BOP基因的克隆及鉴定
不同荞麦品种落粒基因的筛选
不同荞麦品种落粒基因的筛选李雪;黄志强;姜君;陈庆富【摘要】为获得荞麦落粒性相关基因，分别选取甜荞、苦荞和金荞的不同品种不同组织混合样品进行转录组测序，通过数据库比对、功能分析与功能注释获取与落粒性相关的 Unigene。
设计引物通过 RACE 方法扩增候选基因，测序后将候选基因全长序列提交到 NCBI 数据库中，通过 blast 寻找候选基因的命名，用实时定量荧光 PCR 测候选基因的表达量。
结果表明：得到6个候选基因，其中，根向光性蛋白基因、SOBIR1-like 蛋白基因、NPR5-like 蛋白基因主要在花器官的发育和形成过程中起调控作用，而 SRG1-like 蛋白基因、过氧化物酶基因和 AGL 蛋白基因主要在植物离区的形成和发育过程中起调控作用。
NPR5-like 蛋白基因在落粒品种与不落粒品种间的表达量差异最大。
结论：NPR5-like 蛋白基因在荞麦落粒过程中起一定的调控作用。
%Six candidate genes related to seed-holding character of buckwheat were determined from different tissue ofF.esculentum,F.tataricum and F.dibotrys by RT-PCR to obtain genes related to seed-holding character of buckwheat.The results showed that root phototropism protein gene,SOBIR1-like protein gene,and NPR5-like gene have the regulating effect on the floral organ development and formation process,but SRG1-like protein gene,peroxidase gene and AGL protein gene have the regulating effect on the development and formation process of abscission zone in buckwheat mainly. There is significant difference in expression quantity of NPR5-like gene between shattering buckwheat variety and non-shattering buckwheat variety,which indicates that NPR5-like protein gene has a certain regulating effect on seed shattering process in buckwheat.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2015(000)005【总页数】5页(P19-23)【关键词】荞麦;落粒性;转录组;实时定量荧光 PCR【作者】李雪;黄志强;姜君;陈庆富【作者单位】贵州师范大学，贵州贵阳 550001;贵州师范大学，贵州贵阳550001;贵州师范大学，贵州贵阳 550001;贵州师范大学，贵州贵阳 550001【正文语种】中文【中图分类】S517荞麦属于蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum)[1]。
bop基因的克隆
四、目的基因的扩增和回收纯化
二. PCR产物的回收纯化
1．0.5g琼脂糖倒入50mlTAE电泳缓冲液，用电炉加热溶解，加一小滴EB 溶液，摇匀，稍冷却后倒胶 2．PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳后割取目的带，放于EP管中。 3．加500ul buffered-A混匀，于75℃水浴加热，混匀至溶胶完全溶解。 4．加250ul buffer DE-B,混合均匀，转入DNA制备管中，12000r离心1min, 弃滤液。 5．将制备管放回EP管中，加500ul buffer w1,12000r离心30s,弃滤液。 6． 放回，加200ul w2,12000r离心30s,弃滤液，用700ul w2 buffer洗涤一次， 12000r离心1min 7． 置于洁净的EP管中，在制备膜中央加25ul去离子水，室温静置10min， 12000r离心1min即DNA 8. －20℃保存备用。
七、重组质粒的转化与验证
一.转化 1.加20μl重组质粒Puc18-bop到50μl感受态细胞中,同时设三组 对照：
编号 1 2 3 4 组别 质粒DNA ----------20μl 20μl 20μl 感受态细胞 ----------50μl ----------50 空白对照 Puc19+感受 态细胞 质粒对照 转化实验组
生物技术综合实验
Bop基因的克隆
一、实验目的
将质粒Puc19中bop基因导入质粒Puc18(载体)中构 建Puc18-bop重组质粒，再将重组质粒导入到大肠 杆菌DH5α中进行克隆，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定， 初步证实实验是否实现了bop基因的克隆
二、实验步骤
SDS碱裂解法制备小量质 粒
目的基因的扩增 和回收纯化
五、DNA的酶切
乳糖酶基因的克隆及生物信息学分析
乳糖酶基因的克隆及生物信息学分析【摘要】目的：克隆并分析保加利亚德氏乳杆菌中的乳糖酶基因。
方法：利用PCR技术从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出乳糖酶基因、测序并生物信息学分析。
结果：成功的从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出全长为3 024 bp的乳糖酶基因，利用生物软件分析，推测乳糖酶基因共编码1 008个氨基酸，蛋白分子量为114 KDa，等电点为4.9，氨基酸序列中共有9处潜在的糖基化位点。
并将此基因与不同来源的乳糖酶基因进行同源性比较。
结论：成功的克隆出乳糖酶基因，并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。
了解该酶的性质特征，为进一步研究及低成本表达该酶奠定基础。
【关键词】乳糖酶基因；克隆；生物信息学分析［ABSTRACT］ Objective: To clone and analyze lactase gene from Lactobacillus delbrueckii bulgaricus. Methods: Cloned lactase gene from Lactobacillus delbrueckii bulgaricus with PCR, made sequencing and bioinformatics analysis. Results: Cloned lactase gene (3 024 bp) successfully. It was presumed that the lactase gene encode 1 008 amino acids, with protein molecule 114 KDa, isoelectric point 4.9, 9 potential glycosylation sites in amino acid sequence. Made homology comparison with other lacteses. Conclusion: The lactase gene is cloned successfully and the bioinformatics analysis is made by biological analysis software to investigate its character. It provides foundationfor further study and colonization at low cost.［KEY WORDS］ Lactase gene; Clone; Bioinformatics analysis 乳及乳制品含有丰富的优质蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎全部已知的维生素和多种矿物质，还含有免疫球蛋白等抗病因子，易被人体消化吸收，是人类改善营养、增强体质的理想食品［1］。
Bop基因的克隆
B op基因的克隆摘要目的：通过选择克隆型载体pUC18为构建重组质粒的载体，质粒pUC19中的细菌视紫红质基因bop为目的基因，利用分子生物学相关技术构建pUC18－bop重组质粒，再将该重组质粒导入到大肠杆菌DH5α细胞中进行克隆，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，初步证实该实验是否实现了视紫红质目的基因（即bop基因）的克隆。
方法：用小量制备质粒DNA的方法分别提取克隆型质粒载体pUC18和含细菌视紫红质基因bop的质粒pUC19，分别用限制性内切酶BamH I和Hind Ⅲ进行双酶切后,在紫外透视仪上取酶切后pUC18质粒和Bop基因，在T4连接酶作用下，16℃恒温水浴过夜连接，再将连接后的产物导入到制备好的感受态细胞，将转化后的产物接种到含氨苄青霉素（0.1g/ml）LB琼脂平板，37℃恒温培养箱培养过夜，最后，挑取单菌落经PCR 扩增后，进行1％琼脂糖凝胶电泳筛选阳性单克隆。
结果：质粒DNA琼脂糖凝胶电泳检测后，初步断定已分离提纯出不含蛋白质、RNA、脂质等杂质PUC18、PUC19质粒。
酶切产物经电泳检测发现，PUC18只产生了一条荧光带，PUC19产生了两条荧光带，初步断定光带1是PUC18,光带2是Bop基因，可利用泳道②上的光带和泳道③上的光带1进行连接实验。
转化结果检测显示可直接从已形成菌落的平板中挑取单菌落进行PCR扩增实验。
最后，PCR回收产物检测，两泳道中的光带都位于1000-2000之间，与预测的bop基因电泳所处位置相符，初步断定bop 基因已成功转入到宿主细胞。
结论：成功构建pUC18－bop重组细菌视紫红质基因，经特异性PCR扩增鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，初步证实该实验实现了视紫红质目的基因（即bop 基因）的克隆。
关键词：Bop基因；pUC18质粒；琼脂糖凝胶电泳；PCR聚合酶链反应1 前言1.1Bop基因视紫红质是一种含视黄醛的膜蛋白，它位于动物视觉器官的感光细胞中，接受光讯号转变为电讯号。
青花菜病程相关蛋白基因BOPR1的克隆与表达分析
青花菜病程相关蛋白基因BOPR1的克隆与表达分析作者：何佳葛露霞金魏佳范灵希章燕如叶佳燕郑颖蒋明来源：《福建农业学报》2018年第01期摘要：病程相关蛋白（Pathogenesis-related protein，PR）是参与植物抗病性的重要物质，在诱导系统抗性过程中起着重要作用。
本研究以青花菜为材料，在克隆BoPR1基因的基础上，利用荧光定量PCR技术研究它们在根肿菌和核盘菌侵染下的表达模式。
序列分析结果表明，BoPR1基因组全长为489 bp，无内含子，编码162个氨基酸，具1个信号肽和1个SCP结构域。
系统发育分析的结果表明，BoPR1与甘蓝型油菜和白菜的PR1遗传距离最小，亲缘关系最近，在进化树上聚为一组；与醉蝶花PR1遗传距离最大，亲缘关系最远。
荧光定量PCR结果显示，BoPR1基因的表达受根肿菌诱导，在接种5d时的表达量最高，为对照的11.84倍；BoPR1基因的表达则不受核盘菌诱导。
