第十二章 基因工程育种

克隆(clone): 作名词时，指含有某目的DNA片段 的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系。 作动词时，是指基因的分离与重组过程。
一、基因工程在微生物育种中的应用
（一）通过基因工程方法生产药物
1. 治疗用药物：如干扰素、胰岛素、白细胞介素等；
2. 疫苗：甲肝疫苗、乙肝疫苗等； 3. 单克隆抗体及诊断试剂：前列腺磷酸酶等；
2. 带有单链噬菌体复制起点的质粒载体
如M13噬菌体。
3. 带有噬菌体启动子的质粒载体 4. 可对重组体进行正选择的质粒载体
如编码tetr的质粒载体。
（三）常用质粒载体
1. pBR322：应用最多。 2. pUC18 、pUC19 3. pUC118 、pUC119 4. pSP64、 pSP65、 pGEM-3Z、 pGEM-3Zf(-)、 pGEM- 4、 pGEM- 4Z 5. πAN13 6. Bluescript M13+、M13－
2. 能源：石油二次开采、纤维素分解、太阳能转换.
3. 环保：微生物生态种群. 4. 信息：蛋白芯片、基因芯片.
（二）第二次农业大革命
1. 生物农药：蛋白类杀虫剂、抗广谱虫害植物； 2. 农作物品种改良；高营养、长保存、抗环境压力、 花卉颜色与型状； 3. 畜牧业；高蛋白乳汁、鱼生长激素、饲料利用率; 4. 生物肥料：生物固氮 。
3. 载体本身的分子量要尽可能地小，便于多拷贝，便于与较 大的目的基因结合。 4. 载体上最好有两个以上容易检测的遗传标记； 5. 载体上应具有2个以上的限制性内切酶的单一切点。
一、质粒载体
（一）质粒载体的选择标记
四环素(tetr)；氨苄青霉素(ampr)；氯霉素(catr)；卡 那霉素（kanr）。
基因制药 基因治疗
医学方面的应用前景
基因诊断
基因克隆 基因芯片
基因工程药物的高回报
碱性成纤维细胞生长因子 红细胞生成素 白细胞介素-2 巨细胞粒细胞集落刺激因子 胰岛素 231 元/μg 1072 元/μg 410 元/μg 1960 元/μg 10.2 元/μg
四、基因工程的负面影响
◆现代战争狂人、恐怖主义者利用转基因技
（3）延伸：温度升至72 ℃ ，DNA聚合酶以4种dNTP为
底物，在引物的3’-OH上，合成与模板互补的
DNA新链。
PCR反应的基本原理
（三）逆转录法
逆转录法就是先 分离纯化目的基因的 mRNA，再反转录成 互补DNA，然后进行 互补DNA的克隆表达。
AAAA
逆转录酶
AAAA TTTT
碱水解
TTTT
目的基因 载体
限制性内切酶 限制性内切酶
T4 DNA连接酶 15º C
重组体
载体自连
目的基因 自连
3. 同聚物加尾连接
在末端转移酶(terminal transferase)的作
用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出
粘性末端，再进行粘端连接。
目的基因
5´ 3´ 5´ 限制酶或机械剪切 3´ 5´ λ-核酸外切酶 5´ 末端转移酶 + dATP A(A)nA 3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´
T4 DNA连接酶 15º C
载体自连
重组体
目的基因自连
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
不同限制酶切位点的连接
Eco RⅠ切割位点
GAATTC CTTAAG
Bg lⅡ切割位点
AGATCT TCTAGA
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA
EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
一、DNA的制备
（一）质粒DNA的制备
1. 细菌培养物的生长
2. 质粒DNA的纯化
3. 细菌染色体DNA的制备
二、目的基因的产生与分离
1. 聚合酶链式反应：PCR法 2. 逆转录法：建立cDNA文库 3. 从基因所在的生物体直接取得：限制性内切 核酸酶 。 4. 化学合成法：DNA合成仪。
（一） PCR
中，让外来的目的基因在受体细胞中进行正常的复制和
表达，从而获得目的产物或改变物种特性。
主要步骤包括：
1、目的基因的获得（ DNA片段的 取得） 2、重组体DNA（ DNA片段和载体 的连接） 3、外源DNA片段引入受体细胞—— 基因克隆和基因文库
