饱和硫酸铵纯化

饱和硫酸铵纯化血清中抗体

1实验原理

此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。

2实验试剂与器材

2.1实验试剂：硫酸铵、氨水、盐酸、1XPBS溶液（PH7.4）、2% NaHCO3 、

1mmol/LEDTA(PH8.0)、1mol/LNaOH、氯化钡、蒸馏水

2.2实验器材：磁力搅拌器、低温离心机、4℃冰箱、PH计、离心管、锥形瓶、

搅拌棒、量筒、烧杯、漏斗、移液器、电磁炉、铝锅、剪刀、试剂瓶、透析袋夹子

2.3样品抗血清

3实验步骤

3.1配制溶液

3.1.1 配制饱和硫酸铵溶液，25℃时饱和溶解度是767g/L，0℃时为676g/L(见附表)。配制1000ml饱和硫酸铵，将800g左右的硫酸铵加入到1L水中，加热搅拌到大部分固体溶解，趁热过滤并室温冷却，仍会有晶体析出，再用氨水调节PH 至8.5，4℃保存备用（可以根据所需量按比例调整所配溶液量）。

3.1.2 配制1XPBS溶液（PH7.4）

取1.44gNa2HPO4（或3.63gNaHPO4.12H2O），0.24gKH2PO4，8gNaCl，0.2gKCl，加入800ml水中，用盐酸调PH至7.4，补蒸馏水至1000ml，高压蒸汽灭菌。4℃保存。

3.1.3 配制2% NaHCO3，2g NaHCO3加入到100ml蒸馏水中。

3.1.4 配制1mol/LNaOH，4gNaOH慢慢加入80ml蒸馏水中，边加入边搅拌，完全溶解后定容至100ml，室温保存，无需除菌。注意放热反应，塑料烧杯储存。

3.1.5 配制1mmol/LEDTA(PH8.0)，

先配储存液：EDTA(0.5mol/L)：Na2·EDTA·2H

O 37.2g +20g NaOH 配成大约80ml

2

溶液（注：液体+粉末混合体积会增加），再用NaOH溶液调节PH为8.0，定容至100ml，可以在水浴50℃中溶解。临用前稀释至1mmol/L。

3.2透析袋处理

3.2.1 将透析管剪适当长度（20-30cm），即形成透析袋。

3.2.2 在2%（m/V）NaHCO3和1mmol/LEDTA(PH8.0)中将透析袋煮沸10min。

3.2.3 将透析袋用蒸馏水彻底漂洗。

3.2.4 将透析袋置于1mmol/LEDTA(PH8.0)中将透析袋煮沸10min。

3.2.5 将透析袋冷却，4℃存放备用，应确保透析袋始终浸没在液体中。

3.3 沉淀（此步在4℃下进行）

3.3.1 抗血清离心去除细胞碎片，保留上清液测定体积，并加入等体积PBS溶液

（PH 7.4）稀释。

3.3.2 边搅拌便逐滴滴入等体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀使蛋白充分沉淀。

3.3.3 搅拌均匀后4℃静置1h，10000rpm/min离心20min，弃上清取沉淀。

3.3.4 PBS溶液（PH 7.4）溶解沉淀。

3.3.5 继续向上一步蛋白溶液中滴入1/2体积的饱和硫酸铵溶液（饱和度达33%），

搅拌均匀。

3.3.64℃静置1h，10000rpm/min离心20min，弃上清取沉淀。

3.3.7PBS溶液（PH 7.4）溶解沉淀。

3.3.8重复以上步骤3次或进行亲和层析纯化，以得到纯度较高的产品。

3.4透析（此步在4℃下进行）

3.4.1取出备用的透析袋，用蒸馏水彻底漂洗干净。

3.4.2一端封闭，检查有无漏液，如无漏液，将上一步制备的蛋白溶液转入透析

袋中，用透析袋夹子最后封闭末端开口。

3.4.3在PH7.4的1XPBS中透析12-24h（1:20），每3-6h换一次透析液，以彻

底去除硫酸铵。检测硫酸铵去除是否彻底，可取少量样品加入10%氯化钡，如检测不到沉淀，即透析完毕。

3.5保存

分装到合适的离心管中，即时用可4℃保存，备用-20℃保存。

硫酸铵饱和度的常用表

1．调整硫酸铵溶液饱和度计算表（25℃）

硫整硫酸铵终浓度,%饱和度

10 20 25 30 33 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 90 100

每1升溶液加固体硫酸铵的克数①

硫酸铵初浓度，% 饱和度0 56 114 144 176 196 209 243 277 313 351 390 430 472 516 561 662 767 10 57 86 118 137 150 183 216 251 288 326 365 406 449 494 592 694 20 29 59 78 91 123 155 190 225 262 300 340 382 424 520 619 25 30 49 61 93 125 158 193 230 267 307 348 390 485 583 30 19 30 62 94 127 162 198 235 273 314 356 449 546 33 12 43 74 107 142 177 214 252 292 333 426 522 35 31 63 94 129 164 200 238 178 319 411 506 40 31 63 97 132 168 205 245 285 375 469 45 32 65 99 134 171 210 250 339 431 50 33 66 101 137 176 214 302 392 55 33 67 103 141 179 264 353 60 34 69 105 143 227 314 65 34 70 107 190 275 70 35 72 153 237 75 36 115 198 80 77 157 90 79

在0℃硫酸铵终浓度，% 饱和度

硫酸铵初浓度，％饱和度

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100

每100ml 溶液加固体硫酸铵的克数

0 10.6 13.4 16.4 19.4 22.6 25.8 29.1 32.6 36.1 39.8 43.6 47.6 51.6 55.9 60.3 65.0 69.7 5 7.9 10.8 13.7 16.6 19.7 22.9 26.2 29.6 33.1 36.8 40.5 44.4 48.4 52.6 57.0 61.5 66.2 10 5.3 8.1 10.9 13.9 16.9 20.0 23.3 26.6 30.1 33.7 37.4 41.2 45.2 49.3 53.6 58.1 62.7 15 2.6 5.4 8.2 11.1 14.1 17.2 20.4 23.7 27.1 30.6 34.3 38.1 42.0 46.0 50.3 54.7 59.2 20 0 2.7 5.5 8.3 11.3 14.3 17.5 20.7 24.1 27.6 31.2 34.9 38.7 42.7 46.9 51.2 55.7 25 0 2.7 5.6 8.4 11.5 14.6 17.9 21.1 24.5 28.0 31.7 35.5 39.5 43.6 47.8 52.2 30 0 2.8 5.6 8.6 11.7 14.8 18.1 21.4 24.9 28.5 32.3 36.2 40.2 44.5 48.8 35 0 2.8 5.7 8.7 11.8 15.1 18.4 21.8 25.4 29.1 32.9 36.9 41.0 45.3