紫外可见分光光度法基本原理
紫外可见分光光度计基本原理
应用
定量分析——标准曲线法
最大吸收波长
在一定波长下，测定某物质的标准 系列溶液的吸光度做标准曲线，然 后测定样品溶液的吸光度值，根据 所测吸光度，求出所测溶液浓度。
吸
AX
光
度
波长范围
CX
应用
定量分析——对照法
A标 = K c标 l Ax = K cx l
cx = Ax C标
A0
谢谢！
称为电荷迁移吸收光谱。
例如:某些取代芳烃可产生这种分子内电荷迁移跃迁吸收带。谱带较宽，吸收强度较大， εmax可大于104
无机化合物 电子迁移跃迁 吸收光谱 配位场跃迁
收能量后向σ*反键跃迁，这种跃迁可以吸收波长在200nm左右。
n
π *跃迁：含有杂原子不饱和基团，如C=O,C=S,-N=N-等化合物，这种跃
迁一般处于近紫外区（200 ～ 400nm）。
电荷迁移跃迁：用电磁辐射照射化合物时，电子从给予体向与接受体相联系
的轨道上跃迁。因此，电荷迁移跃迁实质是一个内氧化还原的过程，而相应的吸收光谱
吸光物质的溶液时，在入射光的波长强度以及溶液的温 度等因素保持不变的情况下，该溶液的吸光度A与溶液 的浓度c及液层厚度l的乘积成正比关系，称为朗伯比尔 定律。
A=K·c·l
适用条件：单色光、稀溶液
朗伯比尔定律
A=K·c·l K—比例常数，与入射光的波长、溶液的性质、
液层厚度以及温度有关。 c—吸光物质的浓度。 l—透光液层厚度。
定义
紫外-可见分光光度法（ultraviolet and visible spectrophotometry ;
UV- vis ）是研究物质在紫外-可见光区（200 ～ 800nm）分子吸收光谱的分析方 法。
紫外可见分光光度法基本原理PPT讲稿
E=h=hc/
（Planck常数：h=6.626 × 10 -34 J × S ) 光的波长越短（频率越高），其能量越大。 白光(太阳光)：由各种单色光组成的复合光 单色光：单波长的光(由具有相同能量的光子组成) 可见光区：400-750 nm 紫外光区：近紫外区200 - 400 nm
生的吸收光谱在紫外—可见光区，称为紫外—可见光谱或分子的 电子光谱。
讨论：
（4）吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的 能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是物质定性 的依据。 （5）吸收谱带强度与分子偶极矩变化、跃迁几率有关， 也提供分子结构的信息。通常将在最大吸收波长处测得的摩 尔吸光系数εmax也作为定性的依据。不同物质的λmax有时可能 相同，但εmax不一定相同； （6）吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比， 这是定量分析的依据。
* σ σ* (150~210nm)
H
* n σ* (259nm)
HCI
H
（2）不饱和脂肪烃
• 这类化合物有孤立双键的烯烃(如乙烯)和共轭双键的烯
烃(如丁二烯)，它们含有π键电子，吸收能量后产生
π→π*跃迁。乙烯(孤立双键)的
m
a
为171nm(
x
＝
15530 L mol1 cm1 )；而丁二烯H(2C CH CH CH2 )
列吸收带，称为精细结构吸收带，亦称为B吸收带[从德文 Benzenoid(苯的)得名]，这是由于跃迁和苯环的振动的重叠引起的。B 吸收带的精细结构常用来辨认芳香族化合物。 苯环与生色团连结时，有B和K两种吸收带，有时还有R吸收带，其中 R吸收带的波长最长 。
生色团与助色团
生色团(Chromophore)： 最有用的紫外—可见光谱是由π→π＊和n→π＊跃迁产生
紫外-可见分光光度法的基本原理(一)
紫外-可见分光光度法是一种常用的分析化学方法，它利用物质对紫外光和可见光的吸收来确定物质的浓度。
本文将介绍紫外-可见分光光度法的基本原理，包括仪器的构成、光谱的特点以及测定原理等方面。
1. 仪器的构成紫外-可见分光光度法的仪器主要由光源、进样系统、分光器、检测器和数据处理系统五个部分组成。
其中光源通常采用汞灯、钨灯或氘灯，进样系统包括进样池和进样装置，分光器可分为单道光栅和双道光栅，检测器可采用光电倍增管或光电二极管，数据处理系统包括计算机和相关的数据处理软件。
2. 光谱的特点紫外-可见分光光度法所使用的光源通常在紫外至可见光范围内，因此能够观测到物质在这一范围内的吸收光谱。
吸收光谱通常表现为在特定波长范围内的吸收峰或吸收带，其位置和强度可反映物质的化学性质和浓度。
通过测定样品和对照液的吸光度差值，可以确定样品中所含物质的浓度。
3. 测定原理在紫外-可见分光光度法中，测定原理主要包括比较法和标准曲线法两种。
比较法是通过测定待测溶液与对照液的吸光度差值来确定物质的浓度，而标准曲线法则是通过构建标准曲线，利用标准溶液的吸光度与浓度的关系来确定待测溶液的浓度。
两种方法均需要在特定波长下进行测定，并且要对光谱仪进行基准校准和零点校准。
4. 应用范围紫外-可见分光光度法在分析化学领域有着广泛的应用，可以用于测定各种有机和无机物质的浓度，如药物、生物分子、环境污染物等。
其灵敏度高、操作简便、准确性好，因此被广泛应用于医药、环保、化工等领域。
5. 结语紫外-可见分光光度法作为一种常用的分析化学方法，具有许多优点，但也存在一些局限性，如对样品的要求较高、需要标准曲线等。
因此在实际应用中需要根据具体情况选择合适的方法，并结合其他分析方法进行综合分析，以获得更准确的结果。
通过以上介绍，相信读者对紫外-可见分光光度法的基本原理有了一定的了解，希望能对相关领域的研究和应用提供一定的参考和帮助。
6. 光源的选择与影响在紫外-可见分光光度法中，光源的选择对测定结果有着重要的影响。
简述紫外可见分光光度法的基本原理。
简述紫外可见分光光度法的基本原理。
紫外可见分光光度法是一种常用的分析方法，通过测量物质在紫外可见光区的吸光度来分析物质的浓度。
其基本原理如下：
1. 光源：使用特定波长范围的光源，通常是紫外光或可见光。
光源产生的光经过一系列光学元件聚焦后，成为一个具有特定波长范围的光束。
2. 分光器：分光器将光束分离成不同波长的光束。