关键词：青花菜；BoPR1；基因克隆；表达分析青花菜Brassica oleracea var.italica又名西兰花、茎椰菜、绿菜花和青花苔等，为十字花科CrUCiferae芸薹属一年生或两年生草本蔬菜。
青花菜以花茎和花球为食用部位，因富含蛋白质、维生素、矿物质、类黄酮和硫苷类等物质，深受消费者的青睐。
浙江省是我国青花菜的主产省，年种植面积达1万多h㎡，已成为菜农收入的重要来源。
随着种植年限的不断增加，各种病害如根肿病和菌核病等日益严重，它们危害根、茎、叶或花球，造成青花菜的产量和品质下降。
植物在长期的进化过程中，形成了一整套高度有效的防御机制，在与病原菌的互作过程中，植物通过启动抗病相关基因的表达以增强抵抗能力。
病程相关蛋白（Pathogenesis-related protein，PR）基因是参与这一过程的重要成员，在植物诱导抗性中起着重要作用。
PR基因的诱导、表达及其生物学功能的发挥是一个较复杂的过程，研究其在不同病原菌胁迫下的表现具有十分重要的意义。
中华蜜蜂OBP3基因的克隆_原核表达及组织表达谱_吉挺
昆虫学报Acta Entomologica Sinica，August2014，57（8）：897－904ISSN0454-6296中华蜜蜂OBP3基因的克隆、原核表达及组织表达谱吉挺1，沈芳1，梁勤2，吴黎明3，刘振国1，罗岳雄4（1．扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009；2．福建农林大学蜂学院，福州350002；3．中国农业科学院蜜蜂研究所，北京100093；4．广东省昆虫研究所，广州510260）摘要：【目的】气味结合蛋白质（odorant binding proteins，OBPs）参与气味分子的识别，在蜜蜂嗅觉中扮演重要的角色。
本研究旨在克隆中华蜜蜂Apis cerana cerana OBP3基因，以制备多克隆抗体。
【方法】运用ＲT-PCＲ技术从中华蜜蜂头部总ＲNA中扩增OBP3基因，将该基因亚克隆入原核表达载体pET-28a并转入大肠杆菌Escherichia coli Ｒosetta（DE3）中诱导表达获得融合蛋白质，融合蛋白质经纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体，最后分别用间接ELISA和Western Blot检测抗体的效价和特异性，并采用荧光定量PCＲ检测OBP3基因在中蜂不同组织中的表达。
【结果】克隆得到了中华蜜蜂OBP3基因AccOBP3（GenBank登录号KJ026357），大小为444bp。
SDS-PAGE结果显示融合蛋白成功表达。
制备的多克隆抗体效价高于1ʒ40000，且具有很高的特异性。
荧光定量PCＲ结果表明，AccOBP3基因在腿部和触角中显著高表达（P＜0．01），胸部中次之（P＜0．01），头部和腹部中显著低表达，后两者表达量差异不显著（P＞0．05）。
【结论】OBP3基因在中蜂触角有高转录活性。
本研究实现了中蜂OBP3基因的原核表达，并制备了兔抗中蜂OBP3多克隆抗体，为深入研究中蜂OBP3基因的功能奠定基础。
关键词：中华蜜蜂；OBP3基因；基因克隆；原核表达；组织表达谱；抗体制备中图分类号：Q966文献标识码：A文章编号：0454-6296（2014）08-0897-08Cloning，prokaryotic expression and tissue expression profiling of an OBP3gene in the Chinese honeybee，Apis cerana cerana（Hymenoptera：Apidae）JI Ting1，SHEN Fang1，LIANG Qin2，WU Li-Ming3，LIU Zhen-Guo1，LUO Yue-Xiong4（1．College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu225009，China；2．College of Bee Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou350002，China；3．Institute of ApicultureＲesearch，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100093，China；4．Guangdong Entomological Institute，Guangzhou510260，China）Abstract：【Aim】Odorant binding proteins（OBPs）are involved in the identification of odor molecules，and play an important role in bees’olfaction．This study was designed to clone and express an OBP3 gene from the Chinese honeybee Apis cerana cerana，in order to prepare the polyclonal antibody．【Methods】The OBP3gene was amplified byＲT-PCＲfrom totalＲNA from head of A．cerana cerana，then sub-cloned into prokaryotic expression vector pET-28a and expressed in Escherichia coliＲosetta （DE3）host cells．The fusion protein was purified and immunized into New Zealand white rabbits so as to prepare polyclonal antibody．The sensitivity and specificity of the polyclonal antibody were detected through indirect ELISA and Western blot，respectively．The expression profiles of AccOBP3in different tissues were detected by real-time quantitative PCＲ．【Ｒesults】AccOBP3（GenBank accession no．KJ026357）was cloned and a444bp fragment was obtained．The recombinant vector pET-OBP3was successfully constructed．SDS-PAGE analysis showed that the fusion protein was well expressed．The anti-OBP3polyclonal antibody showed high titer（higher than1ʒ40000）and specificity．Ｒeal-time quantitative PCＲresults showed that the expression level of AccOBP3gene was significantly higher in legs and antennae（P＜0．01），moderate in thorax，and significantly lower in heads and abdomen（P＜基金项目：国家自然科学基金项目（31372382）；国家蜂产业技术体系（CAＲS-45-SYZ6）；江苏省科技支撑计划课题（SBE201230535）作者简介：吉挺，男，1974年生，江苏东台人，博士，副研究员，研究方向为蜜蜂遗传资源调查分析和保护，E-mail：tji@yzu．edu．cn收稿日期Ｒeceived：2014-03-28；接受日期Accepted：2014-05-28898昆虫学报Acta Entomologica Sinica57卷0．01）．The expression level of AccOBP3in heads and abdomen had no significant difference（P＞0．05）．【Conclusion】The OBP3gene has high transcript expression in the antennae of A．cerana cerana．In this study，AccOBP3gene has been cloned and expressed，and the rabbit anti-ApisCeranaOBP3polyclonal antibody has been prepared by immunization with the purified recombinant OBP3protein，which lays the foundation for further studies on functions of OBP3gene．Key words：Apis cerana cerana；OBP3gene；gene cloning；prokaryotic expression；tissue expression profiles；antibody preparation特殊的嗅觉系统对于昆虫有着重要的作用，昆虫通过嗅觉感受器来获取环境中的气味信息，将化学信号传递到被激活的大脑中枢神经元中，进而调节昆虫相应的行为，如觅食、交配、产卵、同族识别及躲避敌害等（Ｒobertson et al．，2003；Swanson et al．，2009）。
分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达
分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达第一节基因操作概述............................................................................. 错误!未定义书签。
一、聚合酶链式反应(PCR) ............................................................. 错误!未定义书签。
二、质粒概述................................................................................... 错误!未定义书签。
三、凝胶电泳................................................................................... 错误!未定义书签。
四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化....................................... 错误!未定义书签。
五、重组质粒的连接....................................................................... 错误!未定义书签。
六、限制性内切酶消化................................................................... 错误!未定义书签。
七、SDS-PAGE蛋白质电泳........................................................... 错误!未定义书签。