切
接 转
4、目的基因的表达和重组体的筛选
检
三、基因工程的研究意义
AATTC G A TCTAG
AATTC G GATCT A
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+
AATTC G
A TCTAG
T4 DNA连接酶 15º C
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA
配伍末端的连接 情况和同一限制酶 切位点连接相似。
重组体
2. 平端连接
适用于：（1）限制性内切酶切割产生的平端 （2）粘端补齐或切平形成的平端
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
人工化学合成的限制
1、不能合成太长的基因，50-60个碱基对；
2、人工合成碱基对时，遗传密码的简并会为 选择密码子带来很大的困难； 3、费用较高。
二、克隆载体的选择和构建 三、外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接 方式：(1) 同一限制酶切位点连接 (2) 不同限制酶切位点连接
人 工 接 头 及 其 应 用
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
杂交链中的mRNA链，然后以互补DNA第一链为模板合 成第二链，并用核酸酶S1专一性切除单链DNA。
4、互补DNA克隆
根据重组后插入的互补DNA是否能够表达、能否经 转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为表达型载体和非 表达型载体。
（三）从基因所在的生物体直接取得
鸟 枪 法
（四）化学合成法
其先决条件是已知目的基因的核苷酸序列，或已知 蛋白质的氨基酸序列，按相应的密码子推导出DNA的碱 基序列。用化学方法合成目的基因不同部位的两条链的 寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘末端的DNA双 链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使 连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。
二、λ噬菌体载体
噬菌体载体只适合作外源DNA小片段的载体。
（一） λ噬菌体载体的特点
（二） 常用λ噬菌体载体
1. λgt11 2. Charon系列载体
三、柯斯质粒载体
专门用来克隆大DNA片段的人工构建的新载体。
第三节 基因工程所用的酶
一、限制性内切核酸酶 能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其附近 切割双链DNA的一类内切酶。
（二）通过基因工程方法提高菌种的生产能力
（三）通过基因工程方法改进传统发酵工艺 （四）通过基因工程方法提高菌种抗性 （五）构建超级工程菌应用与环境保护
二、基因工程原理和步骤
基因工程是用人为的方法将所需的某一供体生物的
遗传物质DNA分子提取出来，在离体条件下进行“切
割”，获得代表某一性状的目的基因，把该目的基因与 作为载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞
全球商业化转基因作物的概况
◆ 种植面积：全球转基因作物的种植总面积为4420万公顷
◆ 地区分布：全球主要的种植大国美国、阿根廷、加拿大、 澳大利亚的种植面积占全球总面积的 99％，其中美国68 ％、阿根廷 23 ％、加拿大 7 ％、澳大利亚 1 ％，余下的 1 ％为墨西哥、西班牙、法国和南非等国家
◆ 品种分布比例：大豆约占58％，玉米约占23％，棉花约 占12％，油菜籽约占6％，其它为1％
（三） 第二次医学大革命：
1. 分子病：基因治疗遗传病、心脑血管病、糖尿病、 癌症过度肥胖综合症、老年痴呆症、骨 质疏松症 。 2. 抗衰老：端粒酶编码基因，基因疗法，补充突变 基因原始产物、更换突变基因
DNA聚合酶Ⅰ
SI核酸酶
1、mRNA的纯化：
可以用亲和层析法将mRNA从细胞总RNA上分离 出来，可得到纯度较高的mRNA。
2、互补DNA第一链的合成 mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸序列， 可用寡聚脱氧胸苷酸为引物，在逆转录酶的催化 下，开始互补DNA的合成。