分光器通常
使用棱镜或光栅等光学元件来分散光束，使其成为不同波长的光谱。
3. 样品池：将待测样品置于样品池中，光束通过样品时，样品
会吸收特定波长的光。
吸收光的强度与样品中某种物质的浓度成正比。
4. 检测器：检测器接收通过样品后的光束，并将光信号转化为
电信号。
光的强度由电压信号表示。
5. 计算和分析：使用计算机或其他数据处理设备对电信号进行
分析和计算，得出样品中某种物质的浓度。
通过测量样品在不同波长下的吸光度，可以得到样品的吸收光谱。
根据光的强度与浓度之间的线性关系，可以通过比较吸收光强度与标准曲线的关系来确定样品中某种物质的浓度。
紫外可见分光光度法
光子能量与它的频率成正比，与波长成 反比，与光强度无关。光的波长越短
（频率越高），其能量越大。
单色光： 同一波长的光称为单色光； 复合光： 不同波长的光组成的光称为复合光； 可见光： 凡是被肉眼感受到的光称为可见光； 波长范围为400-780nm
复合光
单色光
物质颜色的产生
固体
反射蓝色光 吸收黄色光
互补色
液体
透过紫色光 吸收绿色光
二、 物质对光的选择性吸收
M + h 基态 E0 （△E） M* 激发态 E1
E1
激发态
E2
E = E1 - E0 = h =h c/λ λ=hc/ E
物质对光选择性吸收
E0
基态
E
例题
某分子中两个电子能级之间的能级差为1eV， 若要电子在两个能级之间发生跃迁，需要
是指分子中的一些带有非成键电子对的基团本身在紫外-可 见光区不产生吸收，但是当它与生色团连接后，增强生色团的 生色能力，使生色团的吸收带向长波移动，且吸收强度增大。 助色团为含有未共用电子对的杂原子基团：-OH、-Cl、-Br
C.红移与蓝移
有机化合物的吸收谱带常
常因引入取代基或改变溶剂使
最大吸收波长λmax和吸收强度 发生变化:
π→π*跃迁的λmax为170nm 。
（4）n→π*跃迁：分子中孤对电子和π键同 时存在时发生n→π＊ 跃迁。丙酮n→π＊ 跃迁的λmax为275nm。
（5）电荷迁移跃迁：分子本身具有电子给予
体和电子接受部分，外来辐射照射，电子从
具有给予体特性的部分转移到具有电子接受
体特性的部分所发生的跃迁。其谱带较宽，
思考
1、庚烷、环己烷等烷烃在200-400nm内有无吸收？
紫外可见分光光度计原理及操作.ppt
吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或
测定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。 3）紫外分光光度法使用基于朗伯-比耳定律(Lambert－Beer)。
朗伯-比耳定律是光吸收的基本定律，俗称光吸收定律，是分光光度法
定量分析的依据和基础。
朗伯-比耳定律
一、透射率T%
dT d lg T 0.434 bdc T
将上两式相比，并将 dT 和 dc 分别换为T 和 c，得
c 0.434T c T lg T
当相对误差 c/c 最小时，求得T=0.368 或 A=0.434。即当A=0.434 时，吸光度读数误差最小！ 通常可通过调节溶液浓度或改变光程 b来控制A的读数在0.15~1.00范类型来自3.比例双光束分光光度计
由同一单色器发出的光被分成两束，一束直接到达检测器，另一束 通过样品后到达另一个检测器。这种仪器的优点是可以监测光源变化带
来的误差，但是并不能消除参比造成的影响
UV-2550的特点
6 挡狭缝可选
PC 控制存储、调用方便 可采用复制、拷贝方法在电子表格和字处理软件中处理数据和打印报 告 可加载膜厚、动力学、多波长、色彩分析等软件 DDM（双闪耀波长双单色器）降低杂散光，提高长波长区的能量响应 （UV-2550）
它的作用是放大信号并以适当方式指示或记录下来。现在一般的紫
外可见分光光度计有计算机控制和主机单片机控制两种类型，功能基本 类似。
类型
紫外-可见分光光度计的类型很多，但可归纳为三种类 型，即单光束分光光度计、双光束分光光度计和比例双光束 分光光度计。
1.单光束分光光度计 经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以 进行吸光度的测定。这种简易型分光光度计结构简单，操作方便，维修 容易，适用于常规分析。
紫外可见分光光度计的原理
紫外可见分光光度计的原理紫外可见分光光度计是一种常用的分析仪器，广泛应用于化学、生物、环境等领域。
它通过测量样品对紫外可见光的吸收或透射来分析样品的成分和浓度。
在实际应用中，了解紫外可见分光光度计的原理对正确操作和数据解释非常重要。
紫外可见分光光度计的原理基于比尔-朗伯定律和兰伯特-比尔定律。
比尔-朗伯定律描述了光线通过溶液时，光线的强度与溶液中物质的浓度成正比，即I=I0e^(-εbc)，其中I为透射光强度，I0为入射光强度，ε为摩尔吸光系数，b为光程，c为溶液浓度。
兰伯特-比尔定律则描述了溶液对光的吸收与光程和溶液的吸光度成正比。
紫外可见分光光度计工作原理是利用光源发出的一束宽谱光通过样品后，光检测器测量出样品对不同波长光的吸收或透射情况。
根据比尔-朗伯定律和兰伯特-比尔定律，可以得到样品在不同波长下的吸光度。
通过测量吸光度随波长的变化，可以得到样品的吸收光谱。
紫外可见分光光度计通常包括光源、单色器、样品室和光检测器等部件。
光源发出的宽谱光经过单色器分离成不同波长的单色光，单色光通过样品后被光检测器检测，得到样品对不同波长光的吸收情况。
通过测量吸光度随波长的变化，可以得到样品的吸收光谱。
紫外可见分光光度计的原理简单而有效，通过测量样品对不同波长光的吸收情况，可以分析样品的成分和浓度。
在实际应用中，需要注意选择合适的光源、单色器和光检测器，以及正确操作仪器和处理数据，才能得到准确可靠的分析结果。
总之，紫外可见分光光度计的原理是基于比尔-朗伯定律和兰伯特-比尔定律的，通过测量样品对不同波长光的吸收情况来分析样品的成分和浓度。
了解这一原理对正确操作仪器和解释数据非常重要，也有助于更好地应用紫外可见分光光度计进行分析实验。
紫外-可见分光光度法 标准曲线相关系数 小木虫
紫外-可见分光光度法是一种广泛应用的分析化学技术，它通过测量物质在紫外-可见光波段的吸收或透射来确定样品中特定物质的浓度。