第二节材料、设备及试剂..................................................................... 错误!未定义书签。
“十三五”我国青花菜遗传育种研究进展
“十三五”我国青花菜遗传育种研究进展李占省 刘玉梅 韩风庆 方智远 张扬勇 杨丽梅 庄 木 吕红豪 王 勇 季家磊（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）摘 要：“十三五”期间，我国青花菜遗传育种研究快速发展并取得了重要研究进展，选育出一批优异的青花菜新品种和育种资源，雄性不育制种瓶颈得以突破，国产青花菜新品种的市场占有率由2010年的不足5%提升至当前的15.36%，应用基础研究快速发展，遗传育种技术已达到国际先进水平。
本文从青花菜种质创新、新品种选育、育种技术等方面系统综述了2016年以来我国的科研成果和科研进展，并提出了青花菜产业存在的潜在问题及未来发展趋势。
关键词：青花菜；遗传育种；新品种；育种技术；研究进展种28个，地方认定4个，申请新品种权23件，发表科研论文59篇，其中SCI 收录18篇，分别发表在《中国农业科学》《园艺学报》等国内核心期刊以及国际园艺及生物学知名期刊Theoretical and Applied Genetics （TAG ）、BMC 、Frontiers in Plant Science 、PLoS One 、Molecular Breeding 等。
“十三 五”期间，我国青花菜遗传育种主要科研育种单位有中国农业科学院蔬菜花卉研究所、北京市农林科学院蔬菜研究中心、天津科润蔬菜研究所、浙江省农业科学院蔬菜研究所、上海市农业科学院园艺研究所、江苏省农业科学院蔬菜研究所和台州市农业科学院园艺研究所等；主要育种企业有浙江美之奥种业股份有限公司、武汉亚非种业有限公司、温州肇丰种苗有限公司、天津惠尔稼种业科技有限公司和浙江神良种业有限公司等。
“十三五”期间，在青花菜优异种质资源筛选与鉴定、主流病害鉴定、营养成分分析，以及在细胞工程（单倍体育种）、雄性不育改良与利用、分子标记辅助选择、DNA 指纹图谱构建及组学技术等领域建立了完善的技术体系，推出具有市场竞争力的青花菜新品种30多个，市场占有率提升至15%～18%。
细菌视紫红质基因的克隆及鉴定
武汉东湖学院生物技术综合实验论文细菌视紫红质基因的克隆及鉴定院系：生命科学与化学学院姓名：***专业：**级生物技术指导老师：金卫华、邓丽娟、涂毅二〇**年*月本实验室通过将视紫红质目的基因（即bop基因）导入pUC18质粒制备得到重组质粒，再将该重组质粒导入到大肠杆菌DH5α细胞中进行克隆，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，初步证实该实验实现了视紫红质目的基因（即bop基因）的克隆。
本次实验，通过老师提供的大肠杆菌DH5α（含pUC18质粒）菌种平板和大肠杆菌DH5α（不含pUC18质粒）菌种平板进行接种后对比，在氨苄青霉素选择性培养基的筛选作用下，得到了含pUC18质粒的大肠杆菌DH5α；通过SDS碱裂解法制备得到了pUC18质粒，并通过琼脂糖凝胶电泳鉴定；以实验室老师所提供质粒为模板，进行PCR扩增得到目的基因（带BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点），并通过琼脂糖凝胶电泳鉴定和回收纯化；在限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ的作用下，得到酶切后的pUC18质粒和目的基因，并通过琼脂糖凝胶电泳鉴定和回收DNA连接酶的连接作用下，制备出重组质粒；通过氯化钙制备得到感纯化；在T4受态大肠杆菌DH5α细胞；在42℃短时间的热冲击处理（热休克）下，重组质粒被感受态大肠杆菌DH5α细胞所摄取，随着大肠杆菌DH5α细胞的增殖而克隆；为了鉴定重组质粒确实含有视紫红质目的基因（即bop基因），并确实被感受态大肠杆菌DH5α细胞所摄取，并随着大肠杆菌DH5α细胞的增殖而克隆。
首先通过SDS碱裂解法提取重组质粒；通过以重组质粒为模板， PCR扩增得到目的基因；然后在1％琼脂糖凝胶电泳中，通过与Maker蛋白的电泳条带对比，进行初步鉴定，得出我们所提取的重组质粒中含有视紫红质目的基因（即bop基因）。
为了进一步确定结果，在限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ的作用下，我们对重组质粒进行酶切；在琼脂糖凝胶电泳中，通过与Maker蛋白的电泳条带对比，进一步确认出，我们通过大肠杆菌DH5α细胞所克隆得到的重组质粒，确实就是导入了视紫红质目的基因的pUC18质粒。
家蚕BmPP基因的克隆及在Bm-12细胞的表达
家蚕BmPP基因的克隆及在Bm-12细胞的表达作者：黄旭等来源：《广东蚕业》 2015年第2期黄旭李彩婷杨婉莹张若男(华南农业大学动物科学学院，广东高校亚热带蚕桑种质资源保护与安全生产工程技术研究中心，广东省蚕桑工程技术研究中心，广州510642)摘要 MD-2 (related lipid recognition protein，ML蛋白质)是哺乳动物中一类重要的脂类识别蛋白，可以识别革兰氏阴性杆菌细胞壁的主要组分脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)，二者形成复合体后被跨膜蛋白质受体TLR4 (Toll like receptor 4)识别，进而启动下游免疫信号通路。
在鳞翅目昆虫家蚕中，研究发现LPS可以诱导其体内抗菌肽的表达。
为了研究家蚕中参与LPS识别的跨膜蛋白及信号通路，论文通过生物信息学分析家蚕基因组数据库中的MD-2类似基因，通过对其结构域分析，发现家蚕Bm PP具有与哺乳动物中的MD-2相似的保守结构域。
同时抽提脂肪体RNA，通过RT-PCR获得BmPP基因，将其克隆至pIEx-4载体上转染家蚕Bm12细胞，48 h后Western-hlotting检测发现Bm PP成功表达并分泌到细胞培养基中。
研究结果将为进一步研究LPS诱导家蚕细胞发生免疫反应的通路研究提供材料。
关键词 LPS；MD-2；TLR4；家蚕；Bm PP中图分类号：S888.72文献标志码：A文章编号：2095-1205 (2015) 02-30-06项目资助：一东省教育厅科研平台(GCZX-A1303)作者简介：黄旭(1992.11-)，女，本科生，E-mail: paramir@通讯作者：张若男(1990.11-)，女，硕士生，E-mail: 1172917819@脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性细菌的细胞壁组成成分，对哺乳动物而言，是一种强烈的内毒素(endotoxin)，可导致宿主细胞因子失控性表达，介导严重感染、多脏器损伤、败血症休克等多种疾病的发生发展。
柑橘溃疡病菌抗铜相关基因copA和copB的克隆及原核表达
植物病理学报A CTA PHY TO PA THO LOG ICA SI N ICA41(3):247-252(2011)柑橘溃疡病菌抗铜相关基因co pA和co pB的克隆及原核表达王君1,叶刚1,马燕侠1,王国平1,2,洪霓1,2*(1华中农业大学植物科技学院湖北省作物病害监测与安全控制重点实验室,武汉430070;2华中农业大学农业微生物学国家重点实验室,武汉430070)摘要:以柑橘溃疡病菌DNA为模板,对抗铜相关基因co p A和co pB进行了PCR扩增和克隆,获得了大小分别为1782bp 和1095bp的目标片段。
构建了这2个基因的原核表达载体(pET-copA和pET-copB),并在大肠杆菌[E scher ichia co li BL21(DE3)]中成功诱导表达。
利用原核表达的融合蛋白免疫大耳白兔,制备了抗cop A和copB原核表达蛋白的多克隆抗体。
用间接EL ISA法测定了所制备的多克隆抗体的效价均为1B6400。
用所制备的抗体分别对copA和copB的原核表达产物进行W e stern blo t分析的结果显示,在相应位置产生了较强的免疫反应条带,表明所制备抗体能特异性地与相应的抗原发生免疫反应。
关键词:抗铜基因;PCR;原核表达;W estern blo;t柑橘溃疡病菌C l o n ing and p ro ka ryo t ic ex p ress io n o f the co pp e r-re s is tan ce re la ted g e ne s co pA a nd co pB o f X an thom o na s c itri subsp.c itri W ANG Jun1,YE G ang1,M A Y an-x i a1, W ANG G uo-p i n g1,2,HONG N i1,2(1C o ll eg e o f P lant Sc ience and T echno l og y,Huazhong A gr icu lt ura lU n iversity,K ey L ab o f C ropD isease M on ito ri ng and Safety C ontro l i n H ube,i W uhan430070,Ch i na;2H uazhong A g r i cultural U n i v ersity, N ati ona lK ey L ab o f A g rom icrobio logy,W uhan430070,Ch i na)Ab stra ct:Co pper-resistance re lated g enes copA and copB w ere a m plifi e d by using the DNA as te m p late ex-tracted from Xantho m onas citri subsp.citri.The targe t products w ere c l o ned,and sequencing resu lts show s t h at sizes o f copA and copB w it h1782bp and1095bp.The pr okaryo tic expression v ecto rs pET-co pA and pET-copB for these t w o genesw ere constructed.B o t h copA and copB w ere effective l y expressed a s fusi o n pro-teins i n transfo r m ed E scherich i a co li stra i n BL21(DE3)under the i n ducti o n o f IPTG.The expressed pro teins w ere ge-l purified and used to ra ise antisera i n rabbits.The titers o f antisera aga i n st recom b i n ant pro te i n s of co-pA and copB w ere1B6400in i n d irec-t EL I SA.The expressed products w ere subjected to W estern blo t ana l y sis w it h prepared antisera.The resu lts show ed tha t the raised antisera reacted strong ly w ith t h e anti g enic pr o te i n s. These re sults i n d icated that the ra ised antisera cou l d recognize spec ifica ll y the reco m binant pro teins of copA and copB.Key w o rd s:copper-resistance related gene;PCR;prokaryo ti c expression;W e ster n b lo;t Xanthom ona s citri subsp.c itri中图分类号:S436.661文献标识码:A文章编号:0412-0914(2011)03-0247-06柑橘溃疡病(C itrus bacteria l canker disease,CBCD)是由柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种收稿日期:2010-07-12;修回日期:2011-03-20基金项目:国家科技支撑计划项目(2007BAD6105);农业行业专项计划(G ran tNo:nyhyzx07-023)通讯作者:洪霓,教授,主要从事植物病理学研究;T e:l027-********,E-m ai:l w hn@i m ai.l h 第一作者:王君(1984-),女,硕士,研究方向为植物病理学;T e:l027-********,E-m ai:l j unw ang@w eb m ai.l hz 。
