目的基因的克隆与分离鉴定(2)
第讲 目的基因的克隆与分离
第讲目的基因的克隆与分离引言目的基因是指在一项研究中，具有研究意义或实际应用价值的基因。
目的基因克隆和分离是分子生物学研究的重要环节，它们为后续研究提供了基础和保障。
本文将介绍目的基因克隆和分离的方法和技术。
一、目的基因的克隆1. PCR扩增PCR是聚合酶链反应的简称，是一种利用DNA聚合酶酶作用、在体外增加DNA序列数量的技术。
PCR扩增可以在保证目的基因序列一致性的前提下，扩增出足够的DNA量，用于后续实验。
PCR扩增的步骤一般包括模板DNA的选择、引物的设计和勘误、PCR反应体系的搭建等。
2. 基因文库筛选基因文库指的是将一个或多个组织的基因在体外克隆并构建而成的基因库。
基因文库筛选是一种在文库中选取目的基因的方法。
其中最常用的是基于杆菌的蛋白表达文库、细胞质体DNA文库和DNA合成文库。
基因文库筛选的步骤一般包括构建文库、传统筛选和高通量筛选。
3. 限制性内切酶切割限制性内切酶切割是指利用特定的酶切位点将DNA分割成碎片，然后选取目标DNA寻找需要的限制酶切片段的方法。
这种方法可以快速而准确地寻找目的基因，并进行克隆。
限制酶切割的步骤一般包括DNA提取、DNA质量检测、选取限制酶和体外反应等。
二、目的基因的分离1. 分子杂交分子杂交是指在体外或体内使某一脱氧核糖核酸（DNA）与另一种DNA或核酸杂交而形成方法的过程。
它的作用是寻找与目的基因DNA互补的DNA序列，并在该序列中分离目的基因。
分子杂交的步骤主要包括细胞培养和DNA序列的寻找和筛选等。
2. 化学合成化学合成是指通过化学方法合成目的基因的方法。
这种方法可以直接合成目的基因，只要知道目的基因的序列就可以了，不需要进行PCR扩增、克隆等操作。
化学合成的步骤主要包括碱基合成、链延伸、中间产物合成和连接、滤液等。
3. 通量基因测序通量基因测序也称为高通量测序，是一种快速且准确测定DNA或RNA序列的方法。
通过对目的基因进行测序，可以快速分离目的基因。
生物技术制药课后思考题
第一章：绪论思考题1.什么是生物技术？生物技术所包含的内容及定义。
答：1）生物技术又称生物工程，指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术。
2）包括基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程、抗体工程、糖链工程、海洋生物技术及生物转化等。
（具体定义见P1）。
2.生物技术药物的概念及分类。
答：1）指采用DNA重组技术或其他生物技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病的药物，主要是重组蛋白或核酸类药物。
2）a.按照用途：预防、诊断、治疗；b.按作用类型：细胞因子类、激素类、酶类、疫苗、单克隆抗体类、反义核酸、RNA干扰类、基因治疗药物；c.按照生化特性：多肽类、蛋白质类、核酸类、聚乙二醇化多肽或蛋白质。
3.生物技术药物在理化性质、药理学与作用、生产制备和质量控制方面的特性。
答：1）理化性质（从药物多是蛋白质或核酸出发）：a.相对分子质量大；b.结构复杂；c.稳定性差；2）药理学作用：a.活性与作用机制明确；b.作用针对性强；c.毒性低；d.体内半衰期短；e.有种属特异性；f.可产生免疫原性；3）生产制备特性：a.药物分子在原料中含量低；b.原料中常存在降解目标产物的杂质；c.制备工艺条件温和；d.分离纯化困难；e.产品易受有害物质污染；4）质量控制特性：a.质量标准内容的特殊性；b.制造项下的特殊规定；c.检定项下的特殊规定。
4.生物技术制药的概念和主要研究内容与任务。
答：1）指利用基因工程、细胞工程等生物技术的原理和方法，来研究、开发和生产预防、治疗和诊断疾病的药物的一门科学。
2）主要研究内容与任务：a.生物制药技术的研究、开发与应用；b.利用生物技术研究、开发和生产药物。
第二章：基因工程制药思考题1.简述基因工程制药的基本原理和基本流程。
答：1）利用重组DNA技术将外源基因导入到宿主菌或宿主细胞进行大规模培养和诱导表达以获取蛋白质药物的过程称为基因工程制药。
基因克隆具体实验报告
一、实验目的1. 学习基因克隆的基本原理和方法。
2. 掌握PCR扩增、酶切、连接等基因克隆实验技术。
3. 验证目的基因的克隆是否成功。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段从基因组中分离出来，并插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。
实验过程中，主要涉及PCR扩增、酶切、连接、转化、筛选等步骤。
三、实验材料1. 模板DNA：含有目的基因的基因组DNA。
2. 引物：根据目的基因序列设计的上下游引物。
3. Taq DNA聚合酶：用于PCR扩增。
4. 酶切体系：限制性内切酶、缓冲液、连接酶等。
5. 连接载体：线性化载体。
6. 转化宿主菌：大肠杆菌DH5α。
7. 筛选培养基：含抗生素的LB培养基。
8. PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2等。
四、实验方法1. PCR扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计上下游引物，长度约为20-30bp，分别位于目的基因的上下游。
（2）PCR反应体系：取模板DNA 1μl，上下游引物各1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl2 2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加ddH2O至50μl。
（3）PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后延伸10min。
2. 酶切连接（1）酶切：取PCR产物5μl，加限制性内切酶（如EcoRI）1μl，10×酶切缓冲液2μl，ddH2O 2μl，混匀后置于37℃水浴酶切2h。
（2）连接：取线性化载体5μl，酶切产物5μl，10×连接缓冲液2μl，T4 DNA 连接酶1μl，混匀后置于16℃连接过夜。
3. 转化（1）制备感受态细胞：将大肠杆菌DH5α在LB培养基中培养至对数生长期，按照1:100的比例加入CaCl2，混匀后冰浴30min。
（2）热激转化：将连接产物加入感受态细胞中，混匀后置于42℃水浴45s，迅速转移至冰浴中。
基因克隆与表达及功能鉴定研究
基因克隆与表达及功能鉴定研究在现代生命科学领域中，基因克隆与表达以及功能鉴定是非常重要的研究方向之一，它涉及到许多生物医学、农业、工业和环境等领域的研究和实际应用。
本文将从基因克隆与表达的基本原理、方法、技术和应用，以及功能鉴定的原理、方法、技术和应用等方面进行探讨。
一、基因克隆与表达基因克隆是指通过分子生物学技术，将含有某个或某些特定基因的DNA序列从一个大的DNA分子（如染色体）中分离出来，然后插入到特定的载体DNA中，形成重组DNA分子的过程。