该方法具有灵敏度高、分辨率好、操作简便等优点，在化学、生物化学、环境监测等领域都有着重要的应用价值。
一、紫外-可见分光光度法的原理紫外-可见分光光度法是利用物质对紫外-可见光的吸收或透射特性来进行定量分析的一种方法。
当紫外-可见光照射到物质上时，如果物质吸收了部分光能，则其吸收的光强与物质浓度成正比。
根据比尔定律，可以得到吸光度与浓度的线性关系：A = εlc其中A为吸光度，ε为摩尔吸光系数，l为光程，c为物质浓度。
通过建立标准曲线，测定样品的吸光度，并根据标准曲线确定样品中特定物质的浓度。
二、标准曲线的建立标准曲线是指在已知条件下，一系列不同浓度物质对应的吸光度值所构成的曲线。
标准曲线的建立通常需要进行以下步骤：1.准备一系列不同浓度的标准溶液，通常从低浓度到高浓度逐渐增加；2.分别测定各标准溶液的吸光度，并绘制吸光度-浓度曲线；3.通过线性回归等方法，拟合出标准曲线的方程，确定吸光度与浓度的线性关系。
三、标准曲线相关系数标准曲线相关系数是用来评价标准曲线拟合程度的指标。
相关系数越接近1，表示拟合效果越好，曲线与实际数据的吻合程度越高；而相关系数接近0，则表示拟合效果较差，曲线与实际数据的吻合程度较低。
在紫外-可见分光光度法中，标准曲线相关系数的计算通常是依靠计算吸光度与浓度的线性回归方程的确定系数R^2来实现。
R^2的取值范围在0~1之间，越接近1表示拟合效果越好，常用于评价标准曲线的可靠性和稳定性。
四、标准曲线相关系数的影响因素标准曲线相关系数的大小受多种因素影响，包括仪器精度、操作技术、环境条件等。
其中，标准曲线的线性范围和斜率对其相关系数影响较大。
线性范围如果选择不当，可能导致数据偏离线性区域，造成拟合效果不佳；而斜率的大小则直接影响到吸光度与浓度的线性关系，进而影响相关系数的结果。
紫外可见分光光度计的结构、工作原理与应用
紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计原理是：分子的紫外可见吸收光谱是由于分子中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后，发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。
它是带状光谱，反映了分子中某些基团的信息。
可以用标准光谱图再结合其它手段进行定性分析。
根据Lambert-Beer定律：A=εbc，（A为吸光度，ε为摩尔吸光系数b为液池厚度，c为溶液浓度）可以对溶液进行定量分析。
你可以用紫外可见分光光度计测定定三种农药的波长在某溶液中的最大、最小吸收波长。
配制溶液－在光谱检测项下进行－调整检测光谱范围及速度－－扫描光谱图－－吸光度最大处对应波长为最大吸收波长，吸光度最小处对应的波长为最小吸收波长。
1.光源灯;2.滤光片;3.球面反射镜;4.入射狭缝;5.保护玻璃;6.平面反射镜;7.准直镜;8.光栅;9.保护玻璃;10.出射狭缝; 11.聚光镜;12.试样室; 13.光门;14.光电管.分光光度计工作原理:由光源灯(1)发出连续辐射光线,经滤光片(2)和球面反射镜(3)至单色器的入射狭缝(4)聚焦成像,光束通过入射狭缝(4)经平面反射镜(6)到准直镜(7)产生平行光,射至光栅(8)上色散后又以准直镜(7)聚焦在出射狭缝(10)上形成一连续光谱,由出射狭缝选择射出一定波长的单色光,经聚光镜(11)聚光后,通过试样室(12)中的测试溶液部分吸收后,光经光门(13)再照射到光电管(14)上.调整仪器,使透光度为100%,再移动试样架拉手,使同一单色光通过测试溶液后照射到光电管上.如果被测样品有光吸收现象,光量减弱放大器处理,将光能的变化程度通过数字显示器显示出来.可根据需要直接在数字显示器上读取透光度(T),吸光度(A)或浓度(C).基本操作:(1)通电---仪器自检----预热20min;(2)用键设置测试方式:透射比(T),吸光度(A),已知标样浓度方式(C)和已知标样浓度斜率(K)方式;(3)波长选择:用波长调节旋钮设置所需的单色光波长;(4)放样顺序:打开样品室盖,在1~4号放置比色皿槽中,依次放入%T校具(黑体),参比液,样品液1和样品液2.(5)校具(黑体)校"0.000":将%T校具(黑体)置入光路,在T方式下按"%T"键,此时仪器自动校正后显示"0.000"(6)参比液校"100"%T或"0.000"A:将参比液拉入光路中,按"0A/100%T"键调0A/100%T,此时仪器显示"BLA",表示仪器正在自动校正,校正完毕后显示"100"%T 或"0.000"A后,表示校正完毕,可以进行样品测定.(7)样品测定:将两样品液分别拉入光路中,此时若在"T"方式下则可依次显示样品的透射比(透光度)若在"A"方式下,则显示测得的样品吸光度.7200型光栅分光光度计的使用注意事项(1)(1) 预热是保证仪器准确稳定的重要步骤.(2) 比色皿的清洁程度,直接影响实验结果.因此,特别要将比色皿清洗干净.先用自来水将用过的比色皿反复冲洗,然后用蒸馏水淋洗,倒立于滤纸片上,待干后再收回比色皿盒中.必要时,还要对比色皿进行更精细的处理,如用浓硝酸或铬酸洗液浸泡,冲洗.(3) 比色皿与分光光度计应配套使用,否则会引起较大的实验误差. 比色皿不能单个调换 1.3 7200型光栅分光光度计的使用注意事项(2)(4) 比色皿内盛液应为其容量的2/3,过少会影响实验结果,过多易在测量过程中外溢,污染仪器. 比色皿中试样装入量应为2/3～3/4之间(5) 拿放比色皿时,应持其"毛面",杜绝接触光路通过的"光面".如比色皿外表面有液体,应用绸布拭干,以保证光路通过时不受影响.(6) 若待测液浓度过大,应选用短光径的比色皿,一般应使吸光度读数处于0.1～0.8范围内为宜.由于测定空白,标准和待测溶液时使用同样光径的比色皿,故不必考虑因光径变化而引起的影响.UV-754型紫外-可见分光光度计正确使用方法2.1 紫外分光光度计法概述(1)2.1.1定义用紫外光源通过分光光度技术对物质进行测定的方法叫作紫外分光光度法.