发酵工程 第二章 工业微生物
发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
华根霉 ( Rhizopus chinentis )
酿酒所必须的重要霉菌,也是 酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌 种。
2、毛霉 ( Mucor )
鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 能糖化淀粉且能生成少量酒精;能产生
6、醋酸菌 (Acetobacter)
➢ 不形成芽孢,G-,好气性 ➢ 可生产醋酸.
7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ➢ 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌.
8、短杆菌 (Brevibacterium)
氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种,也是酶法 合成生产辅酶A的菌种.
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
5、假丝酵母 (Candida)
➢能形成假丝,液体培养时能 形成浮膜。 ➢可生产SCP、甘油、脂肪酶。
6、红酵母 (Rhodotorula)
➢有明显的红色或黄色色 素,很多种因生荚膜而形 成粘质状菌落。 ➢可由菌体提取大量脂肪、 -胡萝卜素。
7、棉病针孢酵母 ( Nematspora gossypii )
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
与酿酒酵母相似,主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵 棉子糖和蜜二糖。
3、汉逊酵母 (Hansenula)
此属酵母多能产生乙酸乙酯,从而增加产品的香 味,可用于酿酒和食品工业。
4、球拟酵母 (Toruiopsis)
此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓 糖、阿拉伯糖;有的能利用烃类生产蛋白质。
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
发酵工程复习总结
第一章绪论传统发酵工程:利用微生物的生长和代谢活动来大量生产人们所需产品的过程理论与工程技术体系。
该技术体系主要包括菌种选育与保藏、菌种扩大生产、代谢产物的生物合成与分离纯化制备等技术集成。
现代发酵工程:是将DNA重组及细胞融合技术、酶工程技术、组学及代谢网络调控技术、过程工程优化与放大技术等新技术与传统发酵工程融合,大大提高传统发酵技术水平,拓展传统发酵应用领域和产品范围的一种现代工业生物技术体系(新一代工业生物技术)。
采用现代工程技术手段,利用天然生物体或人工改造的生物体对原料进行加工,为人类生产有用的产品,或直接把生物体应用于工业生产的过程。
发酵工程发展史:1900以前自然发酵阶段:酿造工业1900—1940 纯培养技术的建立: 固体培养基,纯粹培养1940—1950 通气搅拌纯培养发酵技术的建立: 丙酮丁醇发酵,标志:纯种培养深层发酵生产青霉素1950—1960 诱变技术与代谢控制发酵技术的建立:耗氧发酵实现规模化纯培养发酵1960—1970 开拓发酵原料时期(石油发酵时期)1970年以后进入基因工程菌发酵时期,以及细胞大规模培养技术的全面发展发酵工艺过程:1、菌种以及确定的种子培养基和发酵培养基的组成2、培养基,发酵罐和辅助设备的灭菌3、大规模的有活性、纯种的种子培养物的生产4、发酵罐中微生物最优的生长条件下产物的大规模生产5、产物的提纯、纯化6、发酵废液的处理第二章微生物菌种制备原理与技术工业微生物是生物技术产品生产的关键,而菌种又是工业微生物的核心。
发酵工业常用微生物分类:细菌、放线菌、酵母、霉菌工业微生物获得途径:1、向菌种保藏机构索取有关的菌株,从中筛选所需菌株2、由自然界采集样品,从中进行分离筛选3、从一些发酵制品中分离目的菌株自然界分离微生物的一般操作步骤:标本采集→样品预处理→目的菌富集培养→菌种分离(初筛、复筛)→菌种发酵性能鉴定→菌种保藏目的:高效地获取一株高产目的产物的微生物菌种的退化和防止:菌种退化是指整个菌体在多次接种传代过程中逐渐造成菌种发酵力或繁殖力下降或发酵产物得率低的现象。
发酵工程第二章发酵工业微生物菌种
李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
(一)采样
1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽 土中,以细菌和放线菌为主;富含碳水化合物的 土壤和沼泽地中,酵母和霉菌较多,如一些野果 生长区和果园内。采样的对象也可以是植物,腐 败物品,某些水域等。
新种分离与筛选的步骤
(五)毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的,将其作为 生产菌种应当十分当心,尤其与食品工业有关的菌种, 更应慎重。据有的国家规定,微生物中除啤酒酵母、脆 壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒 性试验外,其他微生物作为食用,均需通过两年以上的 毒性试验。
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
(三)培养分离
尽管通过增殖培养效果显著,但还是处于微生物的混杂
李 先 磊
Fermentation Engineering
生长状态。因此还必须分离,纯化。在这一步,增殖培 养的选择性控制条件还应进一步应用,而且控制得细一 点,好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离 法。
李 先 磊
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新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
李 先 磊