基因表达是指基因信息的转录和翻译过程，将基因的DNA序列转录成RNA分子，然后翻译成蛋白质分子的过程。
基因表达是生物体形成和发展的基础，也是生命活动的重要表现形式。
1. 基因克隆原理基因克隆的主要原理是利用限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶以及质粒或噬菌体等DNA载体的特性，将特定DNA序列插入到载体DNA中，形成重组DNA分子。
限制酶是一种能够识别、切割DNA分子特定序列的酶，其识别序列具有一定的特异性。
DNA连接酶是一种能够连接两个DNA分子的酶，常用的有T4 DNA连接酶和快速连接酶等。
DNA聚合酶是一种能够在DNA模板上合成互补链的酶，其作用是在重组DNA分子中完成互补链的合成。
2. 基因克隆方法基因克隆的主要方法有限制性片段长度多态性（RFLP）分析、聚合酶链式反应（PCR）克隆、原核表达克隆和真核表达克隆等。
RFLP分析是一种利用限制酶对DNA序列进行切割，并根据不同的RFLP位点进行区分的方法，其主要应用于基因型鉴定和进化研究等领域。
PCR克隆是一种利用PCR技术扩增目标基因或DNA片段，并将扩增产物克隆到载体DNA中的方法，其主要应用于基因检测、DNA测序和分子克隆等领域。
原核表达克隆是一种利用质粒或噬菌体等原核生物作为DNA载体，将外源基因转入细菌或古细菌等原核生物细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
真核表达克隆是一种利用真核生物（如哺乳动物、鸟类、昆虫、线虫等）作为DNA载体，将外源基因转入具有表达能力的真核细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
高中生物4章基因工程2节基因工程的操作程序2课时目的基因的导入和检测
第2课时目的基因的导入和检测[目标导读] 1.结合教材P77～81图文，阐明目的基因的导入的四种方法。
2.分析教材P81～83内容，掌握目的基因的检测与表达产物的测定。
[重难点击] 1.目的基因的导入方法。
2.目的基因的检测与表达产物测定的原理方法。
方式一通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取和基因表达载体的构建。
在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。
方式二目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。
这是基因工程的第四步工作。
以上步骤完成后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。
因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。
检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。
重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。
一、目的基因的导入1．花粉管通道法(如图)(1)概念：是指外源基因利用植物受精后花粉萌发形成的花粉管通道进入受体细胞，借助天然的种胚系统形成含有目的基因的种胚。
常用的两种方法有柱头滴加法和花粉粒携带法。
(2)实验：利用花粉管通道法将目的基因导入棉花的实验操作程序①原理：授粉后使外源DNA能沿着花粉管通道渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵细胞、合子或早期胚胎细胞。
②操作过程a．提取含有目的基因的总DNA或者质粒DNA，配成质量分数为0.01%的溶液。
b．用棉线捆住将要在第二天开花的花朵，不让花朵自动开放。
c．第二天清晨给花朵进行人工授粉，授粉后套袋，作好标记。
基因的克隆与表达课件
----TAC -----TTG GAC CTT AAG GAT CCA---
DNA序列
AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGT TTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA
基因的克隆与表达课件
位相载体----含有3种读码框的系列载体
基因的克隆与表达课件
优点： • 表达效率高 • 产物稳定 • 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
基因的克隆与表达课件
基因克 隆 Gene Cloning
基因的克隆与表达课件
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
基因的克隆与表达课件
一、概述
• 确定了遗传信息的携带者，即基因的盆 子载体是DNA而不是蛋白质
基因的克隆与表达课件
（二）体外重组 连接体系的建立： • 温度：粘末端连接：12-18℃
平末端连接：室温（低于30℃) • DNA量：载体分子数/目的基因分子数
=1：1-3 • 酶量：平端连接时需加大酶量
基因的克隆与表达课件
（三）转化—Cacl2法、电击法
（四）重组子的筛选及鉴定
1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）
基因的克隆与表达课件
二．原核生物基因结构和表达特点
基因的克隆与表达课件
• 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
• 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
基因的克隆与表达课件
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
实验动物遗传育种学复习题
实验动物遗传育种学1. 实验用动物（Experimental Animal）: 又称广义实验动物。
泛指用于科学实验的各种动物，包括经过人们长期家养驯化，按科学要求定向培育的动物。
2.实验动物（Laboratory Animal）: 又称狭义实验动物。
指经人工培育和人工改造，对其携带的微生物和遗传、营养、环境实行控制，来源清楚，遗传背景明确，用于科学研究、教学、生产、检定以及其他科学实验的动物。
3. 无菌动物（Germ Free Animals）：动物机体内外不带有任何用现有方法可检测出微生物或寄生虫的动物。
4. 无特定病原体动物（Specific Pathogen-Free Animal, SPF）：机体内无特定的微生物和寄生虫存在的动物，或在清洁动物的基础上，不带对实验有干扰的微生物。
5. 清洁动物（Clean Animals,CA）：无人畜共患病和主要传染性疾病的病原体和体外寄生虫的动物。
6. 普通动物（Conventional Animals,CV）：无人畜共患病病原体和体外寄生虫的动物7. 种(species)：是生物学分类的最基本单位。