所使用的仪器叫作紫外分光光度计.2.1.2原理因为许多化合物的分子结构中存在共轭双键,在200～400nm的紫外光区具有吸收光的特性,所以无需进行显色反应便能直接测定.2.1.3应用常用于对蛋白质和核酸进行定性,定量测定.蛋白质分子中所含酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸残基在波长280nm处具有最大吸收峰.故常用波长280nm处的吸光度测定蛋白质的浓度.2.1.4特点(1) 组成核酸的碱基也含有共轭双键,其最大吸收峰的波长在260nm处.但在280nm处也有一定的光吸收,对蛋白质的测定有一定的干扰作用.若分别测定280nm和260nm处的吸光度,可通过经验公式消除核酸对蛋白质测定的影响. (2)可对微量蛋白质(1～10g/L)不需显色,进行直接定量测定.因此操作简便,而且可回收样品.此外,盐类在280nm处无光吸收,少量盐类也不会影响测定结果.(3)紫外分光光度法完全符合Lambert-Beer定律的基本原理.在其它条件保持一致的情况下,被测溶液的吸光度与被测溶液的浓度成正比.2.2 UV-754型分光光度计的结构和工作原理2.2.1仪器结构由光源(钨灯或氚灯),单色器,试样室,接受器(光电管),微电流放大器,A/C 转换器,打印机,键盘和显示器等部件组成.微处理机(CPU)通过输入,输出口(I/O)对微电流放大器,显示器和打印机等部件进行控制,实现仪器的整体功能.2.2.2工作原理UV-7 5 4型紫外-可见分光光度计光学系统1.氚灯;2.钨灯;3.滤光镜;4.聚光镜;5.入射狭缝;6.平面;7.准直镜;8.光栅;9.出射狭缝; 10.聚光镜; 11.试样室; 12.光门; 13.光电管2.2.2工作原理由光源氚灯或钨灯(1或2)发出连续辐射光线经滤光镜(3)和聚光镜(4)至单色器入射狭缝(5)处聚焦成像,再经平面反射镜(6)反射至准直镜(7)产生平行光射至光栅(8)在光栅上色散后又经准直镜(7)聚焦在出射狭缝(9)上成一连续光谱,经出射狭缝射出的光在聚光镜(10)聚光后分别通过试样室 (11)中的空白溶液(或对照溶液),标准溶液或样品溶液,被部分吸收后光经光门(12)再照射到光电管(13)上.被光电管接收的光信号再被转换成电信号,后者通过输入,输出口(I/O).进入微处理机进行调零,变换对数,浓度计算以及打印数据等处理,将检测结果通过显示器和打印系统显示出来.2.3 UV-754型分光光度计使用方法(外型)2.3.1 UV-754型紫外可见分光光度计1.试样架拉手;2.键盘部分;3.数据打印;4.波长刻度盘;5.波长手轮;6.电源汗关;7.氚灯触发按钮;8.光源室.2.3 UV-754型分光光度计使用方法(键盘) UV-754型紫外-可见分光光度计键盘详细内容说明如下:2.3 UV-754型分光光度计使用方法(键盘内容1) ①功能键: F1～F8,暂无功能,备扩展使用. ② T键: 具有三种透光度状态调节功能.③ A/C键:吸光度/浓度转换键,按此键可分别表示"吸光度0～3A","吸光度0～","吸光度0～0.1A"和"浓度"四种状态.④送入键:只在"A/C键"处于"浓度"状态时才起作用. ⑤打印键:手动方式时有效,每按一次,便打印一次数据.⑥控制键:在分别使用"设定+","设定一","倍率","显示方式"和"打印方式"各键时,需与控制键分别联合使用才起作用.⑦设定+键:在"A/C键"处于"浓度"状态时才能设定"标准浓度值","斜率K值"或"斜率B值"等数据.其功能是将设定数值增加.2.3 UV-754型分光光度计使用方法(键盘内容2) ⑧设定- 键:是使设定数值减小,操作与"设定+键"类同.⑨倍率键:用来设定标准溶液浓度的放大倍数.有"1","0.1"和"0.01"三档,与"控制键"同时按下,倍率便发生相应的变化.⑩显示方式键:可表示"积分","浓度"和"样品号"三种状态.(11) 打印方式键:存在"自动"(每移动一次试样架,仪器自动打印一次数据),"方式1"(手动方式,每按一次此键,仪器打印一次数据)和"方式2"(每分钟定时打印一次数据)三种状态.每与"控制键"同时按一次此键便改变一个状态.(12) 送纸键:每按一次此键,仪器移动一次打印纸. (13) TAC:数字显示器显示测定结果或输入的数据. 2.3.2 UV-754型紫外可见分光光度计使用方法(1) (1)测试准备①将盛有"空白"或"对照"溶液的比色皿处于试样室光路位置; ②选择波长旋动波长手轮选定所需波长;③确定光源波长在200～290nm时,选择氚灯为光源;波长在290～360nm时,同时以氚灯和钨灯为光源;波长在360～850nm时,选择钨灯为光源;若使用氚灯,需按氚灯触发按钮启动;④仪器自检显示器显示"754"后,数字显示出现"100.0",表明仪器通过自检程序,此时仪器进入"0～100%","连续"和"自动"状态(打印系统处于自动打印状态)⑤仪器预热30min后方可进行测试.2.3.2 UV-754型紫外可见分光光度计使用方法测试过程①数字显示透光度"100.0"(或吸光度"0.00")2～3s后,将盛有标准溶液的比色皿移至光路,打印系统便自动打印出所得数据;②将盛有样品溶液的比色皿移至光路,打印系统即自动打印出该样品的数据.待第一个样品数据打印完毕后,将第二个样品置于试样室光路………,若有多个样品,操作以此类推。
紫外可见分光光度法原理
紫外可见分光光度法原理
紫外可见分光光度法是一种用以测定溶液中有机物含量的快速、准确的分析方法，在医药行业、食品行业及环境检测行业中都得到了广泛的应用。
它是通过比较被测样品与标准样品的分光光度比值，从而计算指定物质的含量的方法。
紫外可见分光光度测试主要是“传感-数据处理-传感器”的模型，它通过测定样品中吸收光谱特性的分光光度，测量出样品中物质的含量。
紫外分光光度仪基于光谱对待解的化学物质暴露到指定波长范围的光源，当样品吸收光子时，两个灵敏的波长探测器计量研究的物质的定量含量。
当样品通过紫外可见分光光度仪测量时，其反应机理是：紫外可见光照射到样品中的有源化学物质，它会发生吸收并反射出去，被灵敏的光照度探测器感受到，并与用于提供参照的标准物质的反射值进行比较。
通过比较，可以确定被测样品中物质的含量，提高检测精度。
目前，紫外可见分光光度仪已成为各行各业测定物质含量的重要工具。
