成A的保存1) 影印膜滤保存法
如何通过构建基因文库来获取目的基因
如何通过构建基因⽂库来获取⽬的基因⼀、概念主要有两种基因⽂库：基因组⽂库和cDNA⽂库。
基因组⽂库：⼀个⽣物体的基因组DNA⽤限制性核酸内切酶部分酶切后，将酶切⽚段插⼊到载体DNA分⼦中，所有这些插⼊了基因组DNA⽚段的载体分⼦的集合体，将包含这个⽣物体的整个基因组，也就是构成了这个⽣物体的基因⽂库。
cDNA⽂库：是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的cDNA⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合体。
⼆、构建基因⽂库的主要程序1、DNA提取及⽚段化或是cDNA的合成⼀个⽣物体的基因组DNA⽤限制性核酸内切酶部分酶切或全部mRNA经反转录形成的cDNA⽚段。
2、载体的选择及制备这些载体可以分为两类，⼀类是基于噬菌体改建的，利⽤了噬菌体的包装效率⾼和杂交筛选背景低的优点；另⼀类经改造的质粒载体或⼈⼯染⾊体，其主要优点在于可容纳超过100kb以上的外源⽚段。
3、DNA⽚段或cDNA与载体连接⽤重组DNA技术将某种⽣物细胞的DNA的所有⽚断随机地连接到基因载体上。
4、重组体转化宿主细胞⽤质粒作为载体的重组DNA分⼦可以通过转化引进细胞。
⽤λ噬菌体的DNA作载体的重组分⼦直接经转染引⼊细胞的效率较低；⼀般需先⾏离体包装，即把重组DNA分⼦包在噬菌体外壳中，再通过噬菌体感染⽽把重组DNA分⼦引⼊敏感细菌细胞中。
三、鉴定和转化细胞的筛选当获得了含重组体的宿主细胞时，即完成了基因的克隆。
然⽽，它只是分离基因的第⼀步，基因克隆后还要对克隆的基因进⾏分离。
因此，还必须对其进⾏必要的检测与分析，如序列测定，体外转录及翻译、功能互补实验等。
通过这些实验确定基因结构及功能，此时才能算分离到了⽬的基因。
所以，基因克隆、克隆基因分离、分离基因鉴定是利⽤基因⽂库技术分离⽬的基因的主要内容。
从基因⽂库中筛选某⼀克隆的基因常⽤办法是分⼦杂交。
⾸先把属于⼀个⽂库的细菌或噬菌体以较低密度接种在培养⽫上以取得相当分散的菌落或噬菌斑，然后⽤硝酸纤维滤膜吸印，使培养⽫和滤膜的相对应的位置上具有相同的克隆。
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1.2 鸟枪法操作的改进
1.3 鸟枪法克隆目的基因的局限性
4
1.1 鸟枪法克隆目的基因的基本战略
NaOH 降解mRNA 3’
OH
KTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ S1 TTTTTTTTTTTTTT
AAAAAAAAAAAAAA
13
2.1.2
cDNA第二链的合成
置换合成法：避免了cDNA双链末端的缺损
G
5‘ppp’5
G
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp RNaesH DNApol I dNTPs AAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5’
混合退火
T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体
33
4.1 化学合成法的基本战略
4.1.1 全基因合成
补钉延长法：
根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单 链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段
混合退火 Klenow酶聚合 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体
筛选含有目的基因的目的重组子
菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）
6
1.2 鸟枪法操作的改进
使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA
使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。
如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA， 然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高 重组子中目的重组子的出现频率.