在实验动物学中，种是指有繁殖后代能力的同一种类的动物。
8.品种(stock) :育种学上的概念。
有相同或相似的生物学特性构成的群体叫品种。
9. 品系(strain) ：在实验动物学中把基因高度纯合的动物称作品系动物。
10. 近交系的定义：近交系实验动物在兄妹交配20代以上,又可以追溯到一对共同亲代的，有时也可以亲子交配,并需与年轻一方的亲代交配，而形成的品系，一般称之为近交系。
目前，主要是在大鼠和小鼠中育成近交系的品系。
11. 基因纯合性：在一个近交系内的所有动物的基因位点都应当是纯合子，在本品系内任何个体交配的后代也应当是纯合子，即基因型一致，遗传特性相同。
从理论上说，这些动物是不应有暗藏的隐性基因的，用近交系动物做实验时，不会因为隐性基因的暴露而影响实验结果的一致性。
基因工程操作技术及原理之基因克隆
基因工程操作技术及原理之基因克隆1．克隆已知序列的基因根据已知基因的序列设计引物(primer)，利用PCR方法克隆基因。
即使不同种属之间，基因编码区序列的同源性高于非编码区的序列。
在某种植物的同源基因被克隆的条件下，可先构建eDNA文库或基因组文库，然后以该基因(或部分序列)为探针来筛选目的基因的克隆。
2．功能克隆根据基因的产物蛋白质克隆基因，利用这种方法分离基因，首先应根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有关的蛋白质，再分离纯化这一蛋白并制备相应抗体；或测定其氨基酸序列，推测可能的mRNA序列，根据mRNA序列设计相应的核苷酸探针或寡核苷酸引物。
利用抗体或核苷酸探针筛选基因组DNA文库或cDNA文库，也可利用寡核苷酸引物对核D NA或cDNA进行PCR扩增。
通过对阳性克隆或PCR扩增产物的序列分析鉴定分离基因。
3．作图克隆作图克隆又称图位克隆，是随着分子标记图谱的建立而发展起来的基因克隆技术。
根据连锁图谱定位的基因来克隆目的基因。
作图克隆是从连锁标记出发，通过大片段克隆(BA C库或YAC库)的染色体步移(chromommewalking)到达靶基因。
4．表型差异克隆利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆基因，对于有些植物的性状，既不了解它们的基因产物也没有对它们进行基因定位，但已知它们的表型存在差异，利用这些差异，用下述方法也可克隆植物基因。
(1)消减杂交法即消减杂交法(subtractive hybridization)是通过鉴定两个mRNA间差异而分离基因的方法。
其基本方法是：提取两种差异细胞或组织的DNA后，反转录合成c DNA，并用限制性内切核酸酶切割成小片段。
将其中一个样品的酶切产物分成两份，分别连接不同的含有特定酶切位点的40bp左右的寡核苷酸接头，作为检测者(tester)。
用另外一个样品过量的酶切产物作为驱动者(driver)与带有不同接头的tester进行第一次杂交。
分离目的基因实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子生物学技术，学习并掌握目的基因的分离方法，包括基因组DNA提取、目的基因的克隆、扩增和鉴定等步骤。
通过实验，使学生熟悉实验原理、操作步骤和注意事项，提高学生的动手能力和实验技能。
二、实验原理目的基因分离是指从生物基因组中提取出特定的基因片段，并进行克隆、扩增和鉴定。
实验步骤主要包括以下几部分：1. 基因组DNA提取：利用各种方法从生物组织中提取出基因组DNA。
2. 目的基因的克隆：利用PCR技术扩增目的基因，并克隆到载体上。
3. 目的基因的鉴定：通过限制性内切酶酶切、DNA测序等方法对克隆的目的基因进行鉴定。
4. 目的基因的表达：将目的基因导入宿主细胞，进行表达和功能验证。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：大肠杆菌、质粒载体、目的基因DNA模板等。
2. 试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA测序试剂盒等。
四、实验步骤1. 基因组DNA提取（1）取适量生物组织，按照DNA提取试剂盒说明书进行操作。
（2）提取的基因组DNA用琼脂糖凝胶电泳检测，确保DNA提取质量。
2. 目的基因的克隆（1）设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因。
（2）按照PCR试剂盒说明书进行PCR扩增，获得目的基因。
（3）将PCR产物与载体连接，转化大肠杆菌。
（4）通过蓝白斑筛选，获得阳性克隆。
3. 目的基因的鉴定（1）对阳性克隆进行酶切鉴定，验证目的基因是否成功克隆。
（2）对阳性克隆进行DNA测序，确定目的基因序列。
4. 目的基因的表达（1）将目的基因克隆到表达载体上，构建表达系统。
（2）将表达载体导入宿主细胞，进行目的基因的表达。
（3）检测目的基因的表达产物，验证目的基因的功能。
五、实验结果与分析1. 基因组DNA提取：提取的基因组DNA在琼脂糖凝胶电泳中呈现清晰的主带，说明DNA提取成功。
2. 目的基因的克隆：通过PCR扩增，获得目的基因片段，大小与预期相符。
分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达
分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达第一节基因操作概述............................................................................. 错误!未定义书签。
一、聚合酶链式反应(PCR) ............................................................. 错误!未定义书签。
二、质粒概述................................................................................... 错误!未定义书签。
三、凝胶电泳................................................................................... 错误!未定义书签。
四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化....................................... 错误!未定义书签。
五、重组质粒的连接....................................................................... 错误!未定义书签。
六、限制性内切酶消化................................................................... 错误!未定义书签。