由于紫外可见分光光度仪的实时检测能力和快速测量功能，在医药，食品等行业中都得到了广泛应用，例如用于测试血液清液、药物相关物质含量及检测快检卡等。
紫外可见分光光度仪也可以检测一些重要耐用性性质，如油污、成分等，为企业提供检测数据及结果，以确保产品质量及符合环保要求。
总之，紫外可见分光光度法是一种用于测定溶液中有机物含量的分析方法。
它既能检测物质含量，还可以检测耐用性性质。
因此，在进行相关的材料检测时，可以采用紫外可见分光光度仪，为企业提供准确可靠的检测数据，以保证产品质量及符合环保要求。
紫外-可见分光光度法的基本原理
（ 3 ）进行化合物纯度的检查，例如可利用甲醇溶液吸收光谱中在 256nm处是否存在苯的B吸收带来确定是否含有微量杂质苯．
（4）进行有机化合物、配合物或部分无机化合物的定量测定，这是紫 外吸收光谱的最重要的用途之一。
紫外-可见分光光度法的基本原理
6、有机化合物的吸收光谱
UV-Vis光谱是分子中的价电子在分子轨道之间的 跃迁而产生（包括振动和转动能级的跃迁）。有机化 合物中有几种性质不同的价电子，有机化合物的UVVis光谱吸收光谱是三种电子跃迁的结果：
（1）溶液对光的形为及有关术语
当光束照射到物质上时,物质可以产生 反射、散射、吸收、透射。如果被照 射的是均匀的溶液，那么光的散射可 以忽略，所以对于溶液来说，对光的 就是产生一部分被溶液吸收，一部分 被界面反射，其余光则透过溶液。 I0=It+Ia+Ir Ia---吸收光的强度 It---透射光的强度 Ir---反射光的强度 Io---入射光的强度
量子化能级，仅当照射光光子的能
量（ hυ ）与被照射物质粒子的基 态和激发态能量之差相当或为其整 数倍时才能发生吸收。不同的物质 微粒由于结构不同而具有不同的量 子化能级，其能量差也不相同。所 以物质对光的吸收具有选择性。
基态能级 激发态能级
E2
E1
E0
（3）吸收曲线（吸收光谱）
吸光度(A)--波长(λ)曲线称类型的比色皿和相应 的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。
在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池
4.检测器
——利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可
测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管 （CCD）。
5. 结果显示记录系统
——检流计、数字显示、微机进行仪
紫外可见分光光度法基本原理
紫外可见分光光度法基本原理透射比和吸光度当一束平行光通过均匀的溶液介质时，光的一部分被吸收，一部分被器皿反射。
设入射光强度为L，吸收光强度为I，透射光强度为I，反射光强度为I，则0 a t rI 口= L + 】t +L在进行吸收光谱分析中，被测溶液和参比溶液是分别放在同样材料及厚度的两个吸收池中，让强度同为I0的单色光分别通过两个吸收池，用参比池调节仪器的零吸收点，再测量被测量溶液的透射光强度，所以反射光的影响可以从参比溶液中消除，则上式可简写为功=L +I t透射光强度(I t)与入射光强度(I0)之比称为透射比(亦称透射率)，用T表示，则有：I。
溶液的T越大，表明它对光的吸收越弱；反之，T越小，表明它对光的吸收越强。
为了更明确地表明溶液的吸光强弱与表达物理量的相应关系，常用吸光度(A)表示物质对光的吸收程度，其定义为：则A值越大，表明物质对光吸收越强。
T及A都是表示物质对光吸收程度的一种量度，透射比常以百分率表示，称为百分透射比，T%；吸光度A为一个无因次的量，两者可通过上式互相换算。
朗伯-比耳定律朗伯-比耳定律(Lambert-Beer)是光吸收的基本定律，俗称光吸收定律，是分光光度法定量分析的依据和基础。
当入射光波长一定时，溶液的吸光度A是吸光物质的浓度C及吸收介质厚度1(吸收光程)的函数。
朗伯和比耳分别于1760年和1852年研究了这三者的定量关系。
朗伯的结论是，当用适当波长的单色光照射一固定浓度的均匀溶液时，A与l成正比，其数学式为：A = k，l (此即称为朗伯定律，k为比例系数)而比耳的结论是，当用适当波长的单色光照射一固定液层厚度的均匀溶液时，A与C成正比，其数学表达式为：A = k'C （此即称为比耳定律，k称为比例系数）合并上述k的数值取决于吸光物质的特性外，其单位及数值还与C和1所采用的单位有关。
1通常采用cm为单位，并用b表示。
所以k的单位取决C采用的单位。
当C采用重量单位g/L时，吸收定律表达为：-1 -1A=abc（a称为吸光系数，单位为弋m）当C采用摩尔浓度mol/L时，吸收定律表达为：-1 -1A = sbc（£称摩尔吸光系数，单位为cm）有时在化合物的组成不明的情况下，物质的摩尔质量不知道，因而物质的量浓度无法确定，就不能用摩尔吸光系数，而是采用比吸光系数km，其意义是指质量分数为 1 %的溶液，用1cm吸收池时的吸光度，这时吸光度为：A - A!% belcm（c的质量百分浓度）£、a、垃三者的换算关系为：一/Mr，1湖—/Mr（Mr为吸收物质的摩尔质量）在吸收定律的几种表达式中，A =成在分析上是最常用的，£也是最常用的，有时吸收光谱的纵坐标也用£或lg£表示，并以最大摩尔吸光系数皿表示物质的吸收强度。
【仪器分析】紫外-可见分光光度法
用紫外-可见分光光度计测定物质对紫外-可
见光的吸收程度并进行定性、定量分析。
一、光的基本性质
波动性
1、光的波粒二象性
粒子性
光的波动性
光以波的形式传播，可用波长、频率来表示。 波长 ：两个相邻波峰或波谷间的距离（nm） 频率 ：单位时间里通过一固定点处波的数目（S-1） = c/ c = 3×1010 cm/s
六、紫外-可见分光光度法的应用
一、定性分析
定性分析的方法
无机物、有机物吸收光谱的特点
定性分析的方法
纯物质对照
与标准谱图对照
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标准吸收光谱谱图
Sadtler. Sdandard Spectra (Ultraviolet).