(二)增殖培养 为了容易分离到所需的菌种,让无关的微生物 至少是在数量上不要增加,可以通过配制选择 性培养基,选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制,可选定糖,淀粉、纤维 素,或者石油等,以其中的一种为唯一碳源, 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常 生长,而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样 对下阶段的纯种分离就会顺利得多。
第二章发酵工业微生物菌种ppt课件
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(1) 曲霉属(Asprgillus):曲霉种类繁多、分布 广泛,工业上利用曲霉生产各种酶制剂和有机 (2) 青霉属(Penicillium):j既是使果实腐 酸。如米曲霉( Asp. oryzae)用于酿酒和L败和实物变坏的有害菌,又是青霉素后葡萄 乳酸生产。制酱油用的酱油曲霉以及制造柠檬 糖酸的产生菌。 酸、草酸、葡萄糖酸和糖化酶、酸性蛋白酶、 (3) 根霉属(Rhizopus):用于米酒、黄 果胶酶、单宁酶等的黑曲霉 (Asp. niger)。 酒生产。此外,广泛用作淀粉糖化菌、有机 酸发酵以及甾体转化等许多方面。 (4) 毛霉属(Mucor):产生蛋白酶,有分 解大豆蛋白的能力。腐乳、酱油、转化甾族 化合物。土曲霉:衣康酸
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连续培养菌种的筛选 比生长速率(u):每克菌体每小时增长的 菌体量.u=1/XdX/dt.
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比生长速率u
A B
r
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基质浓度
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限 制 性 基 质
当进行流加时基质浓度<r 时,A菌先被洗出; 当进行流加时基质浓度>r 时,,B菌先被洗出;
培养液
固体培养法
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2.随机分离方法 (1).抗生素产生菌筛选 试验菌的灵敏性,以及与抗生素有关的酶、 酶的抑制剂(例如棒酸)、激活剂、抗体 等建立起来的高灵敏度、专一的检测技术。 (2).药理活性化合物的筛选 (3).生长因子产生菌的筛选 (4).多糖生产菌的筛选 (5).免疫激活剂产生菌的分离
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(3) 乳酸菌:由糖类生成乳酸的一类细菌总称为乳 酸菌,有乳链球菌和乳酸杆菌之分,主要用来制 造乳制品。凡发酵产物中只有乳酸者,称为同型 乳酸发酵;凡发酵产物中除乳酸外还有乙酸等和 CO2者,称为异型乳酸发酵。肠膜状明串珠菌属 于乳酸菌族,是制药工业生产有旋糖酐的重要菌。 (4) 大肠杆菌:工业上利用大肠杆菌的谷氨酸 脱羧酶,进行谷氨酸定量分析。还可以利用 大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸和缬氨酸等。 医药方面用它制造治疗白血症的天冬酰胺酶。 另外,在研究细菌遗传变异方面,以及构建 基因工程菌时,大肠杆菌是理想的研究材料。
微生物菌种
虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展,但诱变育种仍是目 前广泛使用的育种手段。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
原始菌株(出发菌株)
活细胞计数 诱变剂处理 活细胞计数 中间培养
突变株分离
诱变预备处 理
初筛 复筛 生产性能试验
工业微生物来源
想菌种保藏机构索取有关的菌株,从中筛选所需
菌株。
从自然界采集分离。
从一些发酵制品中分离目的菌株。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
微生物菌种的选择性分离
工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料,简单的培养基,大量高效地合 成产物; 有关合成产物的途径尽可能地简单,或者说菌种改造 的可操作性要强;
分离耐高渗透压酵母菌,可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
目的微生物富集的一些基本方法
让目的微生物在种群中占优势,使筛选变 富集的目的: 得可能。
富集的三种方案:
定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的
条件(加热、膜过滤等),进行培养。
当不可能采用定向培养时,则可设计在一个分
能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈,圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。
分离水解酶产生菌时较多采用,如蛋白酶、淀粉酶、 脂肪酶、核酸酶等;
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌 土壤经巴氏消毒,以减少不产芽孢的微生物;然 后铺在pH8-9的琼脂培养基(含有均匀的不溶性蛋白 质)表面;碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性 蛋白质,产生一透明圈。
遗传性能要相对稳定;
不易感染它种微生物或噬菌体; 产生菌及其产物的毒性必须考虑(在分类学上最好与 致病 菌无关); 生产特性要符合工艺要求。
《发酵工程》02 工业发酵菌种选育
(2)增殖培养
➢目的: 富集目的微生物,让目的微生物在种群中 占优势,使筛选变得可能。
富集方法 1、养分 3、培养时间
2、pH条件 4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段,培养(固体、 液体;分批连续)后使目的微生物在种群中占优势。
(3)纯种分离
•
尽管通过增殖培养效果显著,但还是处于微
真菌(青霉素、头孢等)
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
问题:生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸?