七、SDS-PAGE蛋白质电泳........................................................... 错误!未定义书签。
第二节材料、设备及试剂..................................................................... 错误!未定义书签。
目的基因的分离方法
目的基因的分离方法摘要：介绍了基因工程中分离所需目的基因的主要策略和最新进展。
总结了基因分离中的各种方法，主要有：直接酶切分离法，化学合成法，序列克隆法，功能克隆法，作图克隆法，表型差异克隆法，计算机辅助分离法等，并对其特点和适用范围进行了简单评述。
关键词：目的基因分离方法基因的分离方法都是根据基因的基本特性创建的，包括基因核苷酸顺序的特异性、基因在染色体上的位置特异性、基因编码的mRNA的特性和基因的差异表达等。
每种方法运用这些特性的一种或者多种，产生了各种各样的分离方法。
这些方法又相互之间组合，从而产生了可以在不同条件下有效分离目的基因的分离策略。
1 直接提取纯化此法只适用于分离多拷贝基因，而不适用于单拷贝基因。
并且所得到的目的基因纯度较低。
但是操作简单，对设备的依赖性很低，即使在很简陋的实验室里也能完成操作。
2 在体外用化学合成或酶促合成的方法取得目的基因通过对表达产物的分析和测序，可以预测目的基因的核苷酸序列，然后按照DNA碱基序列顺序，先合成DNA短片段，再通过DNA连接酶作用，将这些短片段依次连接成一个完整的基因。
人工合成基因的最大优点是能够根据需要合成突变基因，而且，所合成的是单基因，无其它有害基因，比较完整；缺点是只适用于较短的基因，操作比较难，费用也比较大。
目前这种方法主要用于PCR引物的合成，一些突变基因的合成等。
3 序列克隆——根据已知基因的序列克隆基因3．1 PCR扩增克隆当已知目的基因的序列时，通常采用PCR的方法来克隆基因。
基本原理和方法是：利用已知目的基因的序列，设计并合成一对寡核苷酸引物，提取所要从中分离基因的染色体DNA(RNA需要在逆转录酶的作用下合成cDNA的第1条链)，然后通过PCR反应来扩增特定的DNA片段。
扩增的片段经过纯化后，连接到合适的载体上，用酶切分析和序列分析测定所得到的重组子，并与已知基因的序列进行比较，来进行鉴定。
鉴定之后的DNA可以用于基因的表达。
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告----绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和纯化一、实验背景绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。
GFP由3个外显子组成，长2.6kb；GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为27.0 kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成。
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
实验使用的EGFP蛋白取自原核-真核穿梭质粒pEGFP-NB3B的蛋白质编码序列。
此质粒原本被设计于在原核系统中进行扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进行表达。
本质粒主要包括位于PCMV真核启动子与SV40 真核多聚腺苷酸尾部之间的EGFP编码序列与位于EGFP上游的多克隆位点；一个由SV40 早期启动子启动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上游的细菌启动子可启动在原核系统中的复制与卡那抗性。
在EGFP编码序列上下游，存在特异的BamH I及Not I限制性内切酶位点，可切下整段EGFP编码序列。
表达EGFP 蛋白使用的pET-28 原核载体包含有在多克隆位点两侧的His-tag polyHis 编码序列；用于表达蛋白的T7 启动子，T7 转录起始物以及T7 终止子；选择性筛选使用的lacI 编码序列及卡那霉素抗性序列，pBR322 启动子，以及为产生单链DNA 产物的f1 启动子。
分子生物学实验基础知识
分子生物学实验基础知识分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。
其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。
转化（trans formation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。
基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。
使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。
外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。
利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。
一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。
一、基因工程的常用工具（一）载体载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。
载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。
载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。
质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。
质粒有严紧型和松弛型之分。
严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。
而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。
第6章目的基因的分离克隆(植物基因工程)课件
12
13
14(2) 如何从cDNA中找到所需要的基因？15转录水平上的基因克隆方法
l 差别杂交筛选 l 扣除杂交 l 代表性差别分析 l 差异显示 l cDNA阵列杂交 l 基因表达系列分析 l 抑制差减杂交
筛选目的基因(核酸探针法、免疫结合法)因库应当能包括全部的基因组序 列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则总 克隆数目少，常选择能接受较大片段的载体。 令检测是否包括一个完整的基因组序列的公式：
令例:人类基因组3.0x106kb, 以λEMBL作载体， 插入片段的平均长度为17kb ，p为99%时, 基因 库应有8.1x105 个 重组噬菌体。
21
22
n基于EST信息的基因克隆
EST
23
由杨树EST库获得基因序列