Heyden, London, 1978. 共收集了46000种化合物的紫外吸收光谱 Aromatic Compounds, Wiley, New York, 1951. 共收集了 579种芳香化合物的紫外吸收光谱
返回
光的粒子性 光由光子组成，具有能量。
△E = h = hc/
h为普朗克常数 6.63×10-34J.s根据Fra bibliotek=hc/ 可知
E越大，越小。
E越小，越大。
波谱分区 能量 大
小
紫、蓝、青、绿、黄、橙、红 书上P5
可见光波长范围400-760nm
光谱分区
能 波 量 长 大 200nm 400nm 小 760nm 2.5um 25um 中红外
1、朗伯—比耳定律 吸光度A：表征物质对光吸收程度的量。
A = lgI0/It = -lgT = kbc
T--透过率
A--吸光度
4紫外-可见分光光度法
• 2.参比溶液的选择原则：
• (1)溶剂参比：试样组成简单、共存组份少（基体干扰少）、显色剂 不吸收时，直接采用溶剂（多为蒸馏水）为参比；
• (2) 试样参比：如试样基体在测定波长处有吸收，但不与显色剂反 应时，可以试样作参比（不能加显色剂）。
紫外-可见分光光度法
紫外-可见分光光度法
一、紫外-可见分光光度法原理 二、紫外-可见分光光度计 三、紫外-可见分光光度法应用
紫外-可见分光光度法
分子的能量变化E为各种形式能量变化的总和：
ΔΕ ΔΕe ΔΕv ΔΕr
电子能级间隔比振动能级和转 动能级间隔大1~2个数量级， 在发生电子能级跃迁时，伴有 振-转能级的跃迁，形成所谓的 带状光谱。
第一节 基本原理
二 Lambert- Beer 定律
Lambert-Beer 定律适用范围： ①入射光为单色光，适用于可见、红外、紫外光。 ②均匀、无散射溶液、固体、气体。
吸光度具有加和性：
不仅适用于紫外光、可见光，也适用红外光；在同一波长下， 各组分吸光度具有加和性
A=A1+A2++An
（1）入射光必须为单色光 （2）被测样品必须是均匀介质 （3）在吸收过程中吸收物质之间不能发生相
偏离Lambert-Beer 定律的因素 1. 样品性质影响
1）待测物高浓度--吸收质点间隔变小—质点间相互作用—对特定辐射的吸收 能力发生变化--- 变化；
2）溶剂的影响：对待测物生色团吸收峰强度及位置产生影响； 3）被测溶液不均匀导致的偏离
第一节 基本原理
二 Lambert- Beer 定律
紫外可见分光光度计原理及操作
紫外可见分光光度法的原理及应用原理：紫外可见分光光度法基于物质对紫外-可见光的吸收特性进行测定。
当光线通过样品时，样品中的分子会吸收特定波长的光，从而产生吸收峰。
通过测量样品吸收的光强，可以得到样品在不同波长下的吸光度。
常用的光谱仪器是分光光度计，它能够实现对不同波长光的选择和测量。
应用：1.定量分析：紫外可见分光光度法可以用于定量分析各种物质。
根据比尔定律，吸光度与物质浓度之间存在一定的线性关系，因此可以根据吸光度测量值推算出物质的浓度。
这在医药、环境监测、食品安全等领域中具有重要意义。
2.药物分析：紫外可见分光光度法广泛应用于药物分析中。
例如，可以利用紫外光谱测定药物的浓度、纯度和含量，评价药物的质量。
同时，通过分析药物在不同波长下的吸收特性，可以了解药物的结构和反应机理，为新药的研发提供重要的信息。
3.生化分析：生物体内的很多生物分子都具有紫外可见吸收特性，这使得紫外可见分光光度法成为生化分析中常用的工具。
例如，可以通过测定蛋白质和核酸在特定波长下的吸光度来研究其构象和浓度。
此外，也可以用于测定血液中的代谢产物、激素和维生素等的浓度。
4.环境监测：在环境监测中，紫外可见分光光度法可用于分析水质、空气中的有害物质和污染物。
例如，可以利用其测定水中化学需氧量（COD）、氨氮（NH3-N）和磷酸盐等的浓度。
这对于环境保护和水质安全具有重要意义。
5.食品检测：紫外可见分光光度法在食品行业中也具有广泛应用。
可以通过测定食品中的营养成分和添加剂的含量来评价食品质量和安全性。
例如，可以测定维生素、氨基酸、酚类和色素等在食品中的含量。
总之，紫外可见分光光度法具有简单、快速、高灵敏度和高选择性等优点，且适用范围广泛。
它在化学、制药、环保、医疗和食品等领域中都有不可替代的地位，对于研究物质性质和反应机理，以及保障人类健康和环境安全都起着重要作用。
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紫外可见分光光度法基本原理紫外可见分光光度法基本原理透射比和吸光度当一束平行光通过均匀的溶液介质时光的一部分被吸收一部分被器皿反射。
设入射光强度为I0吸收光强度为Ia 透射光强度为It反射光强度为Ir则在进行吸收光谱分析中被测溶液和参比溶液是分别放在同样材料及厚度的两个吸收池中让强度同为I0的单色光分别通过两个吸收池用参比池调节仪器的零吸收点再测量被测量溶液的透射光强度所以反射光的影响可以从参比溶液中消除则上式可简写为透射光强度It与入射光强度I0之比称为透射比亦称透射率用T表示则有: 溶液的T越大表明它对光的吸收越弱反之T 越小表明它对光的吸收越强。
