分子生物学：第十一章分子生物学技术
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SYBR Green
SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集 荧光信号。
非特异性荧光标记- SYBR GREEN
Excitation
5’
SG
SG SG
3’
3’
No Emission
SG
• 为引物，利用逆转录酶反转录成 cDNA。
• 以cDNA为模板进行PCR扩增，而 获得目的基因或检测基因表达
第四节 定量PCR原理与应用
▪非特异性荧光标记：SYBR Green ▪特异性荧光标记：
• TaqMan
• Molecular Beacon
• Amplisensor
非特异性荧光标记- SYBR GREEN SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶， 可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、 MboI等。
• 限制酶识别序列的结构 限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在
DNA 两条链相对称的位置。 EcoRⅠ 和 HindⅢ 的识别序列和 切割位置如下：
模板上的目的序列通过氢键配对;
• 3. 延伸(Extension): DNA模板—引物结合物在TaqDNA 聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，按碱基配对原理，合成一条 新的与模板DNA 链互补的DNA链。
RT-PCR:
• 提取组织或细胞中的总RNA • 以其中的mRNA作为模板，以：
• Oligo（dT）或 • 随机引物或 • 基因特异性引物
②产生5’突出的粘性末端：以PstⅠ为例 5’…CTGCA↓G…3’ 3’…G↑ACGTC…5’
③产生平末端（blunt end）:Nru Ⅰ为例 5’…TCG↓CGA…3’ 3’…AGC↑GCT…5’
DNA连接酶(DNA ligase) ：
T4 DNA连接酶 以ATP提供能量 可以连接平末端和粘性末端
质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与 细菌或细胞共生的遗传成分。
• 特点：
• 是染色质外的双链共价闭合环形DNA（covalently closed circuar DNA, cccDNA），可自然形成超螺旋结构
• 能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomous replicon）。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传 给后代。
（lac Z’） • lac Z’基因5’端附近的多克隆位点MCS。
第三节 PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION，聚合酶 链式反应)
PCR是一种根据体内DNA复制原理，在体外扩增DNA的技术。主要用于 在体外扩增特异DNA片段，它可以在短时间内在试管中获得百万特异 DNA序列拷贝。
PCR反应体系
• DNA模板（DNA template） • 引物（primer）
• 引物长度： 15-30bp。 • 引物 3’端的碱基要求严格配对。 • 引物内部出现二级结构。
• Taq酶（Taq DNA polymerase） • dNTP（ dATP,dGTP,dCTP,dTTP ） • Mg2+ （magnesium）
EcoRⅠ G↓AATTC；HindⅢ A↓AGCTT C TTAA↑G TT CGA↑A
有一些限制酶的识别序列不是对称的，如 。
• AccBSⅠ CCG↓CTC；BssSⅠ C↓TCGTG GGC↑GAG GAGCA↑C
• 不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同，结果有三种 不同的情况：
①产生3’突出粘性末端（cohesive end）:以Eoor 为例 5’…G↓AATT C…3’ 3’…C ATAA↑G…5’
• [酶反应] 限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。 它能识别外源DNA并将其降解。
• 命名；一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母 组成，第四个字母表示菌株(品系)。例如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H，在同
• 为DNA聚合酶活性所必需。 • 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 • Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增。
PCR循环的三个基本步骤
• 1. 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; • 2. 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与
第十一章 分子 生物学实验技 术
第一节 分子生物学技术常用 酶类
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)
• 生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它 可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失 去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的 遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制 性内切酶(简称限制酶)。
大肠杆菌 DNA连接酶 以NAD＋提供能量 只能连接粘性末端
第二节 常用载体 （VECTOR）
定义：携带外源DNA进入宿主细胞并进行复制的运载工具称为载 体
• 种类：质粒、噬菌体、人工染色体等 • 特点：
• 具有自主复制能力； • 携带易于筛选的选择标志； • 含有多克隆位点（multiple cloning site,MCS）； • 只保留必要序列，便于导入宿主细胞和繁殖； • 使用安全。
• 质粒对宿主生存并不是必需的
• 质粒分子结构
pBR322：
• 全长4361bp。
• 携带氨卞青霉素抗性基因 （ampr）和四环素抗性基因 （tetr）。
• 具备复制起点ori。
• 具有较高的拷贝数，每个细胞 中可累积1000-3000份拷贝。
pUC18/19:
• 包含ori和ampr • E.coli 乳糖操纵子调节基因 lac I,启动子Plac,β-半乳糖苷酶α肽链
5’
Excitation
SG
பைடு நூலகம்
SG