PCNA
24
克隆的核酸酶
25
26
2、基因组水平上的克隆
将ry) ：将某种生物的基因组DNA切割成 一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进 行克隆。这些存在于所有重组
➢差别杂交筛选
含有表达 目的基因
不含有表 达目的基因cDNA 铺平板转膜 转膜提取分离 mRNA
cDNA 探针
提取分离 mRNA
cDNA 探针
比较 分析
用对照样品cDNA作探 针杂交的X光片中没有 而在检测样品cDNA作 探针杂交的X光片中有 的印斑，可对照X光片 从原平板挑出菌落进行 鉴定是否含有目的基因
31
菌落杂交技术寻找目标DNA克隆
32
文 库 的 抗 体 筛 选
33
(2) T-DNA标签克隆基因
目的基因克隆
一、目的基因克隆的策略有哪些？其理论依据什么？如何根据具体条件，如目的性状的特点，已知控制目的性状的基因的信息合理选择基因克隆的方法？1、主要有以下几个克隆的策略：（1）PCR法分离目的基因：从蛋白质的一级序列分析得到核酸序列的相关信息，设计简并引物，通过对mRNA进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板，然后将目的基因通过PCR方法扩增，或者直接从基因组DNA扩增的方法。
（2）核酸杂交的方法：通过对蛋白质的氨基酸序列分析，设计简并引物，通过核酸杂交的方法从基因文库中筛选得到目的基因。
（3）免疫学筛选法分离目的基因：利用免疫学原理，通过目的蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的蛋白基因。
2、若控制该性状的目的蛋白质不容易分离纯化，这PCR方法比较适宜，若蛋白质分离纯化容易，且有现成的基因文库，则后两种方法较为简单。
二、蛋白组学方法克隆目的基因的理论依据是什么？有哪些技术环节？要用到哪些技术？1、理论依据：以分离纯化的目的蛋白为研究起点，通过对目的蛋白的一级结构分析，获得起码的氨基酸序列信息后，反推可能的DNA序列，然后设计引物，从cDNA中将目的基因扩增出来，或者设计核酸探针，通过杂交技术将目的基因从基因文库中筛选出来。
或通过抗体抗原免疫反应从表达文库中将该基因分离出来。
2、技术环节是确定并制备出高纯度的蛋白质。
3、所需要的实验技术有：蛋白质的双向电泳技术，由第一向的等电聚焦电泳和第二向的SDS-PAGE电泳组成；蛋白质氨基酸序列分析。
三、基因组学方法克隆基因的策略有哪些？各有什么特点？如何选择恰当的基因组学方法克隆目的基因？1、基因文库筛选方法通过对基因文库的筛选将目的基因分离出来，一般有两种方法：核酸杂交法，原理是分子杂交；PCR筛选法，通过ＰＣＲ方法将目的基因分离出来，对于以混合形式保存的文库，先将文库分成几份，每份为一个“反应池”进行PCR反应，待选出阳性池后，将阳性池的混合克隆稀释，然后等量分置96孔板中，进行横向池及纵向池的ＰＣＲ反应，然后将阳性菌落群进行稀释，重复上述工作，直到筛出阳性单克隆。
PCR技术克隆目的基因全过程
PCR技术克隆目的基因全过程PCR（聚合酶链式反应）是一种体外的DNA合成技术，可以通过放大目的基因序列来克隆和检测DNA。
以下是PCR技术克隆目的基因全过程的详细解释。
1.设计引物：引物是用于扩增目的基因的短DNA片段。
引物分为前向引物和反向引物，其序列分别与目的基因的5’和3’末端相互匹配。
引物的设计应该尽量避免互相形成二聚体或发生引物间杂交。
一般情况下，前向引物和反向引物的长度约为18-30个碱基。
2.DNA模板的准备：DNA模板是PCR反应中的起始材料，可以是从细胞中提取的基因组DNA、cDNA或合成的DNA片段等。
DNA模板需要经过特定的处理步骤，如酶切或热变性，以解开DNA双链结构，使得引物能够与目的基因序列起始材料结合。
3.PCR反应体系的制备：PCR反应体系通常包含DNA模板、引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）、聚合酶、缓冲液和稀释的镁离子。
这些成分需要以特定的量和浓度配制在一起。
在反应体系中加入适量的聚合酶，可以保证PCR反应能够进行。
4.PCR扩增条件设定：PCR反应需要经历一系列的温度变化，这些温度的设定旨在创造一个适宜扩增引物的环境。
PCR反应通常包含三个主要的步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤中，DNA模板的双链结构被加热到95°C，使其变性为两条单链DNA。
退火步骤中，反应体系温度降至碱基互补序列的温度，使引物能够与DNA模板结合。
延伸步骤中，反应体系温度升至适合聚合酶的工作温度，引物被复制形成两条新的双链DNA。
这三个步骤的温度和时间根据目的基因的特性和引物的设计来设定。
5.PCR扩增循环：PCR反应通常包含20-40个循环，每个循环包括变性、退火和延伸三个步骤。
每个循环都会使目的DNA序列扩增一倍。
PCR反应的循环数取决于目的基因的起始材料的丰度和所需扩增的DNA数量。
6.PCR产物检测：PCR扩增产物可以通过凝胶电泳等方法进行检测。
凝胶电泳可以将PCR扩增产物按照大小分离。
克隆基因提取实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在学习并掌握克隆基因提取的基本原理和操作步骤，通过实验操作，提取目的基因，为后续的基因克隆、表达和功能研究奠定基础。
二、实验原理克隆基因提取主要利用DNA提取技术，通过破碎细胞、释放DNA、去除杂质等步骤，得到高纯度的DNA。
本实验采用碱裂解法提取目的基因，该方法具有操作简单、提取效率高、DNA纯度好等优点。
三、实验材料1. 实验试剂：NaCl溶液、Tris-HCl缓冲液、无水乙醇、异丙醇、二苯胺染液、DNA提取试剂盒等。
2. 实验仪器：高速离心机、电子天平、移液器、PCR仪、凝胶成像系统等。
3. 实验样品：目的基因载体（含目的基因）、细菌菌液等。
四、实验步骤1. 细菌培养：将目的基因载体转化至大肠杆菌，挑取单克隆菌落，接种于含有适量抗生素的LB液体培养基中，37℃、200 r/min培养过夜。
2. 酵母提取物制备：将过夜培养的菌液按1:100比例稀释，加入酵母提取物、葡萄糖等，37℃、200 r/min培养至对数生长期。
3. 细菌裂解：将培养好的菌液按照1:10比例加入裂解液，55℃水浴30 min，期间每隔5 min振荡1次，使菌体充分裂解。
4. DNA沉淀：将裂解液按照1:2比例加入等体积的异丙醇，混匀，4℃、12 000r/min离心10 min，弃上清液。
5. DNA洗涤：将沉淀用70%乙醇洗涤1次，4℃、7 500 r/min离心5 min，弃上清液。
6. DNA溶解：将沉淀用适量TE缓冲液溶解，-20℃保存。
7. DNA纯化：按照DNA提取试剂盒说明书进行操作，得到高纯度的目的基因。
8. 验证：将提取的目的基因进行PCR扩增，观察扩增结果，确认目的基因提取成功。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：通过PCR扩增，成功获得目的基因，扩增产物大小与预期相符。