为了更明确地表明溶液的吸光强弱与表达物理量的相应关系常用吸光度A表示物质对光的吸收程度其定义为: 则A值越大表明物质对光吸收越强。
T及A都是表示物质对光吸收程度的一种量度透射比常以百分率表示称为百分透射比T吸光度A为一个无因次的量两者可通过上式互相换算。
朗伯-比耳定律朗伯-比耳定律Lambert-Beer是光吸收的基本定律俗称光吸收定律是分光光度法定量分析的依据和基础。
当入射光波长一定时溶液的吸光度A是吸光物质的浓度C及吸收介质厚度l吸收光程的函数。
朗伯和比耳分别于1760年和1852年研究了这三者的定量关系。
朗伯的结论是当用适当波长的单色光照射一固定浓度的均匀溶液时A与l成正比其数学式为: A kl 此即称为朗伯定律k为比例系数而比耳的结论是当用适当波长的单色光照射一固定液层厚度的均匀溶液时A与C成正比其数学表达式为: 此即称为比耳定律k称为比例系数合并上述k的数值取决于吸光物质的特性外其单位及数值还与C和l所采用的单位有关。
l通常采用cm为单位并用b表示。
所以k的单位取决C采用的单位。
当C采用重量单位g/L时吸收定律表达为: a称为吸光系数单位为当C采用摩尔浓度mol/L时吸收定律表达为: ε称摩尔吸光系数单位为有时在化合物的组成不明的情况下物质的摩尔质量不知道因而物质的量浓度无法确定就不能用摩尔吸光系数而是采用比吸光系数其意义是指质量分数为1的溶液用1cm吸收池时的吸光度这时吸光度为 : c的质量百分浓度ε、a、三者的换算关系为 Mr为吸收物质的摩尔质量在吸收定律的几种表达式中在分析上是最常用的ε也是最常用的有时吸收光谱的纵坐标也用ε或lgε表示并以最大摩尔吸光系数表示物质的吸收强度。
ε是在特定波长及外界条件下吸光质点的一个特征常数数值上等于吸光物质的浓度为1 mol/L液层厚度为1cm时溶液的吸光度。
它是物质吸光能力的量度可作为定性分析的参考和估计定量分析的灵敏度。
朗伯比耳定律朗伯比耳定律的推导如下根据量子理论光是由光子所组成其它能量为。
因此吸收光的过程就是光子被吸光质点如分子或离子的俘获使吸光质点能量增加而处于激发状态光子被俘获的几率取决于吸光质点的吸光截面积。
如图1所示图1 辐射吸收示意图如有一束强度为Io的单色平行光束垂直通过一横截面积为S的均匀溶液介质。
在吸收介质中光的强度为IxIx在光束通过介质的过程中因光能量不断被吸收而逐渐变小当光束通过一个很薄的介质层db后光强减弱了dIx 则厚度为db的吸收层对光的吸收率为量子理论表明光束强度可以看作是单位时间内流过光子的总数于是可以看作是光束通过吸收介质是每个光子被吸光物质吸收的平均几率。
另一方面由于液层厚度db为无限小所以在这个小体积单元中所以吸光质点所占的吸收截面积之和dS与横截面积S之比也可看作为该截面上光子被吸收物质吸收的几率。
因此就有如果吸收介质中含有m种不同的吸光质点而且它们之间没有相互影响设ai为第I种吸光质点对指定波长的吸收截面积dni为第I种吸光质点在db小体积单元之中的数目则代入上式则得到: 当光束通过液层厚度为b时对上式两边积分得到: 根据吸光度的定义截面积S是均匀介质的体积V与液层度b之比即SV/b代入上式得到式中NA为阿佛加德罗常数。
为第I种质点在均匀介质中的浓度Ci当V的单位为L时Ci为摩尔浓度。
将0.4343NAai合并为常数当Ci为摩尔浓度时该常数εi则得到上式表明当一束平行单色光通过一个均匀吸收介质时总吸光度等于吸收介质懈魑馕镏饰舛戎图次舛染哂屑雍托哉馐墙卸嘧分光度分析的理论基础。
当吸收介质中只含有单一种吸收物质时上式简化为——朗伯比耳定律的常用表达式与测量仪器有关的因素图2 分析谱带的选择从理论上来说朗伯比耳定律上适用于单色光即单一波长的光但是紫外可见分光光度计从光源发出的连续光经单色器分光为了满足实际测量中需要有足够光强的要求入射光狭缝必须有一定的宽度。
因此由出射光狭缝投射到被测溶液的光束并不是理论要求的严格单色光而是由一小段波长范围的复合光由分子吸收光谱是一种带状光谱吸光物质对不同波长光的吸收能力不同在峰值位置吸收能力最强ε最大用表示其他波长处ε都变小因此当吸光物质吸收复合光时表现吸光度要比理论吸光度偏低因此导致比耳定律的负偏离。
在所使用的波长范围内吸光物质的吸光系数变化越大这种偏离就越显著。
例如按图2的吸收光谱选择宽度作为入射光时吸光系数变化较小测量造成的偏离就比较小若选择谱带?的波长宽度作为入射光时吸光系数的变化很大测量造成的偏离也就很大。
所以通常选择吸光物质的最大吸收波长即吸收带峰所对应的波长作为分析的测量波长这样不仅保证有较高的测量灵敏度而且此处的吸收曲线往往较为平坦吸光系数变化比较小比耳定律的偏离也比较小。
对于比较尖锐的吸收带在满足一定的灵敏度要求下尽量避免用吸收峰的波长作为测量波长。
投射被测溶液的光束单色性即波长范围越差引起的比耳偏离也越大所以在保证足够的光强前提下采用窄的入射光狭缝以减小谱带宽度降低比耳定律的偏离。
与样品溶液有关的因素 ? 当吸收物质在溶液中的浓度较高时由于吸收质点之间的平均距离缩小邻近质点彼此的电荷分布会产生相互影响以致于改变它们对特定辐射的吸收能力即改变了吸光系数导致比耳定律的偏离。
