核小体及其提取技术

核小体及其提取技术

核小体的形状类似一个扁平的碟子或一个圆柱体。染色质就是由一连串的核小体所组成。当一连串核小体呈螺旋状排列构成纤丝状时，DNA的压缩包装比约为40。纤丝本身再进一步压缩后，成为常染色质的状态时，DNA的压缩包装比约为1000。有丝分裂时染色质进一步压缩为染色体，压缩包装比高达8400，即只有伸展状态时长度的万分之一。

核小体是染色体的基本结构单位，由DNA和组蛋白(histone）构成，是染色质（染色体）的基本结构单位。由几种组蛋白：每一种组蛋白各二个分子，形成一个组蛋白八聚体，约200 bp的DNA分子盘绕在组蛋白八聚体构成的核心结构外面，形成了一个核小体。这时染色质的压缩包装比(packing ratio）为6左右，即DNA由伸展状态压缩了近6倍。200 bpDNA为平均长度；不同组织、不同类型的细胞，以及同一细胞里染色体的不同区段中，盘绕在组蛋白八聚体核心外面的DNA长度是不同的。如真菌的可以短到只有154 bp，而海胆精子的可以长达260bp，但一般的变动范围在180bp到200bp之间。在这 200bp中，146 bp 是直接盘绕在组蛋白八聚体核心外面，这些DNA不易被核酸酶消化，其余的DNA 是用于连接下一个核小体。连接相邻2个核小体的DNA分子上结合了另一种组蛋白H1。组蛋白H1包含了一组密切相关的蛋白质，其数量相当于核心组蛋白的一半，所以很容易从染色质中抽提出来。所有的H1被除去后也不会影响到核小体的结构，这表明H1是位于蛋白质核心之外的。

核小体是细胞染色质中的一种成分，它是由DNA和组蛋白以特殊的方式相连而组成的。在系统性红斑狼疮的诱导和致病中有重要作用。

每个核小体单位包括200bp左右的DNA超螺旋和一个组蛋白八聚体及一个分子H1；组蛋白八聚体构成核小体的盘状核心结构；146bp的DNA分子超螺旋盘绕组蛋白八聚体1.75圈,组蛋白H1在核心颗粒外结合额外20bp DNA，锁住核小体DNA的进出端，起稳定核小体的作用。包括组蛋白H1和166bp DNA的核小体结构又称染色质小体；两个相邻核小体之间以连接DNA相连，典型长度60bp，不同物种变化值为0～80bp；组蛋白与DNA之间的相互作用主要是结构性的，基本不依赖于核苷酸的特异序列，实验表明，核小体具有自组装 (self-assemble) 的性质；核小体沿DNA的定位受不同因素的影响，进而通过核小体相位改变影响

基因表达。其功能与染色质的浓缩有关，且能够进行自装配。

在80%的MRL/lprDIL小鼠中可产生核小体特异性抗体，该自身抗体产生早，先于其他抗核抗体，与肾小球肾炎有关。SLE患者多克隆核小体特异性自身抗体的抗原反应与鼠类SLE模型表现相似，核小体在SLE中作为主要自身抗原已得到证实。靶器官中免疫复合物的沉积和炎性介质（包括补体）的大量活化是引起SLE全身性组织炎症损伤的基本机制之一。核小体会成为多克隆B细胞活化剂，这可能与SLE疾病的起始阶段有关；但更重要的是，核小体是SLE中致病性T 辅助细胞识别的自身抗原，不仅引起同源B细胞产生核小体特异性自身抗体，而且引起抗DNA抗体和抗组蛋白抗体的形成。AnuA在抗ds?DNA阴性的SLE患者中有很高的阳性率（可达60%~65%)[8，16]，因此AnuA对SLE患者更具有诊断价值。已经有证据表明，除了传统的致病性抗双链DNA抗体及其抗原抗体复合物外，核小体和组蛋白成分的自身抗体及其抗原抗体复合物，在SLE的发病机制中起关键作用，尤其是在DIL肾炎致病机制上意义重大[6]。核小体的组蛋白成分（氨基末端带强阳性电荷）可促进免疫复合物与肾小球基底膜阴离子位点的结合，包括既作为植入抗原使原位免疫复合物得以形成，也可使含有核小体特异性抗体的循环免疫复合物得以沉积。在以上两种情况下，均可使肾小球基底膜的通透性增加，且产生炎性免疫应答反应。钟清等[7]研究表明，LN组患者AnuA阳性率明显高于无肾炎组，AnuA对LN的诊断和监测具有重要意义。此外，苏茵等[8]也发现AnuA与患者的皮疹、脱发、ESR增快、CRP增高、补体降低呈显著相关性，其滴度高低也与SLE疾病活动指数评分呈明显正相关。

核小体提取方法：

1、称取5g小牛胸腺*浸于150ml 0.9% NACL粉碎，得到均一悬浮液。过滤除去粗糙物。

2、悬浮液1100g，4℃离心15min。沉淀用30ml 0.9% NACL重悬离心两次。

3、沉淀用40ml蔗糖I溶液（250mM蔗糖，3mM CACL2.2H2O）重悬，5000g，4℃离心

12min。

4、沉淀用45ml蔗糖II溶液（2M蔗糖，3mM CaCl2.2H2O，0.5% Triton-Tx-100）重悬，13200g，

4℃离心22min。

5、沉淀用45ml BufferI (0.1M Tris/HCL,pH8.0) 重悬, 1100g，4℃离心15min.

6、沉淀重悬于45ml 0.9% NACL溶液，1100g，4℃离心15min。

7、沉淀重悬于40ml BufferII（15mM Tris/HCL,pH7.5, 0.15mM Nacl, 60mM KNO3,0.25M蔗

糖，5mM Cacl2.2H2O,1mM DTT），混匀，加入750UNITS核酸酶S7，37℃水浴温育30min。

4000rpm，4℃,离心15min。

8、沉淀重悬于10ml 2mM EDTA，室温振荡温育45min。4000rpm，4℃,离心15min。

9、弃上清，沉淀即为传统工艺提取的核小体。

*可为其他动物组织，如鼠肝脏、兔胸腺、或动物细胞如鸡红血球和细胞培养液等。