SG SG
Emission
5’
3’
3’
SG
SG
SG
5’
TAQMAN法
SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集 荧光信号。
非特异性荧光标记- SYBR GREEN
Excitation
5’
SG
SG SG
3’
3’
No Emission
SG
• 为引物，利用逆转录酶反转录成 cDNA。
• 以cDNA为模板进行PCR扩增，而 获得目的基因或检测基因表达
第四节 定量PCR原理与应用
▪非特异性荧光标记：SYBR Green ▪特异性荧光标记：
• TaqMan
• Molecular Beacon
• Amplisensor
非特异性荧光标记- SYBR GREEN SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶， 可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、 MboI等。
• 限制酶识别序列的结构 限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在
DNA 两条链相对称的位置。 EcoRⅠ 和 HindⅢ 的识别序列和 切割位置如下：
模板上的目的序列通过氢键配对;
• 3. 延伸(Extension): DNA模板—引物结合物在TaqDNA 聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，按碱基配对原理，合成一条 新的与模板DNA 链互补的DNA链。
RT-PCR:
• 提取组织或细胞中的总RNA • 以其中的mRNA作为模板，以：
• Oligo（dT）或 • 随机引物或 • 基因特异性引物
②产生5’突出的粘性末端：以PstⅠ为例 5’…CTGCA↓G…3’ 3’…G↑ACGTC…5’
③产生平末端（blunt end）:Nru Ⅰ为例 5’…TCG↓CGA…3’ 3’…AGC↑GCT…5’
DNA连接酶(DNA ligase) ：
T4 DNA连接酶 以ATP提供能量 可以连接平末端和粘性末端
质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与 细菌或细胞共生的遗传成分。
• 特点：
• 是染色质外的双链共价闭合环形DNA（covalently closed circuar DNA, cccDNA），可自然形成超螺旋结构
• 能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomous replicon）。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传 给后代。
（lac Z’） • lac Z’基因5’端附近的多克隆位点MCS。
第三节 PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION，聚合酶 链式反应)
PCR是一种根据体内DNA复制原理，在体外扩增DNA的技术。主要用于 在体外扩增特异DNA片段，它可以在短时间内在试管中获得百万特异 DNA序列拷贝。
PCR反应体系
• DNA模板（DNA template） • 引物（primer）
• 引物长度： 15-30bp。 • 引物 3’端的碱基要求严格配对。 • 引物内部出现二级结构。
• Taq酶（Taq DNA polymerase） • dNTP（ dATP,dGTP,dCTP,dTTP ） • Mg2+ （magnesium）
EcoRⅠ G↓AATTC；HindⅢ A↓AGCTT C TTAA↑G TT CGA↑A
有一些限制酶的识别序列不是对称的，如 。
• AccBSⅠ CCG↓CTC；BssSⅠ C↓TCGTG GGC↑GAG GAGCA↑C
• 不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同，结果有三种 不同的情况：
①产生3’突出粘性末端（cohesive end）:以Eoor 为例 5’…G↓AATT C…3’ 3’…C ATAA↑G…5’
• [酶反应] 限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。 它能识别外源DNA并将其降解。
• 命名；一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母 组成，第四个字母表示菌株(品系)。例如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H，在同
• 为DNA聚合酶活性所必需。 • 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 • Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增。
PCR循环的三个基本步骤
• 1. 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; • 2. 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与
第十一章 分子 生物学实验技 术
第一节 分子生物学技术常用 酶类
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)
• 生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它 可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失 去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的 遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制 性内切酶(简称限制酶)。
大肠杆菌 DNA连接酶 以NAD＋提供能量 只能连接粘性末端
第二节 常用载体 （VECTOR）
定义：携带外源DNA进入宿主细胞并进行复制的运载工具称为载 体
• 种类：质粒、噬菌体、人工染色体等 • 特点：
• 具有自主复制能力； • 携带易于筛选的选择标志； • 含有多克隆位点（multiple cloning site,MCS）； • 只保留必要序列，便于导入宿主细胞和繁殖； • 使用安全。
• 质粒对宿主生存并不是必需的
• 质粒分子结构
pBR322：
• 全长4361bp。
• 携带氨卞青霉素抗性基因 （ampr）和四环素抗性基因 （tetr）。
• 具备复制起点ori。
• 具有较高的拷贝数，每个细胞 中可累积1000-3000份拷贝。
pUC18/19:
• 包含ori和ampr • E.coli 乳糖操纵子调节基因 lac I,启动子Plac,β-半乳糖苷酶α肽链
5’
Excitation
SG
பைடு நூலகம்
SG
SG SG
Emission
5’
3’
3’
SG
SG
SG
5’
TAQMAN法