微生物(包括动、植物细胞)几乎可以生产 我们所需的一切产品,但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品,只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例: 礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微 生物中,发现了三种有潜力的新抗生素。
• 细菌(bacteria):常用的有枯草芽孢杆菌、 醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。
短杆菌:GA、Gln、lys…… 枯草芽孢杆菌:淀粉酶(BF7658)、碱性蛋白酶等 地衣芽孢杆菌:HASS(耐高温α-淀粉酶) αAmylase 苏云金芽孢杆菌短:杆B菌T生物农药…棒…状杆菌 梭状芽孢杆菌:丙酮、丁y酸ea等sts的发酵
啤棒酒状酵杆母菌
• 酵母菌(yeast):属单细胞真核生物,主 要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的 有:啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。
啤酒酵母:酿酒、辅酶类物质的发酵
酒香酵母:酿酒
汉逊酵母:酿酒,用于乙酸乙酯的发酵
假丝酵母:单细胞蛋白生产,石油发酵
霉菌
• 霉菌(mould):喜偏酸性环境。可用于生产多种 酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。
黑曲霉:柠檬酸工业、酿酒业、糖化酶 黄曲霉:酱油生产,面酱 青霉菌:青霉素的生产 红曲霉:红曲制造,南方红曲酒(女儿红);红色;豆腐 乳 赤霉菌:赤霉素的生产
发酵工程 (第2章)
(b)营养缺陷型的意义 在营养缺陷型突变菌株中,生物合成途径中的 某一步发生了酶缺陷,合成反应不能完成,末端产 物不能积累,因此末端产物的反馈调节作用被解除。 只要在培养基中限量加入所要求的末端产物,克服 生长障碍,就能使中间产物积累。 营养缺陷型突变株具有明显的遗传标记,在杂 交育种中作为出发菌株,有利于杂交重组的分析。 营养缺陷型突变株具有明显的遗传标记,可以 作为基因工程中的受体菌,检出克隆基因的表达。
(二)微生物菌种的选育
1、自然选育 不经过人工处理,利用微生物自然突变进行 菌种选育的过程称为自然选育。 自然选育简单易行,可以达到纯化菌种,防 止菌种退化,稳定生产,提高产量的目的。 自然选育的一般程序是将菌种制成菌悬液, 用稀释法在固体平板上分离单菌落,再分别测 定单菌落的生产能力,从中选出高水平菌种。
(2)抗肿瘤药物产生菌的分离。 原理一(p21): 临床上抗肿瘤药物大部分是直接作用于核酸或 抑制核酸生物合成的物质,由于微生物和人的核 酸结构与生物合成方式有许多共同之处,所以大 部分抗肿瘤药物也具有抗菌活性,据此发展出利 用微生物筛选作用于DNA的抗肿瘤药物的方法。 <1> 生化诱导分析法(BIA) <2> SOS显色法
c 、不形成孢子只通过芽殖的“假酵母”属半知菌。
工业上常用的有:啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等
4、霉菌(mould)
霉菌非系统演化分类的单元。凡生长在营养 基质上形成绒毛状,网状或絮状菌丝的真菌统 称霉菌。 工业上常用的霉菌有: 藻状菌纲:根霉,毛霉,犁头霉 子囊菌纲:红曲霉 半知菌类:曲霉,青霉。
所有菌都长
完全培养基上 长成单孢菌落 基本培养基 完全培养基 轻压在绒布上 无菌丝绒布 橡皮箍 接上所有菌落的绒布 转印在新鲜 的培养基上
发酵工程
第一章绪论发酵工程:指在最适发酵条件下,在发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的技术。
发酵工程包括代谢工程和发酵工艺两个主要内容。
发酵工程的四个转折点:①天然发酵时代(1000-4000年前)②纯培养时期(第一个转折点,1680年-1932年)③通气搅拌技术时期(第二个转折点,第二次世界大战时期)④代谢控制发酵技术(第三个转折点,1956年氨基酸发酵)⑤现代生物技术时期(第四个转折点)基本问题:过程放大和优化。
第二章工业微生物菌种的来源工业化生产菌种的要求?答:①能够利用廉价的原料,简单的培养基,大量高效地合成产物;②菌种改造的可操作性强;③遗传性相对稳定;④不易感染它种微生物或噬菌体;⑤产生菌及其产物的毒性必须考虑;⑥生产特性要符合工艺要求。