植物广谱抗病基因NPR1的研究进展
植物广谱抗病基因NPR1的研究进展作者：宋阳王丕武张学明曲静来源：《农业与技术》2013年第06期摘要：NPR1基因是影响植物广谱抗病性发生的重要调控因子，它主要调控病程相关蛋白的表达，对提高植物的抗病能力极为重要。
目前对NPR1的研究已成为植物抗病基因工程的热点领域之一，但对其种类和同源基因等方面的研究却鲜有报道。
因此，本文对NPR1基因的结构、功能、分类和最新的应用情况进行综述，对未来的发展趋势进行展望，为进一步丰富NPR1基因的研究提供一定的参考。
关键词：NPR1基因；广谱抗病；分类；应用中图分类号：S432.41 文献标识码：A植物在生其自身的自然生态系统和发育过程中，总是在所难免地遭受到一些病原物（如病毒、细菌、真菌等）的侵染。
植物在漫长的进化历程中，形成了错综复杂的防御病原物侵袭的抗病应答反应。
NPR1基因在各类形式的植物抗病性和众多生理过程中起核心调控作用，能够提高植物对多种病原物侵染的抵抗能力，是多条抗病途径之间的一个结合点[1]。
NPR1基因表达的特点是具有广谱性和持久性，对系统获得抗性和诱导系统抗性的发生起关键调控作用，过量表达NPR1的转基因植株可以提高植物对多种病害的抗性且没有表现出明显的不利的形态学变化。
因此，本文对植物广谱抗病基因NPR1的结构、功能、分类和应用情况的研究进展进行综述，以期为NPR1基因的进一步研究提供一定的理论依据。
1 NPR1的结构和功能拟南芥NPR1基因位于1号染色体，大小为2104bp，含有4个外显子和3个内含子，启动子区域有一个W-box序列，其结构（T）（T）TGAC（C/T）能被WRKY转录因子特异性识别，当植物受到病原菌和水杨酸等因子的诱导后，WRKY 转录因子就会迅速表达积累从而启动调节PR基因的表达来应答各种诱导刺激，正向调节NPR1的表达，使植物表现抗病性。
WRKY转录因子（如WRKY62、WRKY70等）的表达依赖于NPR1且存在与NPR1蛋白互作，调控下游的信号传导。
副猪嗜血杆菌外膜蛋白OmpP2基因的克隆及表达
１ ． １ ． １ 菌种 、 质 粒和 血 清
副猪 嗜血 杆 菌血 清 ５型
世界 范 围 内 影 响 养 猪 业 的 典 型 细 菌 性 疾 病ｒ ３ ］ 。目
前， 该病 原 菌 已经 确认 有 ｌ ５种 血 清 型 ］ ， 其 中 ４型 和 ５型是 主要 流 行 野 毒 株 ］ ， 且 一 种 血 清 型 的 菌 苗 对 异种 血清型 细菌 的感染 无保 护 作 用 ］ 。因此 在分 子水 平 寻求一 种蛋 白来应 对不 同 型细菌 交 叉感 染极
接 酶为 Ｆ ｅ ｒ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｓ （ ＭＢ Ｉ ） 公 司产 品 ； 增强 型 ＨＲ Ｐ底
Ｈｐ ｓ 的毒 力 因 子 主 要 包 括 脂 多 糖 （ Ｌ Ｐ Ｓ ） ［ ７ ］ 、 转
物显 色试 剂 盒 和胶 回收 试 剂 盒 为 经 科宏 达 （北 京 ） 有 限公 司 产 品 ； 辣 根 过 氧化 物 酶标 记 羊抗 猪 Ｉ ｇ Ｇ 为 经科 宏达 （北 京 ）有 限公 司产 品 。 １ ． １ ． ３ 培养 基 副猪 嗜血 杆 菌 培 养 基 用 Ｔ Ｓ Ｂ，含
动物 医学进 展 ， ２ ０ １ ３ ， ３ ４ （ １ ０ ） ： ２ ６ － ２ ９
Ｐｒ ｏ ｇ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ Ｖｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ ｒ ｙ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎｅ
副猪 嗜 血杆 菌外 膜 蛋 白 Ｏｍｐ Ｐ ２基 因的 克 隆及 表 达
赵 成 全 ， 冉 多 良 ， 路迎迎。 ， 路 明华。 ， 贺 云 霞 ， 张培 君 ， 龚 玉梅 ， 王 宏俊
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
铁蛋 白［ 、 菌 毛［ ９ ］ 、 荚 膜＿ １ “ （ Ｃ Ｐ） 、 外 膜 蛋 白
（ ｏ ｕ ｔ ｅ ｒ ｍｅ ｍｂ ｒ ａ ｎ ｅ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｓ ， Ｏ ｍｐ ） 等［ １ 。 细 菌外 膜 蛋 白的免疫原 性被 广 泛研 究 。其 中 ， Ｏｍｐ是公 认 的 革 兰 阴性菌制 备 疫 苗 的 主要 抗 原 ， 同时 它 也 与 疫 苗
人博卡病毒相关基因的克隆与表达
摘 要 ： 目的 克 隆 临床 标 本 中人 博 卡 病 毒 相 关功 能基 因 ， 而 在 原 核 表 达体 系 中表 达 博 卡 病 毒 相 关 的蛋 白 。方 法 采 用 分 进
子 生 物 学技 术 构 建 重 组 质 粒 Ｐ Ｘ ２ Ｔ Ｖ Ｐ Ｅ 一 ０ Ｐ和 Ｐ Ｅ 一 ０ — Ｓ 分 别 对 其 进 行 Ｐ Ｒ、 酶 切 和 测 序 鉴 定 ， 后 将 已 ＧＥ 一０ Ｐ、 Ｇ Ｘ ２ Ｔ Ｎ Ｇ Ｘ２Ｔ Ｎ ， Ｃ 双 然
ＡＴ Ａ Ｃ ＡＴ ＧＣ Ｔ Ｔ ＧＧ ＧＧ Ｃ Ｔ ＴＣ； Ｃ 特 异 性 扩 增 出 ３种 目 Ｐ Ｒ
的基 因 ＮＳ ＶＰ和 Ｎ 片段 大小 分 别 为 ５ ０ ８ ９ ６ ０ｂ 。３个 、 Ｐ， ５ 、５ 、６ ｐ
反 应 体 系 均 采 用 ｄ Ｈ２ ２ ７ １ ×缓 冲 液 ５ Ｉ， ０ｍｍｏ／ ｄ Ｏ ３ ． ５ Ｌ， ０ １ ｌ
关 键 词 ： 卡 病 毒 属 ； Ｖ ＮＰ和 Ｎｓ部 分基 因 ； 相 关蛋 白 博 Ｐ、
ＤＯＩ １ ． ９ ９ ｊ ｉｓ ． ６ ３４ ３ ． Ｏ １ ２ ． ２ ：０ ３ ６ ／．ｓ ｎ １ ７ １ Ｏ ２ １ ． Ｏ ０ ９ 文 献标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ： ６ ３４ ３ ２ １ ） Ｏ ２ ６ —２ １ ７ １ ０（ ０ １ ２ 一 ３ ４ ０
Ｈ ｕ ａ ｏ ａ ｉ ｕｓ ａ ｓ ｃ ａ ｅ ｅ ｅ ｃ ｏ ｎ ｎｄ ｅ ｐｒ ｓ ｉ ｎ ｍ ｎ ｂ ｃ ｖ ｒ ｓ ｏ ｉ ｔ ｄ ｇ ｎ ｌ ｎｉ ｇ ａ ｘ ｅ ｓ ｏ
Ｈ ｅＴａ ｊ ， ｕ Ｚ ｅ ｇｌｎ， ａ ｇ Ｌａ ｚ ｉ Ｗ ｕＲｕ ｘｉ ｎ Ｗ ａ ｇ Ｑｉｎ ， ｏ Ｍ Ｗ ｈ ｎ ｉ Ｙ ｎ ｉｈ ， ｎ ａ ｇ， ｎ ｏ ｇ Ｌ“Ｘｕ ｄ ｎ ｅ ｏ ｇ△
bop基因及其上游启动子的克隆与表达
收 稿 日期 ：２ ０ —２１ ０ ４１ —３ 十通 讯 联 系 人
Ｐ ｄ ６ （ ｉ ｔｄ ｉｆ ｉａ ｐ ｉ） 授 惠 赠． ａ ｒｓ Ｕｎｔ ｅＢ ｏｉ ｃ ．Ｓ ａｎ 教 ａ ｓ
文 章 编 号 ：６ １８ ３ （ ０ ５ ０ —２ ５０ １７ －８ ６ ２ ０ ） ２０ １－４
ｂ ｐ基 因及其上游启动子的克隆与表达 ｏ
宋 景 娇 ，王 友 亮 ，曹 军 卫
（ 汉 大 学 生命 科 学 学院 ，湖北 武 汉 ４ ０ ７ ） 武 ３ ０ ２
摘 要 ：应 用 重 组 Ｐ Ｒ 的方 法 ， 接 从 盐 沼 盐 杆 菌 （ ｌｂ ｃｒｕ ａｉａ ｉｍ） ９的 基 因 组 ＤＮ 上 扩 增 到 了 Ｃ 直 Ｈａｏａ ｔｉｍ ｓｌ ｒｕ Ｓ ｎ Ａ
Ｅ ｍａｌｃｏｗ ｗｈ ． ｄ ．ｎ — ｉ ａｊ ＠ ： ｕ ｅ ｕ ｃ
作者简 介：宋景娇 （９ ９）女 ， １ ７一 ， 硕士生 ， 现从 事嗜盐微生物的分子 生物 学研究
维普资讯
２６ １
武 汉大学学 报（ 理学 版 ）
第 ５ １卷
１ １ ２ 主 要试 剂 ．．
ｂｐ基 因 片段 ， 其 连 接 到经 同样 双酶 切 的 表 达 质 ｏ 将
粒 ｐ Ｎ ｖ 上 ， 化 大 肠 杆 菌 ＤＨ５ ， 布 在 含 四 ＸＬ ｏ Ｒ 转 ａ涂 环 素 （ ０ ｍｇ Ｌ） Ｌ 固 体 培 养 基 上 培 养 ， 过 ５ ／ 的 Ｂ 通
Ｇ ＧＧＧＣ 一 方 框 内为 Ｂ ｍＨ Ｉ酶 切 位点 ） ＴＣ ３ （ ａ ．
牛妊娠相关糖蛋白基因bopag4的原核表达及单克隆抗体的制备
摘 要： 为 了 获 得 具 有 高 特 异 性 和 高 免 疫 原 性 的 boPAG4 单 克 隆 抗 体， 本 试 验 以 PCR 技 术 扩 增 荷 斯 坦 奶 牛
boPAG4 基因，构建重组质粒 pCold TF-boPAG4 后，在 E.coli BL21(DE3) 中表达 pCold TF-boPAG4 蛋白并优化。
收稿日期：2019-10-08 基金项目：北京市教委科研计划项目（KM201810020016）. 第一作者：祁文婧（1994-），女，河南新乡人，硕士研究生，从事食品安全快速检测研究工作 . 通讯作者：张红星（1970-），男，黑龙江哈尔滨人，博士，教授，从事食品安全检测与控制研究工作 .E-mail:hxzhang511@
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河北农业大学学报
第 42 卷
成功植入早期胚胎是建立怀孕的基础，细胞因 子的调节在妊娠的确立中起重要作用。妊娠相关糖 蛋 白（Pregnancy-associated glycoproteins, PAGs） 是一种多基因家族，由无活性天门冬氨酰基因家族 编码［1］，反刍动物胎盘的双核巨细胞分泌，于胎盘 期进入母体循环［2］。怀孕期间反刍动物滋养层的分 泌功能受许多因素的影响，这些因素可以影响怀孕 奶 牛 的 血 液 和 乳 汁 中 的 PAG 浓 度［3］。BoPAGs 蛋 白存在于怀孕母牛体内，分娩时将达到最高水平， 并且在分娩后数周仍可在循环系统中检测到。目前， 母体血清中的 PAG 浓度已被认为是妊娠的指标，可 用于牛的生殖管理［2］。PAGs 的主要检测方法有放 射免疫测定法（RIA）、直肠触诊（RP）、USG 与 酶联免疫吸附测定法（ELISA）。ELISA 作为可靠 的妊娠检测手段，目前已作为乳制品行业的常规服 务［4］。 由 于 ELISA 比 其 他 检 测 方 法 更 有 效，PAG 试验的实用性显著提高［5-7］。已有研究表明 boPAGs 免疫原性不仅存在于胎儿子叶，也同时存在于母体 子宫阜结缔组织。通过免疫学方法检测牛血清（例 如 PAGs）中的物质是可行的［8-9］。
羽衣甘蓝β胡萝卜素羟化酶基因的克隆及表达分析