2. DNA纯度：利用NanoDrop2000检测提取的目的基因，A260/A280比值在1.8-2.0之间，表明DNA纯度较高。
基因克隆实验流程
基因克隆实验流程基因克隆技术，又称重组 DNA 技术，是将目的基因与具有自主复制能力的载体DNA 进行体外重组，获得新的重组DNA后导入受体细胞中表达相应蛋白，以研究蛋白结构与功能及其与其他分子的相互作用。
一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。
获取目的基因的主要方法： 1、用限制性内切酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。
该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。
原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。
2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。
此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。
因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。
3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。
在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。
4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。
用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。
用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。
二、选择适当的载体按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。
为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。
21 生物化学习题与解析常用分子生物学技术的原理及其应用
常用分子生物学技术的原理及其应用一、选择题(一) A 型题1 .分子杂交实验不能用于A .单链 DNA 与 RNA 分子之间的杂交B .双链 DNA 与 RNA 分子之间的杂交C .单链 RNA 分子之间的杂交D .单链 DNA 分子之间的杂交E .抗原与抗体分子之间的杂交2 .关于探针叙述错误的就是A .带有特殊标记B .具有特定序列C .必须就是双链的核酸片段D .可以就是基因组 DNA 片段E .可以就是抗体3 .下列哪种物质不能用作探针A . DNA 片段B . cDNAC .蛋白质D .氨基酸E . RNA 片段4 .印迹技术可以分为A . DNA 印迹B . RNA 印迹C .蛋白质印迹D .斑点印迹E .以上都对5 . PCR 实验延伸温度一般就是A . 90 ℃B . 72 ℃C . 80 ℃D . 95 ℃E . 60 ℃6 . Western blot 中的探针就是A . RNAB .单链 DNAC . cDNAD .抗体E .双链 DNA7 . Northern blotting 与 Southern blotting 不同的就是A .基本原理不同B .无需进行限制性内切酶消化C .探针必须就是 RNAD .探针必须就是 DNAE .靠毛细作用进行转移8 .可以不经电泳分离而直接点样在 NC 膜上进行杂交分析的就是A .斑点印迹B .原位杂交C . RNA 印迹D . DNA 芯片技术E . DNA 印迹9 .下列哪种物质在 PCR 反应中不能作为模板A . RNAB .单链 DNAC . cDNAD .蛋白质E .双链 DNA10 . RT-PCR 中不涉及的就是A .探针B . cDNAC .逆转录酶D . RNAE . dNTP11 .关于 PCR 的基本成分叙述错误的就是A .特异性引物B .耐热性 DNA 聚合酶C . dNTPD .含有 Zn 2+ 的缓冲液E .模板12 . DNA 链末端合成终止法不需要A . ddNTPB . dNTPC .引物标记D . DNA 聚合酶E .模板13 . cDNA 文库构建不需要A .提取 mRNAB .限制性内切酶裂解 mRNAC .逆转录合成 cDNAD .将 cDNA 克隆入质粒或噬菌体E .重组载体转化宿主细胞14 .标签蛋白沉淀就是A .研究蛋白质相互作用的技术B .基于亲与色谱原理C .常用标签就是 GSTD .也可以就是 6 组氨酸标签E .以上都对15 .研究蛋白质与 DNA 在染色质环境下相互作用的技术就是A .标签蛋白沉淀B .酵母双杂交C .凝胶迁移变动实验D .染色质免疫沉淀法E .噬菌体显示筛选系统16 .动物整体克隆技术又称为A .转基因技术B .基因灭活技术C .核转移技术D .基因剔除技术E .基因转移技术17 .目前主要克隆的致病基因就是A .糖尿病致病基因B .恶性肿瘤致病基因C .单基因致病基因D .多基因致病基因E .高血压致病基因18 .基因疫苗主要就是指A . DNA 疫苗B . RNA 疫苗C .反义核酸D .核酶E .小干扰 RNA19 .目前基因治疗中选用最多的基因载体就是A .噬菌体B .脂质体C .逆转录病毒D .腺病毒相关病毒E .腺病毒20 .目前基因治疗多采用的方法就是A .基因增补B .基因置换C .基因矫正D .基因灭活E .基因疫苗(二) B 型题A . Southern blottingB . Northern blottingC . Western blottingD . dot blottingE . in situ hybridization1 .不需要电泳、转膜等程序2 .电泳前不需进行限制性内切酶消化3 .靠电转移完成生物大分子的转移4 .直接在组织切片或细胞涂片上进行杂交A .逆转录 PCRB .原位 PCRC .实时 PCRD .多重 PCRE . RFLP5 .将目的基因扩增与定位相结合6 .能动态检测反应过程中的产物量7 .将 RNA 的逆转录与 PCR 反应联合应用的一项技术8 .在同一反应中采取多对引物A .功能克隆B .定位克隆C .转基因技术D .核转移技术E .基因剔除9 .也叫基因靶向灭活10 .该技术中,被导入的目的基因称为转基因11 .从对基因编码产物的功能的了解出发克隆致病基因A .基因疫苗B .基因矫正C .基因置换D .基因增补E .基因失活12 .目前基因治疗采用最多的方法就是13 .将致病基因的异常碱基进行修正的基因治疗方法就是14 .将正常基因经体内基因同源重组原位替换致病基因的基因治疗方法就是15 .利用特定的反义核酸阻断变异基因异常表达的基因治疗方法就是A .酵母双杂交技术B .标签蛋白沉淀C .电泳迁移率变动测定D .