从自然界中分离出发菌株的环节:土样的采取→预处理→培养→菌落的选择→产品的鉴定出发菌株的分离方法:①定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件,进行培养,一般从底物、 pH、培养时间、培养温度等方面考虑;②当不可以采用定向培养时,则设计一个分类学中分离的方法;③不能提供任何有助于筛选产生菌的信息时,通过随机分离的办法。
第三章发酵培养基发酵培养基与微生物培养基的不同之处?答:发酵培养基除了满足菌体的生长外还必须促进产物的形成。
①培养基能够满足产物最经济的合成;②发酵后所形成的副产物少;③原料来丰富,价格低,性能稳定,便于储藏。
wk_ad_begin({pid : 21});wk_ad_after(21, function(){$('.ad-hidden').hide();}, function(){$('.ad-hidden').show();});④具有满足工艺要求,如不影响通气、提取、纯化等。
培养基按其组成物质的纯度、状态、用途可分为三大类型:①按纯度分:合成培养基、天然培养基。
②按状态分:固体培养基、半固体培养基、液体培养基。
第二章 微生物菌种选育
• 优良的菌种是发酵工业的基础和关键,是 显著改善和提高产品种类、产量以及质量 的先决条件。 • 菌种选育,就是要利用微生物的遗传变异 的特性,采用各种手段,改变菌种的遗传 性状,使其符合工业生产的需要。
本章主要内容
• 第一节 微生物发酵工业的菌种类型及来源 • 第二节 微生物发酵高产菌种选育 • 第三节 菌种的退化和菌种保藏
土样的采集方法
使预被分解的物质成为唯一的碳源或氮源 pH7.0~7.5适于细菌和放线菌,pH4.5 ~6适于霉 菌和酵母 40℃利于放线菌孢子萌发,却不利于细菌生长 限制通入氧气使厌氧菌数量增加
采用平板划线法和稀 通过压力(高温、高压、抗生素)使非目的的 释法,以时间为变量, 类群比例减少 进行纯种分离
从一些发酵制品中分离目的菌株,如酒醪中 分离淀粉酶或糖化酶的产生菌,从酱油中分 离蛋白酶产生菌,从噬菌体污染的发酵液中 分离抗噬菌体的发酵菌株等。
三、菌种微生物的选择性分离
• 菌株的分离和筛选分为以下几步:
采 样 富 集 分 离 筛 选
各种生境下的土壤是 微生物菌种最全面的 来源 人为控制条件使所期 待的目的菌种占据优 势
是单产高的营养缺陷型突变菌株或调节突变菌株或野生菌株,最 好还是抗噬菌体能力强的菌株
菌种纯粹,不易变异退化,以保证稳定性
菌种不是病原菌,不产生任何有害的生物活性物质和毒素(包括 抗生素、激素、毒素等),以保证安全
类型:包括细菌、酵母菌、霉菌和放线菌等类群,还有担子菌及藻类等
一、工业发酵常见的微生物种类
担子菌就是人们常说的菇类(mushroom)微生物。
担子菌资源的利用正引起人们的重视,如多糖、 橡胶物质和抗癌药物的研发。
6、藻类(alga)
发酵工程第2章2 菌种的选育与保藏
2.3传代保藏
将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代,然后在一定的 生长温度下生长和保存的传代保藏方法。
可用于实验室中若干菌种的保藏。 此法最为简单和经济,且不要求任何特殊的设备。 但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变。
2.3 传代培养法
实验原理:保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基(用于 厌氧细菌)培养好后,置4C˚冰箱中存放,定期 进行传代培养、再存放。 可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌液体 石蜡来进一步延长保存期。
冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂,目前国内常 用脱脂乳和蔗糖,国外尚有运用动物血清等。
大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久 而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻 保藏,便于运输。
培养物的冻干过程
冷冻真空干燥操作流程
配制保护剂 灭菌
菌种 培养 制备菌悬液
分装安培瓶 预冻
真空干燥 测定水分
操作方法 1、斜面保藏法 将菌种转接在适宜固体斜面培养基上,待其充分生长后,
用牛皮纸将棉塞部分包扎好(棉塞换成胶塞效果更好),置 4C˚冰箱中包藏。
保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保 存2-4个月移种一次,酵母菌间隔两个月,普通细菌一个月, 假单胞菌两周传代一次。
此法优点是操作简单、使用方便,缺点是保藏时间短、易 被污染。