浙江农业学报ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＺｈｅｊｉａｎｇｅｎｓｉｓꎬ２０１９ꎬ３１(１):８０－８５ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｚｊｎｙｘｂ.ｃｎ王玉书ꎬ王欢ꎬ郭宇ꎬ等.羽衣甘蓝β￣胡萝卜素羟化酶基因的克隆及表达分析[Ｊ].浙江农业学报ꎬ２０１９ꎬ３１(１):８０－８５.ＤＯＩ:１０ ３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００４￣１５２４ ２０１９ ０１ １１收稿日期:２０１８￣０４￣０３基金项目:国家自然科学基金(３１４０１９０８)ꎻ黑龙江省自然科学基金(Ｃ２０１６０５６)ꎻ黑龙江省普通高等学校青年创新人才培养计划(ＵＮＰＹ￣ＳＣＴ￣２０１７１５５)ꎻ黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目(１３５２０９３１３)作者简介:王玉书(１９８５ )ꎬ女ꎬ黑龙江富锦人ꎬ博士ꎬ副教授ꎬ主要从事园艺植物遗传与分子育种研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｗａｎｇｙｓ１０１９＠１２６.ｃｏｍ羽衣甘蓝β￣胡萝卜素羟化酶基因的克隆及表达分析王玉书１ꎬ王㊀欢２ꎬ郭㊀宇１ꎬ周明慧１ꎬ陈㊀璐１ꎬ陈㊀阳１(１.齐齐哈尔大学生命科学与农林学院ꎬ黑龙江省抗性基因工程与寒地生物多样性保护重点实验室ꎬ黑龙江齐齐哈尔１６１００６ꎻ２.齐齐哈尔大学化学与化学工程学院ꎬ黑龙江齐齐哈尔１６１００６)摘㊀要:以羽衣甘蓝(ＢｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａＬ.ｖａｒ.ａｃｅｐｈａｌａ)为试验材料ꎬ采用同源克隆和ＲＴ￣ＰＣＲ技术ꎬ克隆得到羽衣甘蓝β￣胡萝卜素羟化酶的ｃＤＮＡ全长ꎬ命名为ＢｏＢＣＨ(ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＭＨ０１６２４２)ꎮ序列分析表明ꎬ该ｃＤＮＡ序列长９０６ｂｐꎬ编码３０１个氨基酸ꎬ分子量３３ ８ｋｕꎬ理论等电点为９ ６７ꎮ保守结构域分析表明ꎬＢｏＢＣＨ属于ＦＡ＿ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ蛋白超家族ꎮ系统发育分析结果表明ꎬ羽衣甘蓝与结球甘蓝处于同一分支ꎬ其亲缘关系最近ꎮＴＭＨＭＭ和Ｗｏｌｆ￣Ｐｓｏｒｔ进行跨膜区分析及亚细胞定位ꎬ结果表明ＢｏＢＣＨ蛋白有４个跨膜区域ꎬ可能定位于叶绿体中发挥作用ꎮｑＲＴ￣ＰＣＲ检测结果表明ꎬＢｏＢＣＨ在紫叶羽衣甘蓝ＤＨ系Ｄ０７的根㊁茎㊁叶中均有表达ꎬ在叶片中表达量最高ꎬ茎次之ꎬ根中表达量最低ꎻ不同发育时期的检测结果表明ꎬＢｏＢＣＨ在观赏期叶片中表达最高ꎬ在幼苗期和莲座期表达水平较低ꎮ关键词:羽衣甘蓝ꎻβ￣胡萝卜素羟化酶基因ꎻ克隆ꎻ表达分析中图分类号:Ｓ６３５ ９文献标志码:Ａ文章编号:１００４￣１５２４(２０１９)０１￣００８０￣０６Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆβ￣ｃａｒｏｔｅｎｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍｋａｌｅ(ＢｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａＬ.ｖａｒ.ａｃｅｐｈａｌａ)ＷＡＮＧＹｕｓｈｕ１ꎬＷＡＮＧＨｕａｎ２ꎬＧＵＯＹｕ１ꎬＺＨＯＵＭｉｎｇｈｕｉ１ꎬＣＨＥＮＬｕ１ꎬＣＨＥＮＹａｎｇ１(１.ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＲｅｓｉｓｔａｎｃｅＧｅｎｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＰｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆＢｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎＣｏｌｄＡｒｅａｓꎬＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉ￣ｅｎｃｅｓꎬＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙꎬＱｉｑｉｈａｒＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＱｉｑｉｈａｒ１６１００６ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬＱｉｑｉｈａｒＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＱｉｑｉｈａｒ１６１００６ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｔｈｅβ￣ｃａｒｏｔｅｎｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍｋａｌｅ(ＢｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａＬ.ｖａｒ.ａｃｅｐｈａｌａ)ｗａｓｃｌｏｎｅｄｂｙｈｏｍｏｌｏｇｙ￣ｂａｓｅｄｃｌｏｎｉｎｇａｎｄＲＴ￣ＰＣＲｓｔｒａｔｅｇｉｅｓꎬｎａｍｅｄａｓＢｏＢＣＨ(ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ:ＭＨ０１６２４２).Ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌ￣ｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈｏｆＢｏＢＣＨｃＤＮＡｗａｓ９０６ｂｐꎬｗｈｉｃｈｅｎｃｏｄｅｄａｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈ３０１ａｍｉｎｏａｃｉｄｓꎬａｎｅｓｔｉ￣ｍａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｗａｓ３３ ８ｋｕａｎｄａｎｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｐｏｉｎｔｗａｓ９ ６７.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｄｏｍａｉｎａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＢｏＢＣＨｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏｔｈｅＦＡ＿ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｐｒｏｔｅｉｎｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ.ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅｋａｌｅｈａｄｔｈｅｃｌｏｓｅｓｔｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈＢｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａ.ＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＴＭ￣ＨＭＭａｎｄＷｏｌｆ￣Ｐｓｏｒｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｉｔｍｉｇｈｔｂｅｔａｒｇｅｔｅｄｔｏｔｈｅｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｗｉｔｈｆｏｕｒｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｇｉｏｎｓ.ＴｈｅｑＲＴ￣ＰＣＲｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｗａｓｌｅａｆꎬｔｈｅｎｅｘｔｗａｓｓｔｅｍꎬａｎｄｔｈｅｌｏｗｅｓｔｌｅｖｅｌｗａｓｉｎｒｏｏｔꎻｉｎｔｈｅｄｉｆｆｅｒ￣ｅｎｔｐｅｒｉｏｄｓｏｆｌｅａｖｅｓꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｉｎｔｈｅｏｒｎａｍｅｎｔａｌｐｅｒｉｏｄｗａｓｈｉｇｈꎬａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｗａｓｌｏｗｅｒｉｎｓｅｅｄｌｉｎｇｓｔａｇｅａｎｄｒｏｓｅｔｔｅｓｔａｇｅ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｋａｌｅꎻβ￣ｃａｒｏｔｅｎｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｇｅｎｅꎻｃｌｏｎｉｎｇꎻｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ㊀㊀类胡萝卜素是在自然界植物㊁细菌和真菌中广泛存在的一类色素类物质ꎬ同时在植物光合作用中起重要作用[１－２]ꎮβ￣胡萝卜素羟化酶在植物类胡萝卜素生物合成代谢途径中具有非常重要的作用ꎬ其作用是催化β￣胡萝卜素通过中间代谢物β￣隐黄质生成玉米黄质ꎬ因其增加了植物细胞中玉米黄质的含量ꎬ所以该反应在植物叶黄素循环中有非常重要的意义[３]ꎮ有研究表明ꎬβ￣胡萝卜素羟化酶基因的过量表达有助于细胞中玉米黄质的过量积累ꎬ进而提高细胞中类胡萝卜素含量[４]ꎻ而利用反义抑制和Ｔ￣ＤＮＡ突变获得抑制β￣羟化酶基因表达的拟南芥植株ꎬ由于β￣羟化酶基因的缺陷ꎬ它们合成隐黄素等类胡萝卜素的能力减弱ꎬ抗逆性随之大幅下降[５－６]ꎮ目前已从拟南芥[７]㊁烟草[８]㊁柑橘[９]㊁辣椒[１０]等植物中分离鉴定了许多β￣胡萝卜素羟化酶基因ꎮ通过生物信息学比对分析发现ꎬ这些基因均具有非常保守的同源序列ꎮ羽衣甘蓝叶片颜色鲜艳ꎬ较耐严寒㊁干旱ꎬ因此成为冬春季节中重要的绿化景观植物ꎮ研究表明ꎬ在羽衣甘蓝生长过程中ꎬ叶色与叶绿素㊁类胡萝卜素及花青素的含量密切相关[１１]ꎮ然而到目前为止ꎬ关于羽衣甘蓝中类胡萝卜素生物合成途径的相关基因研究还鲜有报道ꎮ本研究采用同源克隆和ＲＴ￣ＰＣＲ技术获得羽衣甘蓝β￣胡萝卜素羟化酶基因ＢｏＢＣＨꎬ并对其进行了生物信息学分析ꎬ研究该基因在不同组织㊁不同发育阶段的表达情况ꎬ为羽衣甘蓝β￣胡萝卜素羟化酶基因的功能鉴定及调节机制提供理论基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料紫叶羽衣甘蓝ＤＨ系Ｄ０７于２０１７年１月种植于齐齐哈尔大学园艺试验基地ꎬ分别取Ｄ０７的根㊁茎㊁叶不同组织和幼苗期㊁莲座期㊁观赏期３个时期的幼嫩叶片ꎬ经液氮速冻后－８０ħ保存ꎬ备用ꎮ１.２㊀方法１.２ １㊀总ＲＮＡ的提取及ｃＤＮＡ的合成利用Ｔｒｉｚｏｌ(ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎꎬＵＳＡ)试剂盒提取羽衣甘蓝总ＲＮＡꎬ之后经ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度计(ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃꎬＵＳＡ)测定浓度及Ｄ２６０/Ｄ２８０ꎬ琼脂糖凝胶电泳检测ＲＮＡ完整性ꎮ检测合格后ꎬ取经ＤＮａｓｅ处理后ＲＮＡ作为模板ꎬ使用反转录试剂盒将２μｇ植物总ＲＮＡ反转录为ｃＤＮＡꎬ检测待用ꎮ１.