3、互补DNA第二条链的合成
先用碱解或核酸酶酶解的方法除去互补DNA-mRNA
术制造难以制服的病原体和生物毒剂。
◆转基因的超级细菌、病毒一旦从实验室逃
逸。 给人类带来难以预测的危害。
第二节
基因工程载体
载体：是携带目的基因并将其转移至受体细胞内复制 和表达的运载工具。作为载体DNA分子，应该具备以下 一些基本性质：
1. 在宿主细胞中具有自主复制和表达的能力；
2. 能与外来DNA分子片段结合而又不影响本身的复制能力；
载体DNA
限制酶 3´ 5´ λ-核酸外切酶 5´ 末端转移酶 + dTTP 3´
3´ 5´
3´
3´ A(A)nA
3´ T(T)nT
5´
5´
T(T)nT 3´
T4 DNA连接酶 15º C
重组体
4. 人工接头(linker)连接
由平端加上带有新的酶切位点的接头，再用
限制性酶切产生粘性末端，而进行粘端连接。
三、依赖于DNA的RNA聚合酶
1. SP6噬菌体RNA聚合酶 2. T3和T7噬菌体RNA聚合酶
四、连接酶、激酶及磷酸酶 五、核酸酶 1. BAL31核酸酶 2. S1核酸酶 3. 核糖核酸酶A 4. 核糖核酸酶T1 5. 脱氧核糖核酸酶Ⅰ 6. 外切核酸酶Ⅲ 7. λ噬菌体外切核酸酶
第四节 基因工程的主要步骤
（二）质粒载体的发展
质粒构建的发展趋势主要是调整载体的结构，提高载 体的效率。 （1）将载体的长度减至最小； （2）增加质粒载体内有用的限制酶切点的数目，而且 使分布更加合理； （3）在质粒中引入多种用途的辅助序列，使它们可以 用于以下目的：
1.可用组织化学方法鉴定重组体的质粒载体
如pUC质粒，可以编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片段。
供体细胞
目的基因
载体 重组DNA分子
受体细胞 源自文库化细胞
转基因动物 转基因植物 冶金 、环保 基因治疗 多肽药物 (畜 牧业、 渔业 (农 业、林 业 轻工 、食品 基因诊断 疫苗、抗体 生 物反应 器) 生 物反应 器)
基因工程(gene engineering)常和以下名称混用
遗传工程(genetic engineering); 基因克隆(gene cloning); 分子克隆(molecular cloning); 基因操作(gene manipulation); 重组DNA技术(recombination DNA technique)
第十二章 基因工程育种
第一节
广义的基因工程育种概念：
概述
包括所有利用DNA重组技术将外源基因导入到微 生物细胞，使后者获得前者的某些优良性状或者利用 后者作为表达场所来生产目的产物。 真正意义的微生物基因工程育种：
指的是哪些以微生物本身为出发菌株，利用基因 工程方法进行改造而获得的工程菌，或是将微生物甲 的某种基因导入到微生物乙中，使后者具有前者的某 些性状或表达前者的基因产物而获得的新菌种。
概括地讲，其意义体现在以下三个方面：
1.大规模生产生物分子；
2.设计构建新物种；
3. 搜集、分离、鉴定生物信息资源。
（一）第四次工业大革命：
1980年11月15日，美国纽约证券交易所开盘的20分 钟内，Genentech公司的新上市股要从3.5 $上至89$， 胰岛素基因表达 . 1. 轻工食品：氨基酸、助鲜剂、甜味剂、淀粉酶、纤维 素酶、脂肪酶蛋白酶、生物拆分混旋体.
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶 序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延 伸三个基本反应步骤构成：
PCR的反应体系
模板DNA 引物
4种dNTP
Taq DNA聚合酶
含Mg2+的缓冲液。
PCR的基本反应步骤及原理
（1）变性：加热至95 ℃，使模板DNA解开成单链； （2）退火：温度降至适宜，使引物与模板互补结合；
如EcoR I的切割方式：
5' G↓AATTC 3' 3' CTTAA↑G 5'
二、DNA聚合酶
1. 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
2. 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）
3. T4噬菌体DNA聚合酶 4. T7噬菌体DNA聚合酶 5. Taq噬菌体DNA聚合酶及Ampil TaqTM DNA聚合酶 6. 反转录酶 7. 末端转移酶