加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养物的 稳定性。
在一给定温度下通过对高温下短期活力丧失程度检 测,可以用来预测嗜酸乳杆菌的稳定性。
成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括:在 保藏6个月、1年或更长时间后存活百分率(或存活单 位)、细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征 应在菌种保藏前后保持同一性,以及实验室中、中 试车间中和生产发酵中产品滴度的稳定性,后者极 为重要。
【发酵工程】余龙江版-第2章-发酵工业菌种
培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。 另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料”,如
无菌的植物组织或土壤浸出液。 通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、
中温菌和嗜高温菌。
次代培养及纯化步骤
1. 采样
(2) 采样对象
土壤、水、空气及枯枝落叶等,以土壤为主。
从土壤中采样要考虑土壤的以下特点:
① 有机质含量和通风状况
耕地、菜园 山坡上的森林
(有机质丰富、通气保水性能好)——细菌、放线菌
(有机质丰富、阴暗潮湿)——霉菌、酵母菌
沙土、无植被土壤、新开垦的生土、贫瘠的土地
——微生物少
② 取样的土层深度:5-25cm
3. 富集培养
富集培养的策略
(2)控制培养条件
➢ 溶氧浓度——好氧/厌氧 ➢ 高温——嗜热微生物 /非嗜热微生物 ➢ PH——嗜酸性/嗜碱性
4. 菌种分离
平板划线分离法 稀释分离法 毛细管分离法 小滴分离法
• 稀释倒 平板法
稀释分离法
• 平板 涂布法
注意:必须要做多个浓度的稀释分离平板。
1. 采样
③ 土壤的酸碱度
偏碱——细菌、放线菌 偏酸——霉菌、酵母菌
④ 土壤的植被状况
葡萄成熟时——根部酵母菌增多
⑤ 地理条件
南方土壤比北方土壤微生物含量多
⑤ 季节条件
秋季菜土样最理想
2.样品的预处理
(1)物理方法
热处理:根据目的菌较非目的菌的耐热性高 从而增加目的
菌的比例。
膜过滤法:浓缩水中的微生物细胞。 离心法:同上。
植物体上细菌的分离:无菌富集,加植物浸出 液适度培养取样,洗涤,取1ml经适度稀释后涂 布平板。
发酵工程 第二章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术
发酵工程 工业生产水平的
生产菌种的性能 发酵和提取工艺条件
三个决定要素
生产设备
获得优良的生产菌种是实现高水平发酵工程工 业生产的第一环节。
本章内容
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
第二节 自然界中微生物菌种的选择性分离
第三节 微生物菌种的选育
第四节 微生物菌种的退化、复壮和保藏 第五节 工业微生物菌种的扩大培养 第六节 种子培养基及其制备
集的培养物到固体培养基,分离优势微生物的单
菌落。
移种时间是关键,应在所需菌占优势时移种。
连续富集培养(恒化式富集培养)
改变限制性基质浓度来控制两种菌的比生长速率。 用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。
固体培养基的使用
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
常用于分离酶产生菌,选择培养基中常含有所
需的基质,以便促使酶产生菌的生长,并在菌落
使目的微生物在种群中占优势,使筛选 1. 目的:
变得可能。
2. 两种方案:
(1)施加选择性压力分离法:采用特定的有利于 目的微生物富集的条件进行培养,使目的微生物 占优势,以实现快速分离纯化的目的。 (2)随机分离法:不能提供任何有助于筛选产生 菌的信息时,只能通过随机分离法进行分离。
(1)施加选择性压力分离法
酵母(既是微生物又是真核细胞)
生长迅速,营养要求不高,易培养; 安全性好; 比哺乳动物细胞操作简单; 具有一定的修饰蛋白的能力。
中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)表达系统
具有准确的转录后修饰功能; 具有产物胞外分越功能,便于下游产物分离纯化; 具有重组基因的高效扩增和表达能力; 具有贴壁生长特性,也可进行悬浮生长; CHO很少分泌自身的内源蛋白。
发酵工程 2 发酵工业菌种
思考题
发酵工业菌种
1、常见的工业微生物包括哪些类群?