２ ２㊀引物设计与基因克隆基于作者前期全基因组测序筛选得到的ＢｏＢＣＨ基因序列ꎬ设计克隆引物Ｆ(５ᶄ￣ＡＴＧＧＣＧ￣ＧＣＡＧＣＡＣＴＣＴＣＡＴＣＡＡＴＣＴＣ￣３ᶄ)和Ｒ(５ᶄ￣ＡＧＡＧ￣ＧＴＧＧＡＡＡＣＣＴＴＧＴＴＧＴＡＴＡＡＴＴＴＧＴＡＡ￣３ᶄ)ꎮｃＤ￣ＮＡ扩增使用ＡＢＩＶｅｒｉｔｉＰＣＲ扩增仪进行ꎮＰＣＲ体系:２ˑＵｌｔｒａ￣ＰｆｕＭａｓｔｅｒＭｉｘ酶(ＤｙｅＰｌｕｓ)５μＬ㊁模板１μＬ㊁正反引物各０ ８μＬ和ｄｄＨ２Ｏ２ ４μＬꎮＰＣＲ反应条件为:９４ħ２ｍｉｎꎻ９４ħ３０ｓꎬ５３ħ３０ｓꎬ７２ħ１ｍｉｎꎬ３０个循环ꎻ７２ħ８ｍｉｎꎮＰＣＲ产物电泳分析后ꎬ回收㊁连接㊁转化及测序ꎬ得到ＢｏＢＣＨ的ｃＤＮＡ序列信息ꎮ１.２ ３㊀生物信息学分析利用ＮＣＢＩ网站对ＢｏＢＣＨ的ｃＤＮＡ序列在线查找开放阅读框(ＯＲＦ)ꎻ利用蛋白质分析在线工具(ｈｔｔｐ://ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｐｒｏｔｐａｒａｍ/)在线程序分析编码蛋白的理化性质(氨基酸组成㊁相对分子质量㊁等电点等)ꎻ利用ＥｘＰａｓｙ￣ＰｒｏｔＳｃａｌｅ预测氨基酸的亲/疏水性ꎻ利用ＮＣＢＩ在线工具ＣＤＤ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ/ｃｄｄ/ｗｒｐｓｂ.ｃｇｉ)分析氨基酸序列的保守结构域ꎻ利用ＳｉｇｎａｌＰ４ １和Ｗｏｌｆ￣Ｐｓｏｒｔ进行信号肽和蛋白亚细胞定位预测ꎻＴＭＨＭＭ２ ０对蛋白进行跨膜区分析ꎻ用ＭＥＧＡ６ ０软件采用邻接法进行氨基酸序列比对以及构建系统发育树ꎮ１.２ ４㊀基因表达分析根据测序结果ꎬ设计荧光定量引物分别为ＢｏＢＣＨ￣Ｆ和ＢｏＢＣＨ￣Ｒꎬ以１８ＳｒＲＮＡ作为内参ꎬ引物为１８ＳｒＲＮＡ￣Ｆ和１８ＳｒＲＮＡ￣Ｒ(表１)ꎮ引物采用ＲｏｃｈｅＬＣＰＤＳ２软件设计并由北京擎科新业生物技术有限公司合成ꎮｑＲＴ￣ＰＣＲ反应根据Ｑｕａｎ￣ｔｉＦａｓｔ®ＳＹＢＲ®ＧｒｅｅｎＰＣＲＫｉｔ试剂盒(ＱｉａｇｅｎꎬＧｅｒｍａｎｙ)说明书ꎬ在ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ®４８０Ⅱ型荧光定量ＰＣＲ仪(ＲｏｃｈｅꎬＳｗｉｓｓ)上进行反应ꎮ每个反１８王玉书ꎬ等.羽衣甘蓝β￣胡萝卜素羟化酶基因的克隆及表达分析表１㊀ＰＣＲ引物Ｔａｂｌｅ１㊀ＴｈｅｐｒｉｍｅｒｓｏｆＰＣＲｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ引物序列Ｓｅｑｕｅｎｃｅ(５ᶄ￣３ᶄ)１８ＳｒＲＮＡ￣ＦＴＣＧＣＣＧＴＡＡＣＡＣＴＣＡＡＡＣＣＡ１８ＳｒＲＮＡ￣ＲＴＧＡＣＴＧＡＧＧＣＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＢｏＢＣＨ￣ＦＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＡＣＡＴＡＧＴＡＡＧＢｏＢＣＨ￣ＲＧＴＡＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＧＧＡＣＧＴＡ应采用３个生物学重复和３个技术重复ꎮ反应结束后ꎬ应用２－әәＣｔ算法进行相对定量计算[１２]ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀ＢｏＢＣＨ基因的克隆以羽衣甘蓝Ｄ０７观赏期叶片ｃＤＮＡ为模板ꎬ通过ＰＣＲ扩增后获得ＢｏＢＣＨ基因片段ꎬ经过琼脂糖凝胶电泳检测获得条带与预期大小相符(图１)ꎮ对扩增结果进行测序分析ꎬ将该基因命名为ＢｏＢＣＨ(ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＭＨ０１６２４２)ꎮ２.２㊀ＢｏＢＣＨ基因ｃＤＮＡ序列的生物信息学分析２.２ １㊀ＢｏＢＣＨ基因编码氨基酸序列分析利用ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ在线工具翻译ＢｏＢＣＨ的ｃＤＮＡ序列ꎬＢｏＢＣＨ基因编码３０１个氨基酸ꎮ利用蛋白质分析在线工具(ｈｔｔｐ://ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｐｒｏｔｐａｒａｍ/)分析ＢｏＢＣＨ蛋白的物理化学性质ꎬ结果表明ＢｏＢＣＨ蛋白由２０种氨基酸组成ꎬ其中丝氨酸(Ｓｅｒ)含量最多ꎬ半胱氨酸(Ｃｙｓ)含量最少ꎬ带负电氨基酸残基２５个ꎬ带正电氨基酸残基３７个ꎻ分子量约为３３ ８ｋｕꎬ理论等电点为９ ６７ꎻ亲水性平均系数(ＧＲＡＶＹ)为－０ ０７２ꎬ说明ＢｏＢＣＨ蛋白为亲水蛋白ꎮ利用ＥｘＰａｓｙ￣ＰｒｏｔＳｃａｌｅ预测氨基酸的亲/疏水性表明:该蛋白的最高值为２ １３３ꎬ在第１４０个氨基酸处ꎬ疏水性最强ꎻ最低值为－３ ０４４ꎬ在第１７０个氨基酸处ꎬ亲水性最强ꎮ同时ꎬ从整条多肽链的氨基酸预测值来看ꎬ亲水性氨基酸残基所占比例高于疏水氨基酸残基ꎬ由此推断ꎬＢｏＢＣＨ蛋白是一种亲水性蛋白ꎬ与ＭꎬＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ１~３ꎬＲＴ￣ＰＣＲ扩增产物ꎮＭꎬＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ１－３ꎬＲＴ￣ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ.图１㊀羽衣甘蓝ＢｏＢＣＨ基因ＰＣＲ扩增结果Ｆｉｇ.１㊀ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＢｏＢＣＨｇｅｎｅｆｒｏｍｔｈｅｋａｌｅ基因编码氨基酸序列的分析结果一致ꎮ利用ＮＣ￣ＢＩ在线工具ＣＤＤ分析ＢｏＢＣＨ氨基酸保守蛋白结构域ꎬ结果表明ꎬＢｏＢＣＨ属于ＦＡ＿ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ蛋白超家族(图２)ꎮ２.２ ２㊀ＢｏＢＣＨ蛋白的信号肽、跨膜结构及亚细胞定位预测运用在线工具ＳｉｇｎａｌＰ４ １ｓｅｒｖｅｒ进行信号肽分析预测ꎬ结果显示ꎬＣ值㊁Ｓ值㊁Ｙ值均小于阈值０ ４５ꎬ推测ＢｏＢＣＨ蛋白无信号肽结构ꎬ属于非分泌蛋白ꎮ蛋白跨膜结构预测分析显示ꎬＢｏＢＣＨ蛋白在９３~１１５㊁１３０~１５２㊁１８３~２００和２０４~２２６处有４个跨膜结构域(图３)ꎮ亚细胞定位分析结果显示ꎬＢｏＢＣＨ可能定位于叶绿体中ꎮ２.２ ３㊀ＢｏＢＣＨ蛋白序列的进化分析为了预测ＢｏＢＣＨ基因的功能ꎬ从ＮＣＢＩ中查找到其他植物的ＢＣＨ同源蛋白序列ꎬ采用ＭＥＧＡ６ ０邻接法与羽衣甘蓝ＢＣＨ蛋白序列对比并构建无根系统进化树(图４)ꎮ羽衣甘蓝与结球甘蓝㊁甘蓝型油菜㊁拟南芥等１０个高等植物的ＢＣＨ序列比对显示ꎬ这１１个植物ＢＣＨ氨基酸序列被聚为两大类ꎮ羽衣甘蓝ＢＣＨ与结球甘蓝处于同一分支ꎬ其亲缘关系最近ꎬ其序列一致性高达９９％ꎻ与醉蝶花㊁萝卜㊁大白菜等物种的ＢＣＨ蛋白在进化上亲缘关系较远ꎮ２.３㊀ＢｏＢＣＨ基因特异性表达分析图２㊀ＢｏＢＣＨ的保守结构域预测Ｆｉｇ.２㊀ＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＢｏＢＣＨｃｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎｓ２８ 浙江农业学报㊀第３１卷㊀第１期图３㊀ＢｏＢＣＨ蛋白跨膜结构域预测Ｆｉｇ.３㊀ＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｓｉｎＢｏＢＣＨｐｒｏ￣ｔｅｉｎ㊀㊀为了研究ＢｏＢＣＨ基因在羽衣甘蓝不同组织中的表达情况ꎬ对不同组织提取的ＲＮＡ进行了实时荧光定量ｑＲＴ￣ＰＣＲ分析ꎮ结果表明ꎬ观赏期ＢｏＢＣＨ在不同器官中均有表达ꎬ但表达具有组织特异性ꎬ其在叶片中表达量最高ꎬ极显著高于其他器官(Ｐ<０ ０１)ꎻ其次是茎ꎻ而在根中表达量最少ꎬ与其他组织表达差异极显著(Ｐ<０ ０１)ꎮＢｏＢＣＨ基因在Ｄ０７幼苗期㊁莲座期和观赏期３个时期叶片中的表达量也存在显著差异ꎬ其中观赏期时表达量最高ꎬ莲座期和幼苗期表达量差异不图４㊀羽衣甘蓝ＢｏＢＣＨ与其他植物ＢＣＨ蛋白的系统进化树Ｆｉｇ.４㊀ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＢｏＢＣＨｐｒｏｔｅｉｎｉｎｋａｌｅａｎｄＢＣＨｓｏｆｏｔｈｅｒｐｌａｎｔｓ显著(Ｐ>０ ０５)ꎬ观赏期ＢｏＢＣＨ的表达量约为其他两个时期表达量的１０倍(图５)ꎮ３㊀讨论本研究利用同源克隆技术从羽衣甘蓝Ｄ０７中克隆得到ＢｏＢＣＨ基因的全长ｃＤＮＡ序列ꎮ通过序列分析发现ꎬＢｏＢＣＨ与结球甘蓝㊁甘蓝型油菜㊁拟南芥㊁琴叶拟南芥等植物的ＢＣＨ氨基酸序列相似性达７６％以上ꎬ它们均属于ＦＡ＿ｈｙｄｒｏｘｙ￣ｌａｓｅ蛋白超家族ꎬ表明该结构域在分析进化过程中稳定性较好ꎬ在类胡萝卜合成及抵抗非生物胁迫中发挥类似的作用[１３－１４]ꎮ氨基酸序列同源性分析表明ꎬＢｏＢＣＨ蛋白与结球甘蓝蛋白在同一分不同大写字母代表不同组织或发育时期间表达量差异显著(Ｐ<０ ０１)ꎮＴｈｅｂａｒｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｐｉｔａｌｌｅｔｔｅｒｓｓｈｏｗｅｄｔｈｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ(Ｐ<０ ０１).图５㊀ＢｏＢＣＨ在Ｄ０７不同组织和不同发育时期中的相对表达量Ｆｉｇ.５㊀ＲｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＢｏＢＣＨｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｓｔａｇｅｓｏｆＤ０７３８ 王玉书ꎬ等.羽衣甘蓝β￣胡萝卜素羟化酶基因的克隆及表达分析支ꎬ进化关系最近ꎬ因此推测它们应该具有相类似的功能ꎬ可能与类胡萝卜素合成有关ꎮ跨膜结构预测和亚细胞定位预测得知ꎬＢｏＢＣＨ蛋白含有脂肪酸羟化酶超家族保守域(ＢｏＢＣＨ保守区域分别为９３~１１５㊁１３０~１５２㊁１８３~２００和２０４~２２６处残基)ꎬ可能定位于叶绿体中ꎮ这与目前己报道的其他物种中β￣胡萝卜素羟化酶定位于叶绿体类囊体膜上的结论一致[１５]ꎬ推测该类酶经由叶绿体导肽从细胞质运输到叶绿体类囊体膜上ꎮ这些生物信息分析对于将来研究ＢｏＢＣＨ蛋白相关功能具有指导意义ꎮ研究发现ꎬ羽衣甘蓝β￣胡萝卜素羟化酶基因ＢｏＢＣＨ在根㊁茎㊁叶中均能表达ꎬ但不同组织器官中存在显著性差异ꎬＢｏＢＣＨ在叶片中的表达量最高ꎬ其次是茎ꎬ根中表达量最低ꎮ在不同发育阶段的结果表明ꎬ在幼苗期与莲座期时ꎬＢｏＢＣＨ基因表达量均较低ꎬ并且无显著差异ꎬ然而观赏期时ＢｏＢＣＨ的表达量高达幼苗期与莲座期的１０倍之多ꎬ表明在观赏期时叶片中ＢｏＢＣＨ基因积累较多ꎬ并发挥其催化作用ꎮ这可能是因为ＢｏＢＣＨ的活性与叶片中类胡萝卜素含量密切相关[１６]ꎬ说明本研究克隆得到的ＢｏＢＣＨ基因可能在羽衣甘蓝叶片的类胡萝卜素合成途径中发挥重要作用ꎮ本研究克隆获得羽衣甘蓝ＢｏＢＣＨ基因的ｃＤＮＡ序列ꎬ并对该基因在不同组织及不同发育时期的表达模式进行了分析ꎬ推测ＢｏＢＣＨ基因在羽衣甘蓝类胡萝卜素代谢调控中起重要作用ꎮ后续研究中ꎬ将会就该基因的瞬时表达㊁转基因验证等方面进行ＢｏＢＣＨ基因功能的研究ꎬ并对该基因与类胡萝卜素生物合成途径中相关酶基因之间的互作关系进行深入研究ꎬ进而全面解析羽衣甘蓝类胡萝卜素合成代谢调控的分子机制ꎮ参考文献(Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ):[１]㊀ＦＲＡＮＫＨＡꎬＣＯＧＤＥＬＬＲＪ.Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓｉｎｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ[Ｊ].ＰｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＰｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ１９９６ꎬ６３(３):２５７－２６４.[２]㊀吴疆.枸杞β￣胡萝卜素羟化酶基因及其启动子的克隆和研究[Ｄ].天津:天津大学ꎬ２０１５.ＷＵＪ.Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈｏｆβ￣ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｇｅｎｅａｎｄｉｔｓｐｒｏｍｏｔｅｒｏｆＬｙｃｉｕｍｂａｒｂａｒｕｍ[Ｄ].Ｔｉａｎｊｉｎ:ＴｉａｎｊｉｎＵ￣ｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ２０１５.(ｉｎＣｈｉｎｅｓｅｗｉｔｈＥｎｇｌｉｓｈａｂｓｔｒａｃｔ)[３]㊀ＫＡＴＯＭꎬＩＫＯＭＡＹꎬＭＡＴＳＵＭＯＴＯＨꎬｅｔａｌ.Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｇｅｎｅｓｄｕｒｉｎｇｍａｔｕｒａｔｉｏｎｉｎｃｉｔｒｕｓｆｒｕｉｔ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２００４ꎬ１３４(２):８２４－８３７.[４]㊀ＰＥＧＵＥＲＯ￣ＰＩＮＡＪＪꎬＧＩＬ￣ＰＥＬＥＧＴＩＮＩＬＥꎬＭＯＲＡＬＥＳＦ.ＴｈｒｅｅｐｏｏｌｓｏｆｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｎＱｕｅｒｃｕｓｃｏｃｃｉｆｅｒａｌｅａｖｅｓｄｕｒｉｎｇｌｉｇｈｔｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｏｌｅｓｉｎｒａｐｉｄｌｙｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅｐｈｏｔｏ￣ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｎｅｒｇｙｄｉｓｓｉｐａｔｉｏｎａｎｄｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＢｏｔａｎｙꎬ２０１３ꎬ６４(６):１６４９－１６６１. [５]㊀ＰＯＧＳＯＮＢＪꎬＲＩＳＳＬＥＲＨＭ.Ｇｅｎｅｔｉｃｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆｃａｒｏｔｅ￣ｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｈｉｌｏｓｏｐｈｉｃａｌＴｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅＲｏｙａｌＳｏｃｉｅｔｙｏｆＬｏｎｄｏｎ.ＳｅｒｉｅｓＢꎬＢｉｏｌｏｇｉ￣ｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０００ꎬ３５５(１４０２):１３９５－１４０３. [６]㊀ＴＩＡＮＬꎬＭＡＧＡＬＬＡＮＥＳ￣ＬＵＮＤＢＡＣＫＭꎬＭＵＳＥＴＴＩＶꎬｅｔａｌ.Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆβ￣ａｎｄɛ￣ｒｉｎｇｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ２００３ꎬ１５(６):１３２０－１３３２. [７]㊀ＴＩＡＮＬꎬＤＥＬＬＡＰＥＮＮＡＤ.Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｓｅｃｏｎｄｃａ￣ｒｏｔｅｎｏｉｄβ￣ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｉｏｎ￣ｓｈｉｐｔｏｔｈｅＬＵＴ１ｌｏｃｕｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙꎬ２００１ꎬ４７(３):３７９－３８８.[８]㊀焦芳婵ꎬ曾建敏ꎬ吴兴富ꎬ等.烟草β￣胡萝卜素羟化酶基因的特征分析[Ｊ].分子植物育种ꎬ２０１５ꎬ１３(８):１８３１－１８３７.㊀ＪＩＡＯＦＣꎬＺＥＮＧＪＭꎬＷＵＸＦꎬｅｔａｌ.Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆβ￣ｃａｒｏｔｅｎｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｇｅｎｅｉｎＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ.[Ｊ].ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇꎬ２０１５ꎬ１３(８):１８３１－１８３７.(ｉｎＣｈｉｎｅｓｅｗｉｔｈＥｎｇｌｉｓｈａｂｓｔｒａｃｔ)[９]㊀冯唐锴ꎬ李思光ꎬ汪艳璐ꎬ等.南丰蜜橘β￣胡萝卜素羟化酶基因的克隆和序列分析[Ｊ].西北植物学报ꎬ２００７ꎬ２７(２):２３８－２４３.ＦＥＮＧＴＫꎬＬＩＳＧꎬＷＡＮＧＹＬꎬｅｔａｌ.Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆβ￣ｃａｒｏｔｅｎｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍＮａｎｆｅｎｇｏｒａｎｇｅ(ＣｉｔｒｕｓｒｅｔｉｃｕｌａｔｅＢｌａｎｃｏｖａｒ.ｋｉｎｏｋｕｎｉ(Ｔａｎａｋａ)Ｈ.Ｈ.Ｈｕ)[Ｊ].ＡｃｔａＢｏｔａｎｉｃａＢｏｒｅａｌｉ￣ＯｃｃｉｄｅｎｔａｌｉａＳｉｎｉｃａꎬ２００７ꎬ２７(２):２３８－２４３.(ｉｎＣｈｉｎｅｓｅｗｉｔｈＥｎｇｌｉｓｈａｂｓｔｒａｃｔ) [１０]㊀ＢＯＵＶＩＥＲＦꎬＫＥＬＬＥＲＹꎬＨＡＲＬＩＮＧＵＥＡＤꎬｅｔａｌ.Ｘａｎ￣ｔｈｏｐｈｙｌｌｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ:ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ￣ｔｉｏｎｏｆｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓｆｒｏｍｐｅｐｐｅｒｆｒｕｉｔｓ(ＣａｐｓｉｃｕｍａｎｎｕｕｍＬ.)[Ｊ].ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａꎬ１９９８ꎬ１３９１(３):３２０－３２８.[１１]㊀王雅琼ꎬ郑伟尉ꎬ臧运祥ꎬ等.不同品种羽衣甘蓝生长期色素含量变化规律研究[Ｊ].中国农学通报ꎬ２０１３ꎬ２９(１０):１５４－１６１.ＷＡＮＧＹＱꎬＺＨＥＮＧＷＷꎬＺＡＮＧＹＸꎬｅｔａｌ.Ｓｔｕｄｉｅｓｏｎｃｈａｎｇｅｏｆｐｉｇｍｅｎｔｃｏｎｔｅｎｔｓｄｕｒｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｓｔａｇｅｓａｍｏｎｇｓｅｖｅｒａｌｆｌｏｗｅｒｉｎｇｋａｌｅｃｕｌｔｉｖａｒｓ[Ｊ].ＣｈｉｎｅｓｅＡｇ￣ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＢｕｌｌｅｔｉｎꎬ２０１３ꎬ２９(１０):１５４－１６１.(ｉｎＣｈｉｎｅｓｅｗｉｔｈＥｎｇｌｉｓｈａｂｓｔｒａｃｔ)[１２]㊀ＬＩＶＡＫＫＪꎬＳＣＨＭＩＴＴＧＥＮＴＤ.Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｌａｔｉｖｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄａｔａｕｓｉｎｇｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｎｄｔｈｅ４８ 浙江农业学报㊀第３１卷㊀第１期２－ΔΔＣｔ[Ｊ].Ｍｅｔｈｏｄꎬ２００１ꎬ２５(４):４０２－４０８. [１３]㊀ＪＩＡＮＧＷꎬＪＩＮＧＪꎬＧＡＮＧＷꎬｅｔａｌ.Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒ￣ｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｏｖｅｌβ￣ｃａｒｏｔｅｎｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍＬｙｃｉｕｍｂａｒｂａｒｕｍａｎｄｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈ￣ｎｏｌｏｇｙａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０１４ꎬ６１(６):６３７－６４５. [１４]㊀ＤＡＶＩＳＩＯＮＰＡꎬＨＵＮＴＥＲＣＮꎬＨＯＲＴＯＮＰ.Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓ￣ｓｉｏｎｏｆｂｅｔａ￣ｃａｒｏｔｅｎｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｅｎｈａｎｃｅｓｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅꎬ２００２ꎬ４１８(６８９４):２０３－２０６. [１５]㊀冯唐锴ꎬ李思光ꎬ罗玉萍ꎬ等.植物β￣胡萝卜素羟化酶研究进展[Ｊ].生物技术通报ꎬ２００７(ｌ):５４－５８.ＦＥＮＧＴＫꎬＬＩＳＧꎬＬＵＯＹＰꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆβ￣ｃａｒ￣ｏｔｅｎｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ[Ｊ].ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎꎬ２００７(ｌ):５４－５８.(ｉｎＣｈｉｎｅｓｅｗｉｔｈＥｎｇｌｉｓｈａｂｓｔｒａｃｔ)[１６]㊀ＹＡＮＪꎬＫＡＮＤＩＡＮＩＳＣＢꎬＨＡＲＪＥＳＣＥꎬｅｔａｌ.Ｒａｒｅｇｅｎｅｔ￣ｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎａｔＺｅａｍａｙｓＣｒｔｒｂ１ｉｎｃｒｅａｓｅｓｂｅｔａ￣ｃａｒｏｔｅｎｅｉｎｍａｉｚｅｇｒａｉｎ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２０１０ꎬ４２(４):３２２－３２７.(责任编辑㊀张㊀韵)５８王玉书ꎬ等.羽衣甘蓝β￣胡萝卜素羟化酶基因的克隆及表达分析。
BOP基因的克隆及鉴定
Bop基因克隆摘要：以pUC18质粒为载体，bop基因为目的基因，通过PCR扩增出含目的基因，将克隆载体pUC18和bop基因经限制性内切酶酶切后，在T4DNA接酶连接下，形成重组质粒并转化入大肠杆菌DH5a。
通过氨苄青霉素平板筛选出抗性转化子，对重组子进行PCR和酶切，电泳鉴定检测完成了bop基因额的克隆。
关键词：基因克隆；PCR；BOP基因第一章1.前言1.1 基因工程狭义上仅指基因工程。
是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传，表达出新产物或新性状。