但是，前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，
一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类： 另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。
随机克隆供体细胞的全基因组DNA 片段，然后通过快速有效的筛选程序从
众多克隆中分离出含有目的基因的目的
重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适 用于原核细菌目的基因的克隆分离
5
1.1 鸟枪法克隆目的基因的基本战略
染色体DNA的切断
超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控
基因工程
复旦大学 刘明秋
1第五章 目的基因的克隆与基因的构建基因工程或DNA重组技术三大用途: 1.或确定基因的表达调控机制和生物学功能； 2.或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞）；
3.或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改
良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。
任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能
22
2.2.3 差异分离程序
多瘤病毒感染的FR3T3细胞 正常的FR3T3细胞
提取mRNA
提取mRNA 总mRNA 合成cDNA
上柱
总mRNA
共价交联
cDNA 合成第二链
病毒诱导表达的
基因cDNA克隆
双链cDNA 克隆 单链cDNA 原位杂交
23
2.3 cDNA法克隆目的基因的局限性
Mullis在1993年获得了诺贝尔化学奖。在一项实用性的发明做
出后仅仅8年就荣质诺贝尔奖，这在科学史上是绝无仅有的，这 也从另一个侧面说明了PCR技术的重大价值。
PCR技术自问世以来已在生物学、医学、考古学、人类学等许
多领域内获得了广泛的应用，可以说PCR技术给整个分子生物 学领域带来了一场变革。同样PCR技术也成为在DNA重组技术 领域获得外源基因的一个有效手段，PCR技术就是在体外通过 酶促反应成百万倍地扩增一段目的基因。
20
2.2
2.2.2
cDNA法分离目的基因的基本程序
特异分离程序
提取细胞总 mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标
mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆 特异分离程序较适用于 mRNA 丰度极高的目的基因克隆 如血红蛋白基因等
21
cDNA法分离目的基因的基本程序
2.2.3 差异分离程序
利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA 所对应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因 例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因 是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。
29
3.3.1 锚定PCR(anchored PCR)
锚定PCR特别适合于扩增那 些只知道一端序列的目的 DNA。 例如，对于一端序列已知、 一端序列未知的DNA片段， 可以通过 DNA 末端转移酶给 未知序列的那一端加上一 段多聚 dG 的尾巴，然后分 别用多聚 dC 和已知的序列 作为引物进行 PCR 扩增 ( 图 2—34)。
G
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp
cDNA第一链
12
5’
2.1.2
cDNA第二链的合成
自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺失
G
5‘ppp’5
G
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 煮沸 TTTTTTTTTTTTTTp 5’
25
3.1 PCR法定向扩增目的基因的基本原理
使用PCR法克隆目的基因的前提条件是： 已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学 合成聚合反应必需的双引物
它要求反应体系具有以下条件： ①要有与被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的 DNA 引物 ( 约 20 个碱 基左右)； ②具有热稳定性的酶如Taq DNA聚合酶； ③dNTP; ④ 作为模板的目的DNA序列。 一般PCR反应可扩增出100—5000 bp的目的基因。
1 化学合成法的基本战略
4.2 化学合成的单元操作
4.3 DNA化学合成的用途
32
4.1 化学合成法的基本战略
4.1.1 全基因合成
化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略： 小片段粘接法： 根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段
TTTTTp 5’
TTTTTp 5’ Klenow dNTPs TTTTTp 5’ AAAAAOH 3’
15
2.1 cDNA法克隆目的基因的基本战略
2.1.3 双链cDNA的克隆
双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：
平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收
平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组 分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段 加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收
‘ 5 5
27
‘
3.2 PCR克隆目的基因的基本程序
由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个 非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为Taq DNA聚 合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可
以采取TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase，末端脱氧核苷
7
1.2 鸟枪法操作的改进
在连接前将DNA片段进行分级分离
例如，已知某目的基因位于1.8 kb的 SalI片段中，将染色体DNA用SalI切 开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下 相当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝 胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然 后与载体进行拼接
8
2.0 kb 1.6 kb
酸转移酶)末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的T载体克 隆
5’ A
5’ T T7 lacZ MCS ori Apr
A PCR扩增产物 5’
T T 载体 5’
28
3.3 PCR方法的改进
在获得目的基因时，除了要用到普通的 PCR 方法外， 还要用到一些改进的PCR方法，现分别介绍如下：
1.8 kb
1.2 鸟枪法操作的改进
凝胶DNA片段回收技术
冻融法
滤纸法
吸附法
低融点凝胶法 溶解法
9
1.3 鸟枪法克隆目的基因的局限性
工作量较大，需要了解目的基因的背景知识 不能获得的最小长度的目的基因
不能除去真核生物目的基因的内含子结构
1 cDNA法克隆目的基因的基本战略 2.2 cDNA法分离目的基因的基本程序 2.3 cDNA法克隆目的基因的局限性
5’
5’
AAAAAAAAAAAAAAp
5’
TTTTTTTTTTTTTTOH 3’ T4-DNA ligase 5’ 3’ AAAAAAAAAAAAAA 5’ TTTTTTTTTTTTTT 3’
14
2.1.2
cDNA第二链的合成
引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列
G
5‘ppp’5
G
30
3.3.2反向PCR(inverse PCR)
反向 PCR 特别适用于扩增已知序 列的两端的未知序列。 具体方法：选择一个在已知序 列中没有，而在其两侧都存在 的限制性内切酶位点，用相应 的限制性内切酶酶解后，将酶 切的片段在连接酶的作用下环 化，使得已知序列位于环状分 子上。根据已知序列的两端序 列设计两个引物，以环状分子 为模板，就可以扩增出已知序 列两侧的未知序列(图2—35)。
部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整
与载体连接
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载 体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载
转化受体细胞
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为 受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达 的受体细胞.
就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促 法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低， 但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收 率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有