2、作为工业生产菌株应具备哪些基本特性? 3、了解发酵工业中的细菌、酵母菌、霉菌、放 线菌及其生产的产品。 4、掌握菌种分离筛选的基本过程。
5、诱变育种及其原理。
6、常用的化学诱变剂。
7、菌种退化、原因与防治。
8、菌种保藏的方法。
广义的微生物:
5.其它 担子菌:香菇、灵芝等。 藻类:螺旋藻、单胞藻等。 基因工程菌:基因工程菌在发酵工程已得到广泛 应用,如酶制剂、胰岛素、干扰素、生长激素、 乙型肝炎病苗等的生产。
二、工业生产对菌种的要求 (1)能在廉价原料制成的培养基上生长,且 生成的目的产物产量高、易于回收; (2)生长较快,发酵周期短;
挑出高产斜面
1、自然选育 不经人工处理,利用微生物的自然突变进行 菌种选育的过程称为自然选育(spontaneous
mutation)。
自然选育最为成功的例子是目前被广泛使
用的卡介苗(BCG vaccine)。法国的卡尔密脱
(Calmette)和介林(Guerin)把牛型的结核分枝 杆菌接种在牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上, 连续传代培养230代,前后经历13年时间,终 于在1923年获得显著减毒的结核杆菌----卡介
能力和转化蔗糖的性能,还能产生脂肪酶。能发
酵产生乳酸、反丁烯二酸。
华根霉:华根霉多出现在我国酒药和酒曲中, 具较强的耐高温性能(45℃能生长),淀粉酶液 化力强,有溶胶性,能产生酒精、芳香脂类、乳 酸及反丁烯二酸,能转化甾族化合物。
4)红曲霉属(Monascus) 菌丝呈红色以至紫色,
可由我国南方红曲中分离得到。
一个或少数几个核苷酸的插入或缺失,从而使该部
发酵工程与设备第二章、第二讲发酵工业菌种的分离筛选
透明圈法
在平板培养基中加入溶解性较差的底物,使培 养基混浊; 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈,圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。 分离水解酶产生菌时较多采用,如蛋白酶、淀粉 酶、脂肪酶、核酸酶等;
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌
土壤经巴氏消毒,以减少不产芽孢的微生物;然后铺在 pH8-9的琼脂培养基(含有均匀的不溶性蛋白质)表面; 碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质,产生 一透明圈。
若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质,如抗生素等, 便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈
6、随机分离方法
有些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选择性好处, 因此常随机地分离所需菌种,为此发展了一些快速筛选方法 并归纳出高产培养基成分的选择准则如下:
1)制备一系列的培养基,其中有各种类型的养分成为 生长限制因素。
第三次平板分离
第三次原种斜面
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
种子培养
1株3-5瓶 较优菌株
保藏及进一步做生产性能试 验或作为育种的出发菌株
某些必要试验和毒性试验
2、分离与筛选的设计要求
在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标:
1、菌的营养特征 2、菌的生长温度
但作为初筛的手段是有意义的
变色圈法
对于一些不易产生透明圈产物的产生菌,可在底 物平板中加入指示剂或显色剂,使目的微生物菌落 周围呈现变色圈,从而能被快速鉴别出来;
如 筛选果胶酶产生菌
用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板,对含微 生物样品进行分离,待菌落长成后,加入0.2%刚果 红溶液染色4h,具有分解果胶能力的菌落周围便会 出现绛红色水解圈。
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9. 酒香酵母(Brettanomuces knfferathet Van laer)
该菌耐酒精,在通气条件下能氧化酒精产生醋酸; 在长期缺氧条件下,可产生特有的香气; 葡萄酒中固有的一种微生物,适量的酒香酵母往往能够赋 予葡萄酒特色的风味,过量的酒香酵母能够诱发葡萄酒不 良气味的产生。
醋酸杆菌是一类能使糖类和酒精 氧化成醋酸等产物的短杆菌。 工业上可以利用醋酸杆菌酿醋、制作醋酸和葡萄 糖酸等。
2. 乳酸菌(Lactobacteriaceae)
乳酸杆菌(Lactobacillus)
乳酸杆菌是指能使糖类发酵产生乳酸的 细菌。是一群生活在机体内益于宿主健 康的微生物。它能够控制肠内感染、 抗肿瘤、调节免疫功能、促进机体健康 和治疗某种疾病。 增加机体肠道中乳酸杆菌的数量是预防 和治疗某些疾病的一种重要措施。