重组DNA分子需在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为分子克隆（Molecular Cloning）或基因克隆（Gene Cloning）。
广义上包括传统遗传操作中的杂交技术、现代遗传操作中的基因工程和细胞工程。
是指DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术：基因重组、克隆和表达的设计与构建（即DNA重组技术）；下游技术：基因工程菌（细胞）的大规模培养、外源基因表达产物的分离纯化过程。
广义的基因工程概念更倾向于工程学的范畴。
广义的基因工程是一个高度的统一体：上游重组DNA的设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想；下游过程则是上游重组蓝图的体现与保证。
---基因工程产业化的基本原则。
基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞或基因工程生物体的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型。
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Bop基因克隆摘要：以pUC18质粒为载体，bop基因为目的基因，通过PCR扩增出含目的基因，将克隆载体pUC18和bop基因经限制性内切酶酶切后，在T4DNA接酶连接下，形成重组质粒并转化入大肠杆菌DH5a。
通过氨苄青霉素平板筛选出抗性转化子，对重组子进行PCR和酶切，电泳鉴定检测完成了bop基因额的克隆。
关键词：基因克隆；PCR；BOP基因第一章1.前言1.1 基因工程狭义上仅指基因工程。
是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传，表达出新产物或新性状。
重组DNA分子需在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为分子克隆（Molecular Cloning）或基因克隆（Gene Cloning）。
广义上包括传统遗传操作中的杂交技术、现代遗传操作中的基因工程和细胞工程。
是指DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术：基因重组、克隆和表达的设计与构建（即DNA重组技术）；下游技术：基因工程菌（细胞）的大规模培养、外源基因表达产物的分离纯化过程。
广义的基因工程概念更倾向于工程学的范畴。
广义的基因工程是一个高度的统一体：上游重组DNA的设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想；下游过程则是上游重组蓝图的体现与保证。
---基因工程产业化的基本原则。
基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞或基因工程生物体的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型。
从实质上讲，基因工程的定义强调了外源DNA分子的新组合被引入到一种新的寄主生物中进行繁殖。
这种DNA分子的新组合是按工程学的方法进行设计和操作的，这就赋予基因工程跨越天然物种屏障的能力，克服了固有的生物种（species）间限制，扩大和带来了定向改造生物的可能性，这是基因工程的最大特点。
基因工程包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构成新的重组的DNA，然后送到受体生物中去表达，从而产生遗传物质的转移和重新组合。
[1]1.2 PCR技术基本原理PCR技术的基本原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依靠于DNA聚合酶的酶促合成反应。
DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。
在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。
PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。
类似于DNA的自然复制过程，其特异性依靠于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作预备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保存复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保存复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
[2] 1.3 感受态细胞感受态细胞（competent cell）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。
主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。
由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。
将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。
[2]1.4 酶切鉴定实验在重组质粒构建，重组质粒pUC18-bop采用BamH I、Hand Ⅲ双酶切鉴定，在对双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像图中可以看到所得条带都不是很清晰，有拖尾现象出现。
这可能由于未待胶完全凝固时加样了；重组质粒条带有明显拖带出现，这与质粒提取，提纯操作有关！但可以看出其分子量同bop 基因分子量（1200bp左右）一至。
酶切能进一步证实bop基因的成功克隆。
但就实验设计来看，为更清晰看到双酶切前后及PCR扩增片段与bop基因区别，笔者建议将克隆载体pUC18质粒，PCR扩增产物，酶切后的克隆载体及目的基因在一块琼脂糖凝胶上电泳。
【2】2实验材料与仪器2.1实验材料2.1.1 生物材料大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α,克隆载体pUC 18由武汉大学东湖分校生物技术实验室保存，含bop基因的pUC 19质粒的大肠杆菌由武汉大学东湖分校金卫华老师提供。
2.1.2 生化材料T4DNA连接酶，BamH I及HindⅢ核酸内切酶等均购自大连Takara公司，氨苄青霉素（Amp）购自上海生工公司，Marker购自Fermentas公司，电泳用琼脂糖及细菌培养用琼脂均购自晶美公司。
DNA回收试剂盒购自MBI公司。
2.2主要实验试剂2.2.1 LB液体培养基：精确称取胰化蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，NaCI lg放入烧杯内，加蒸馏水充分溶解后定容至100mL，121℃高压下蒸汽灭菌20min。
储存于4℃备用。
2.2.2 LB固体培养基：取配置好的未高压蒸汽灭菌的LB液体培养基50ml加入细菌培养用琼脂(Bacto－Agar)0.5g，混匀后121℃高压蒸汽灭菌20min。
储存于4℃备用。
2.2.3 碱性裂解液Ⅰ：精确称取葡萄糖0.495g，Tris碱0.0303g，二水乙二胺四乙酸二钠0.146g与小烧杯中，用蒸馏水充分溶解后定容至50ml。
2.2.4 碱性裂解液Ⅱ：精确移取0.2mol/L的NaOH 20μL，1％的SDS 20μL，加蒸馏水160μL混匀。
(注意:0.2mol/L的NaOH和1％的SDS分开配,临时混合用)2.2.5 碱性裂解液Ⅲ：精确移取5mol/L的乙酸钾30ml，冰乙酸5.8ml，加入蒸馏水并定容至50ml。
2.2.6 上样缓冲液：精确称取溴酚蓝2.5mg，加入60％甘油0.6ml，50％EDTA0.5g，摇匀后加蒸馏水至1ml。
2.2.7 0.1mol／L CaCl2：精确称取1.19无水CaCl2定容至100ml，121℃，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，4"C保存。
2.2.8 灭菌蒸馏水：蒸馏水水分装后121℃高压蒸汽灭菌后，4℃保存备用。
2.3主要实验仪器洁净工作台（等级：100级，上海博迅实业有限公司医疗设备）高速离心机（D-37520，sigma）电子天平（JY2002，上海衡平仪器仪表厂）分析天平（AUY120,SHIMADZU）数显鼓风干燥箱（GZX-9240 MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）MJ-300BS-Ⅱ霉菌培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）超速离心机（D-78532 Tuttlingen，Hettich）微量加样枪凝胶成像系PCR仪恒温振荡器（CHA-S，国华企业）稳压稳流电泳仪（JY-600PJ，北京君意东方）调速多用振荡器（HY-4，国华电器有限公司）美的电冰箱（美的集团电冰箱制造有限公司）3实验方法3.1菌种活化（1）LB培养基的配置称取蛋白胨1g、氯化钠1g、酵母提取物0.5g放于烧杯中，加适量蒸馏水搅拌溶化并定容至100ml。
完全溶解后，分装到两个三角瓶中，每个三角瓶中各50ml。
向其中一个三角瓶中加入1.2g琼脂粉后，塞上棉塞，并用报纸和棉线扎紧瓶口。
（2）灭菌将枪头、50mlLB固体培养基、50mlLB液体培养基、装有牙签的培养皿、10支试管、四个培养皿放入灭菌锅121℃灭菌20min.（3）无菌接种在无菌操作台中，取出LB固体培养基，待其温度降至50℃左右（不烫手）,加入50μL氨苄青霉素.混匀后，倒三个平板。
培养基凝固后，分别划线接种含PUC18 、PUC19质粒的大肠杆菌菌种，编号1、2。
平板倒置放在37℃培养箱中培养过夜。
（4）挑单菌落在无菌操作台中，取出LB液体培养基，待其温度降至50℃左右（不烫手）,加入50μL氨苄青霉素.充分混匀后，分装于10支试管中，每支试管各5ml。
用镊子取无菌牙签挑取1、2平板上的单菌落，接种于于5ml LB含氨卞青霉素（0.1g/ml）的液体培养基内，37℃，250rpm，恒温摇床振荡增殖培养过夜。
3.2 SDS碱裂解法制备质粒（1）细菌收集用微量移液枪各取1mL两种菌液至1.5ml EP管内做好标记，6 000 rpm离心3min，弃尽上清液。
再次取样1mL菌液至同一EP管内，重复离心，留沉淀。
（2）细菌裂解向上述沉淀中加入100μL冰预冷的碱裂解液Ⅰ，强烈振荡混匀（用移液枪吹打）至菌悬液完全浑浊；加入200μL新配置的碱裂解液Ⅱ于菌悬液中，盖严管盖，轻轻颠倒混匀4-5次，但切勿振荡，冰浴约5min，至瓶盖下出现粘稠丝状物为止；再加入150μL预冷的溶液Ⅲ，盖严管盖，温和振荡数次，冰浴5min。
（3）提取质粒10 000rpm 室温离心5min，取上清至一个新的无菌的1.5mL EP管中。
（4）质粒纯化向上述上清中加入等体积酚氯仿(1:1)，振荡混匀，10000rpm离心5min，上清转移至另一个EP管中；将酚氯仿的混合物换成等体积的氯仿，振荡混匀，10000rpm离心5min，上清转移至另一个EP管中；向上述上清中加入等体积的异丙醇，轻微振荡后摇匀，室温静置5min；10000rpm离心10min，去上清，向EP管中加入70%酒精200μl，盖紧管口，颠倒几次，10 000rpm离心2min，弃去上清液，在50℃烘箱中烘干至沉淀变透明。
重复以上操作，再制备等量两种菌种的纯化质粒各一支，分别标记PUC18 、PUC19。