染色质免疫沉淀E .荧光共振能量转换效应分析16 .凝胶阻滞实验17 .需要设计诱饵基因18 .近年该技术与芯片技术结合在一起,成为一项鉴定特定核蛋白的 DNA 结合靶点的新技术(三) X 型题1 .核酸探针可以就是A .人工合成寡核苷酸片段B .基因组 DNA 片段C . RNA 片段D . cDNA 全长或部分片段E .核苷酸2 .核酸分子杂交可以形成的杂化双链有A . DNA/DNAB . RNA/RNAC . DNA/RNAD .寡核苷酸 /RNAE .寡核苷酸 /DNA3 . PCR 技术主要用于A .目的基因的克隆B .基因的体外突变C . DNA 与 RNA 的微量分析D . DNA 序列测定E .基因突变分析4 .分子杂交技术的原理涉及A .分子杂交特性B .基因文库C .印迹技术D .生物芯片E .探针技术5 .关于 DNA 链末端合成终止法正确的就是A .需加入的链终止剂 ddNTPB . dNTP 需要标记C .引物也需要标记D .又称Sanger 法E . ddNTP 缺乏 5 ' -OH6 .基因组 DNA 文库建立需要A .基因组进行限制性内切酶消化B . DNA 片段克隆到相应载体中C .重组体感染宿主菌D .筛选目的基因可以通过核酸分子杂交的方法进行E .以λ 噬菌体为载体的人基因组 DNA 文库的克隆数目至少应在 10 6 以上7 .用于构建基因组 DNA 文库的载体有A .酵母人工染色体B .粘粒C . λ 噬菌体D .腺病毒E .脂质体8 .基因诊断较常规诊断其特点有A .属于病因诊断B .特异性强C .适用范围窄D .灵敏度高E .有放大效应9 .基因失活的常用技术包括A .基因疫苗B .核酶C .小干扰 RNAD .反义核酸E .基因置换10 .克隆羊多莉的产生属于A .同种异体细胞转移技术B .同种异体细胞核转移技术C .试管内受精D .无性繁殖E .同种异体细胞转基因技术11 .疾病动物模型可用于A .探讨疾病的发生机制B .克隆致病基因C .新治疗方法的筛选系统D .新药物的筛选系统E .新疾病模型的筛选系统12 .蛋白质芯片主要应用于A .蛋白质结构的研究B .蛋白质表达谱的研究C .蛋白质功能的研究D .蛋白质之间的相互作用研究E .疾病的诊断与新药的筛选13 .研究蛋白质相互作用的技术包括A .标签蛋白沉淀B .酵母双杂交C .凝胶阻滞实验D .噬菌体显示筛选系统E . DNA 印迹14 .基因治疗的基本程序包括A .治疗性基因的选择B .基因载体的选择C .靶细胞的选择D .基因转移E .回输体内15 .目前可用作基因治疗的基因载体包括A .腺病毒相关病毒B .噬菌体C .腺病毒D .逆转录病毒E .粘粒二、就是非题1 . Southern blot 主要用于 RNA 的定性与定量分析。
生物技术制药第二版课后思考题及答案（全）
生物技术制药第二版课后思考题及答案（全）1. 生物技术制药分为哪些类型？生物技术制药分为四大类：（1）应用重组DNA技术(包括基因工程技术、蛋白质工程技术)制造的基因重组多肽，蛋白质类治疗剂。
（2）基因药物，如基因治疗剂，基因疫苗，反义药物和核酶等（3）来自动物、植物和微生物的天然生物药物（4）合成与部分合成的生物药物2．生物技术制药具有什么特征？（1）分子结构复杂（2）具有种属特异性（3）治疗针对性强，疗效高（4）稳定性差（5）基因稳定性（6）免疫原性（7）体内的半衰期短（8）受体效应（9）多效性（10）检验的特殊性3.生物技术制药中有哪些应用？应用主要有：（1）基因工程制药：包括基因工程药物品种的开发，基因工程疫苗，基因工程抗体，基因诊断与基因治疗，应用基因工程技术建立新药的筛选模型，应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物，基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用，利用转基因动植物生产蛋白质类药物（2）细胞工程制药：包括单克隆抗体，动物细胞培养，植物细胞培养生产次生代谢产物（3）酶工程制药（4）发酵工程制药4.基因工程药物制造的主要程序有哪些？基因工程药物制造的主要步骤有：目的基因的克隆，构造DNA重组体，构造工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯化产品的检验5.影响目的的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些？（1）外源基因的计量（2）外源基因的表达效率：a、启动子的强弱b、核糖体的结合位点 c、SD序列和起始密码的间距 d、密码子组成（3）表达产物的稳定性（4）细胞的代谢付荷（5）工程菌的培养条件6.质粒不稳定分为哪两类，如何解决质粒不稳定性？质粒不稳定分为分裂分为分裂不稳定和结构不稳定。
质粒的分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象；质粒的结构不稳定是DNA从质粒上丢失或碱基重排，缺失所致工程菌性能的改变。
提高质粒稳定性的方法如下：（1）选择合适的宿主细菌2）选择合适的载体（3）选择压力（4）分阶段控制培养（5）控制培养条件（6）固定化7.影响基因工程菌发酵的因素有哪些？如何控制发酵的各种参数？影响因素：（1）培养基（2）接种量（3）温度（4）溶解氧（5）诱导时机的影响（6）诱导表达程序（7） PH值8.什么是高密度发酵？影响高密度发酵的因素有哪些？可采取哪些方法来实现高密度发酵？高密度发酵：是指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L 影响因素：（1）培养基（2）溶氧浓度（3）PH (4)温度（5）代谢副产物实现高密度发酵的方法：（1）改进发酵条件：a、培养基 b、建立流加式培养基 c、提高供养能力（2）构建出产乙酸能力低的工程菌宿主菌：a、阻断乙酸产生的主要途径 b、对碳代谢流进行分流 c、限制进入糖酵解途径的碳代谢流d、引入血红蛋白基因（3）构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌9.分离纯化常用的色谱分离方法有哪些?它们的原理是什么?方法有离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱及高压液相色谱。
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3.转化受体细胞
➢ 如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能 使目的基因表达的受体细胞；
➢ 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法 筛选，则选择大肠杆菌作为的受体细胞。
4.筛选含有目的基因的目的重组子
➢ 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的 建立）
30ul溶液III至管内柱面上，放置1分钟； 10.高速离心1分钟，所得液体即为高纯度DNA。