(三)霉菌(Mold or Mould) 1. 毛霉(Mucor)
鲁氏毛霉(Mucor roxianus)
产生蛋白酶,有分解大豆蛋白能力,也能用它制造腐乳。
高大毛霉(Mucor mucedo)
产果胶酶、脂肪酶、γ-亚麻酸、琥珀酸、3-羟基丁酮等。
12. 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolyticபைடு நூலகம்)
1. 解脂耶氏酵母是一种具有典型代表性的非常规 酵母。该酵母无致病性,最高生长温度一般在 34℃以下,为严格好氧菌,并且已经被认定为 (Generally regarded as safe, GRAS)安全级 微生物; 2. 解脂耶氏酵母具有二型性生长(两型现象)的 特点,碳源、氮源、pH等生长条件都会影响该菌 的菌落形态,因此它成为了研究酵母及真菌菌丝 分化的模式菌株;
10. 法夫红酵母(Rhodotorula harrison)
有明显的红色或黄色色素; 无酒精发酵能力,但可由菌体提取大量脂肪; 能合成β-胡萝卜素; 在一定条件下还能产生α-丙氨酸和谷氨酸,产蛋氨酸的能力也很强。
11. 白地霉(Geotrichum candidum )
参与奶酪成熟; 能水解蛋白,其中多数能液化明胶、胨化牛奶,少数只能胨化牛奶,不 能液化明胶。可用于处理发酵工业和食品加工业的有机废水。 从动物粪便、有机肥料、烂菜、泡菜、树叶、青贮饲料和垃圾中都能分 离到白地霉,其中已烂菜中最多,肥料和动物粪便中次之。 生产药用、食用或饲用单细胞蛋白,也可用于提取核酸。白地霉还能合 成脂肪,但其产量不及红酵母和脂肪酵母等。
可自葡萄糖产生磷酸甘露聚糖,应用于纺织及食品工业; 具有降解核酸的能力,并能微弱利用十六烷烃。
6. 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
近年来,巴斯德毕赤酵母已经发展成为 一种新型的基因表达系统,是目前最为 成功的外源蛋白表达系统之一。与大肠 杆菌相比,它具有高表达、高稳定、高 分泌、高密度生长及可用甲醇严格控制 表达等优点。
④ 乳酸克鲁维酵母 (Kluyveromyces lactis):如产β-半乳糖苷酶,外源 (药用)蛋白表达系统; ⑤ 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris):外源(药用)蛋白表达系统; ⑥ 多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha):外源(药用)蛋白表达系 统; ⑦ 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica):产有机酸、酶类、 生物脂质, 外源(药用)蛋白表达系统;
乳酸链球菌素Nisin作为防腐剂的优点: 1.乳酸链球菌素的毒性可以忽略; 2.乳酸链球菌素的稳定性极高; 3.乳酸链球菌素可被人体消化吸收; 4.乳酸链球菌素天然、绿色; 5.安全性极好; 所以,世界上有不少国家如英、法、 澳大利亚等,在食品中的Nisin添加量都 不作任何限制,成为食品防腐剂中的一个 特例。
工业上应用广泛的非常规酵母: ① 西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis):如产α-淀粉酶、 葡 萄糖淀粉酶、单细胞蛋白(SCP); ② 皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum):如微生物BOD传感器、降 解苯酚; ③ 麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa):如产脂肪酸、脂肪醇、单细胞 蛋白(SCP),外源(药用)蛋白表达系统;
1. 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
酿酒酵母(啤酒酵母)是发酵工业最常用的酵母 菌。目前酿酒酵母的应用包括如下四个方面: 酿酒工业,包括酒精及白酒、葡萄酒、啤酒、清 酒等各种饮料酒。 酵母工业,包括面包酵母、药用酵母和食用酵母 等。 生产酵母抽提物等胞内、胞外产品。
作为基因工程的受体菌用来生产重组蛋白。
8. 大肠杆菌(Escherichia coli)
因其遗传背景清楚、技术操作 简单、培养条件简单,其成为 基因工程中应用最广泛的外源 基因表达的宿主菌。
也是合成生物学中最重要、 最常用的底盘微生物(Chassis)。
9. 运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)
①利用ED途径代谢葡萄糖产生乙醇; ②生产丙氨酸、β-胡萝卜素等。
2. 不产生或少产生与目标产品性质相近的副产物;
3. 遗传性能要相对稳定,不易变异退化;
4. 不易感染它种微生物或噬菌体;
5. 不是病原菌(非致病菌),且不产生任何有害的生物 活性物质; 6. 生长条件易于控制,生产特性要符合工艺要求,
二、工业微生物常用菌种
(一)细菌(Bacteria)
1. 醋酸杆菌(Acetobacter)