通常只有当吸光物质的浓度小于0.01 mol/L 的稀溶液中吸收定律才成立。
? 推导吸收定律时吸光度的加和性隐含着测定溶液中各组分之间没有相互作用的假设。
但实际上随着浓度的增大各组分之间甚至同组分的吸光质点之间的相互作用是不可避免的。
例如可以发生缔合、离解、光化学反应、互变异构及配合物配位数的变化等等会使被测组分的吸收曲线发生明显的变化吸收峰的位置、强度及光谱精细结构都会有所不同从而破坏了原来的吸光度与浓度之间的函数关系导致比耳定律的偏离。
? 溶剂及介质条件对吸收光谱的影响十分重要。
溶剂及介质条件如pH值经常会影响被测物理的性质和组成影响生色团的吸收波长和吸收强度也会导致吸收定律的偏离。
? 当测定溶液有胶体、乳状液或悬浮物质存在时入射光通过溶液时有一不忿光会因散射而损失造成“假吸收”使吸光度偏大导致比耳定律得正偏离。
质点的散射强度与照射光波长的四次方成反比所以在紫外光区测量时散射光的影响更大。
? 此外吸收定律的偏离还与溶液的折射率有关摩尔吸光系数ε是真实摩尔吸光系数和溶液折射率的函数当稀溶液时n基本不变ε也基本不变而当浓度高时n变大ε变小导致比耳定律的偏离。
主要组成部件各种型号的紫外可见分光光度计就其基本结构来说都是由五个基本部分组成即光源、单色器、吸收池、检测器及信号指示系统如图3 。
图3 紫外-可见分光光度计基本结构示意图 1. 光源辐射源 ? 对光源的要求在仪器操作所需的光谱区域内能够发射连续辐射应有足够的辐射强度及良好的稳定性辐射能量随波长的变化应尽可能小光源的使用寿命长操作方便。
? 光源的种类分光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光源两类。
前者用于可见光区如钨灯、卤钨灯等后者用于紫外光区如氢灯和氘灯等。
? 钨灯和碘钨灯可使用的波长范围为340-2500nm。
这类光源的辐射能量与施加的外加电压有关在可见光区辐射的能量与工作电压的4次方成正比光电流也与灯丝电压的n次方n1成正比。
因此使用时必须严格控制灯丝电压必要时须配备稳压装置以保证光源的稳定。
? 氢灯和氘灯可使用的波长范围为160-375nm由于受石英窗吸收的限制通常紫外光区波长的有效范围一般为200-375nm。
灯内氢气压力为102Pa时用稳压电源供电放电十分稳定光强度且恒定。
氘灯的灯管内充有氢同位素氘其光谱分布与氢灯类似但光强度比同功率的氢灯大3-5倍是紫外光区应用最广泛的一种光源。
2. 单色器 ? 单色器的作用单色器是能从光源的复合光中分出单色光的光学装置其主要功能应该是能够产生光谱纯度高、色散率高且波长在紫外可见光区域内任意可调。
单色器的性能直接影响入射光的单色性从而也影响到测定的灵敏度、选择性及校准曲线的线性关系等。
? 单色器的组成单色器由入射狭缝、准光器透镜或凹面反射镜使入射光变成平行光、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等几个部分组成。
其核心部分是色散元件起分光作用。
其他光学元件中狭缝在决定单色器性能上起着重要作用狭缝宽度过大时谱带宽度太大入射光单色性差狭缝宽度过小时又会减弱光强。
? 色散元件的类型能起分光作用的色散元件主要是棱镜和光栅。
? 棱镜有玻璃和石英两种材料。
它们的色散原理是依据不同波长的光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长分开。
由于玻璃会吸收紫外光所以玻璃棱镜只适用于350-3200nm的可见和近红外光区波长范围。
石英棱镜适用的波长范围较宽为185-4000nm即可用于紫外、可见、红外三个光谱区域。
? 光栅是利用光的衍射和干涉作用制成的。
它可用于紫外、可见和近红外光谱区域而且在整个波长区域中具有良好的、几乎均匀一致的色散率且具有适用波长范围宽、分辨本领高、成本低、便于保存和易于制作等优点所以是目前用的最多的色散元件。
其缺点是各级光谱会重叠而产生干扰。
3 .吸收池吸收池用于盛放分析的试样溶液让入射光束通过。
吸收池一般有玻璃和石英两个材料做成玻璃池只能用于可见光区石英池可用于可见光区及紫外光区。
吸收池的大小规格从几毫米到几厘米不等最常用的是1厘米的吸收池。
为减少光的反射损失吸收池的光学面必须严格垂直于光束方向。
在离精度分析测定中尤其是紫外光区尤其重要吸收池要挑选配对使它们的性能基本一致因为吸收池材料本身及光学面的光学特性、以及吸收池光程长度的精确性等对吸光度的测量结果都有直接影响。
4. 光敏检测器 ? 检测器的作用检测器是一种光电转换元件是检测单色光通过溶液被吸收后透射光的强度并把这种光信号转变为电信号的装置。
? 对检测器的要求检测器应在测量的光谱范围内具有高的灵敏度对辐射能量的影响快、线性关系好、线性范围宽对不同波长的辐射响应性能相同且可靠有好的稳定性和低的噪音水平等。
? 检测器的种类检测器有光电池、光电管和光电倍增管等。
? 光电池主要是硒电池其灵敏度光区为310-800nm其中以500-600nm最为灵敏其特点是不必经放大就能产生可直接推动微安表或检流计的光电流。