(三)鸟枪法克隆目的基因的局限性
工作量较大，需要了解目的基因的背景知识 不能获得最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构
二、cDNA法
cDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA法分离目的基因的基本程序 cDNA法克隆目的基因的局限性
该基因的功能或序列并不一定要了解。
3、基因分离
从复杂的基因组中分离出单个具特定功能或特性的基 因或DNA片段。
❖基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物 体基因组中分离克隆目的基因。
➢确定其表达调控机制和生物学功能； ➢建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌 （细胞）； ➢将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰； ➢然后转入受体细胞内改良生物体的遗传性状，包括人 体基因治疗。
一、 鸟枪法
鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法操作的改进 鸟枪法克隆目的基因的局限性
(一)鸟枪法克隆目的基因的基本战略
鸟枪法（shot-gun approach)：随机克隆供体细胞 的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程 序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子， 进而获得目的基因。
鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。
1.染色体DNA的切断
➢超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端； ➢全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有 可能使目的基因断开，大小不可控；
➢部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基 因完整。
2.与载体连接
➢ 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法 筛选，则选择多拷贝克隆载体；
(二) 鸟枪法操作的改进
使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA
使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切 图谱已知。 如果已知目的基因两端的酶切位点，可用该酶处理 染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基 因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频 率。
在连接前将DNA片段进行分级分离
❖一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合 成目的基因，然后将之克隆表达。
第一节 目的基因的克隆
A 鸟枪法 B cDNA法 C PCR法 D 化学合成法 E 基因的构建❖凝胶DNA片段回收程序
1.切胶回收于离心管中； 2.加入等体积的溶液I； 3.50-60℃水浴加热约10分钟至胶融解； 4.加入到DNA纯化柱内，室温放置1分钟； 5.离心1分钟，倒弃收集管内的液体； 6.加入700微升溶液II，室温放置1分钟； 7.离心1分钟，洗去杂质； 8.加入500微升溶液II，最高速离心1分钟； 9.将DNA纯化柱置于1.5ml离心管上，加入
(二) cDNA法克隆目的基因的局限性
并非所有的mRNA分子都具有polyA结构 细菌或原核生物的mRNA半衰期很短 mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感， 分离纯化困难 仅限于克隆蛋白质编码基因
三 PCR法
(一)PCR法定向扩增目的基因的基本原理
生物技术专业核心课程
基因工程
6 目的基因的克隆与分离鉴定
目的基因的克隆 目的基因的分离鉴定
❖基因克隆与基因分离
个体水平上的克隆 1、克隆 细胞水平上的克隆
分子水平上的克隆
2、基因克隆
分子水平上的克隆，将某一段DNA或一个基因插入到 一个载体分子上，并导入特定的宿主细胞中，形成寄 主/载体单元，称为一个克隆。
例如，已知某目的基因位于1.8 kb 的SalI片段中，将染色体DNA用SalI 切开，琼脂糖凝胶电泳分离；
用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小 区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收 DN kb
1.8 kb
❖凝胶DNA片段回收技术
冻融法 滤纸法 吸附法 低融点凝胶法 溶解法
问题
鸟枪法获得的克隆群体庞大
以人的基因组为例，如果载体承受外源DNA片段 的能力为1-3kb；那么,人类基因组DNA需被切割成 几十万个大小不等的片段；
每个片段都分别插入到一个载体分子上，这样就 会形成由几十万个不同的重组分子组成的克隆群体；
要想从如此巨大的克隆群体中筛选带有目的基因 的克隆，显然是非常费事的。
引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列
G 5‘ppp’5 G 3‘HO
G 5‘ppp’5 G 3‘ HOCCCCCCC
3‘ HOCCCCCCC 5‘ pGGGGGGG
3‘ HOCCCCCCC 5‘ pGGGGGGG
TdT NaOH Klenow
dCTP 退火 dNTPs
AAAAAOH3’ TTTTTp5’
(一) cDNA法克隆目的基因的基本战略
1.cDNA第一链的合成
G 5‘ppp’5 G
mRNA
引物 退火
G 5‘ppp’5 G
逆转录酶
dNTPs
G 5‘ppp’5 G
cDNA第一链
AAAAAAAAAAAAAAOH3’
AAAAAAAAAAAAAAOH3’ TTTTTTTTTTTTTTp5’
AAAAAAAAAAAAAAOH3’ TTTTTTTTTTTTTTp5’
AAAAACCCCCCCOH3’ TTTTTp5’
TTTTTp5’
TTTTTp5’ AAAAAOH3’
3.双链cDNA的克隆
双链平头的cDNA与载体的连接： 平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾， 这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理 回收插入片段 加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收