3. 卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis Hansen)
菌落呈浅黄色,软质,具光泽,生微细的 皱纹,边缘生细的锯齿状,孢子形成困难。
此酵母除用于啤酒酿造外,亦可做食用、 药用和饲料酵母。
4. 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)
(二)酵母菌(Yeast)
常规酵母(Conventional Yeast)——即生理和遗传特性完全清楚
或者人们比较熟悉且投入生产应用较早的酵母:
① 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),又叫 啤酒酵母(brewer‘s yeast )或者 面包酵母 (baker’s yeast)或者出芽酵母(budding yeast)。 在真核微生物中,酿酒酵母的遗传背景是研究最为 清楚的,成为微生物学、分子生物学、遗传学、 生物化学和细胞生物学研究的模式生物。
7. 热带假丝酵母(Candida tropicalis)
能够产生假菌丝; 氧化烃类的能力强,是生产石油蛋白质的重要菌种; 用农副产品和工业废弃物也可培养热带假丝酵母。如用生 产味精的废液培养热带假丝酵母作饲料,既扩大了饲料来 源,又减少了工业废水对环境的污染。
8. 光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)
5. 棒状杆菌(Corynebacterium)
谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
①其中的谷氨酸棒状杆菌是发现最早、 研究历史最长、应用最为广泛的一种 菌种; ②用于微生物发酵工程生产谷氨酸, 来制取谷氨酸钠(味精)。
6. 短杆菌 (Brevibacterium)
产氨短杆菌(Brevibacterium ammonia)
微生物发酵生产辅酶A、肌苷酸、氨基酸和核苷酸等。
黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)
微生物发酵生产谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、精氨酸、 缬氨酸等多种氨基酸。
7. 双歧杆菌 (Bifidobacterium)
①具有调节肠道菌群平衡的作用。 ②酸奶等乳制品的制作。
以分裂繁殖而得名。该菌发酵力强,适于37℃ 高温,广泛地适用于制造酒精;用于糊精和 含菊芋糖的原料发酵,能得到很高的酒精产量。
5. 汉逊酵母(Hanssenula H. et. P. Sydow)
此属酵母多能产乙酸乙酯,从而增加产品风味,可用于食 品和酿酒工业;
也常是酒类饮料生产的有害菌,它既能够利用酒精作为碳 源,又能够在饮料表面生长成干而皱的菌醭;
第二章:工业微生物
第一节 工业用微生物菌种
一、工业生产对菌种的基本要求 二、工业常用微生物菌种
第二节 工业微生物菌种的选育
一、自然分离 二、育种
第三节 工业生产菌种的复壮和保藏
第一节 工业微生物菌种 一、工业化菌种的基本要求
1. 能够在廉价原料制备的培养基或简单培养基上迅速生长,并 能够通过代谢大量高效地合成目的产物;
10. 脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)
生产维生素B12
11. 肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)
生产柠檬酸、葡聚糖、右旋糖酐等。
12. 甲烷同化菌(Methylotropic bacteria)
可以利用甲烷或甲醇作为碳源生产菌体蛋白。
两型现象(dimorphism):许多真菌 依赖环境条件变化而具有改变其形态的能力, 出现菌丝型和类酵母型两种形态,这种生长 习性的转变称为两型现象。
3. 解脂耶氏酵母可以利用的碳源类型极为广泛,包括有机酸、烷烃、烯烃、油 类、醇类和酯类等。 4. 解脂耶氏酵母在其代谢过程中能够产生和(或)分泌多种代谢产物,因此具 有很好的工业应用价值。具体工业应用包括蛋白酶、脂肪酶、磷酸酶、赖氨酸、 γ-癸内酯、柠檬酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸和单细胞油脂的生产和生物修复等。 5. 与酿酒酵母相比,解脂耶氏酵母生长速度更快、生物量更大;尤其,解脂耶 氏酵母对酸类、碱类、烃类、油类、醇类、酯类、盐类和金属都表现出更高的 耐受性。
3. 芽孢杆菌(Bacillus)
枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)
1.其产酶量高、种类多、安全性好和环保 等,所以在现代工业生产中被广泛用作 生产菌种。其是α-淀粉酶、中性蛋白酶、脂肪酶、 丝氨酸纤溶性蛋白酶(纳豆激酶)、5’-核苷酸酶和 核苷等的重要生产菌。 2.能够调整肠道菌群失调、恢复肠道功能。 3.作为同大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母并列的 工业酶蛋白表达系统之一。