0040沙门氏菌生化试验检验操作规程

贵州明湖药业股份有限公司

GMP 文件

建立沙门氏菌生化检验操作规程，确保检验数据的准确性。 《中国药典》2000版一部附录XIIIC- （80-81页）。 本标准适用于沙门氏菌生化检验操作。

QC 负责人、化验员。

1使用仪器、玻璃器皿、培养基、染色剂及试剂。 1.1仪器：

托盘天平

1.2玻璃器皿：

150ml 锥开瓶、试管、载玻片

1.3试液：

1.3.1靛基质试液：取对二甲基苯甲醛5.0g ,加入乙醇75ml ，充分振摇，使完全溶解后， 再取浓

盐酸25ml 徐徐滴入（边滴边振摇，以免骤热使溶液色泽变深）即得。

1.3.2 0.9%氯化钠溶液：取氯化钠0.9g ,加入蒸馏水100ml ，微热使溶解，121E 灭菌 30分钟，

放冷，备用。

1.4染色剂：

1.4.1结晶紫染液：取结晶紫1.0g ，加入95%乙醇20ml 使溶解，加1%草酸铵水溶液 80ml ，混

匀，静置48小时使用，置密闭棕色瓶中贮存。

1.4.2碘液：取碘化钾

2.0g,加水3-5ml 使溶解，加入碘片1.0g ，使全部溶解后加水稀 释至300ml ，置密闭棕色瓶贮存。

1.4.3沙黄试液：取沙黄0.25g,加95%乙醇10ml ，使完全溶解后，加水100ml 。 1.5培养基：

目 依 范 责任人 内容

1.5.1营养肉汤增菌液：取营养肉汤试药22g，加蒸馏水1000ml微热使溶解，按每瓶100ml分装，

121C灭菌15分钟，备用。

1.5.2四硫磺酸盐增菌液：取四硫磺酸盐试药4.6g,加蒸馏水100ml微热使溶解，121C 灭菌30 分

钟，备用。

1.5.3胆盐硫化琼脂培养基：取胆盐硫化琼脂培养基试药48g,加蒸馏水1000ml加热溶化后，116C

灭菌30分钟，冷却至60C灭菌，倾注平皿，备用。

1.5.4曙红亚甲蓝琼脂培养基：取营养琼脂培养基（取营养琼脂试药4g，加水100ml，116C灭菌

备用）加热溶化后，取100ml，冷至60C按无菌操作加入灭菌的20%^L糖溶液5 ml，曙红钠指示液2ml和亚甲蓝指示液1.5ml，摇匀，倾注平皿。

1.5.5沙门、志贺菌属琼脂：取沙门、志贺菌属琼脂试药60g，加蒸馏水1000ml，放置20分钟，

用石棉网微火煮沸使完全溶解，冷至50C左右倾入无菌平皿中凝固后，备用。麦康凯琼脂培养基：取麦康凯琼脂试药55g，加蒸馏水1000ml加热使溶解，116C灭菌30 分钟，备用。

1.5.6三糖铁琼脂培养基斜面：取三糖铁琼脂试药6.4g,加蒸馏水100ml，分装小试管，121C灭

菌20分钟，倾斜摆放，凝固后备用。

脲琼脂培养基：取脲琼脂试药2.9g加蒸馏水100ml，加热使溶解，121C灭菌20分钟，备用。

1.5.7氰化钾培养基：取氰化钾培养基试药两份，每份 1.4g,分别加蒸馏水100ml，加

热使溶解，121C灭菌20分钟，冷却后，一份加氰化钾试液1.5ml，另一份不加氰化钾试液，分别分装于12mmX 100mm灭菌试管内，每管4ml，立即用灭菌橡胶塞塞紧，置冰箱4C备用。

1.5.8赖氨酸脱羧酶培养基：取赖氨酸脱羧酶培养基试药两份，每份0.9g,分别加蒸馏水100ml

加热溶解后；一份加L —赖氨酸0.1g,另一份不加作为对照，分别按每管2.5ml 分装小试管，并滴加一层液体石蜡，121C灭菌20分钟备用。

2 操作步骤：

2.1 增菌、分离培养：

2.1.1取供试品10g，加灭菌生理盐水100ml作供试品溶液，取营养肉汤增菌液3份，每份

100ml，2份分别加入10ml 供试品溶液，其中1 份加入对照菌溶液作阳性对照，第3份加入10ml灭菌生理盐水作阴性对照。置36±「C培养18—24小时，阴性对照应无菌落生长。取其余2份培养物各1ml，分别接种于四硫磺酸盐增菌培养基10ml 中，再置36± 1C培养18—24小时。分别划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基的平板上，置36 ± 1C培养18—24小时或延至40—48小时。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板无菌落生长，或有菌落生长但不同于沙门氏菌菌落形态特征表时，可判为未检出沙门氏菌。

2.1.2如供试品平板有菌落生长，或与沙门氏菌菌落形态特征表相符或疑似者，应挑选2—3个菌

落分别接种于三糖铁琼脂培养基斜面上，阳性对照同时接种该培养基，置

36± 1C培养18—24小时后阳性对照的斜面应为红色底层为黄色，硫化氢阳性，而供试品的疑

似菌斜面未见红色，底层未见黄色，可判为未检出沙门氏菌。否则，应继续做以下生化试验。

沙门氏菌菌落形态特征表

2.2生化试验：

取沙门氏菌疑似菌株的三糖铁琼脂培养基斜面培养物，作以下试验：

2.2.1靛基质试验：用接种环取少量培养物，接种于蛋白胨水培养基中，培养24小时,

沿管壁加入靛基质试液数滴，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试液本色为阴性。

2.2.2尿酶试验：用接种环沾取培养物，划线接种于脲琼脂培养基斜面置36 ±「C培养

24小时红色为阳性，不变色为阴性。

2.2.3氰化钾试验：取36± 1C培养24小时的疑似菌株营养肉汤培养液，用接种环沾取1环接种

于氰化钾培养基中，另取1环接种于对照培养基中，接种后即用橡胶塞塞紧，36± 1C培养24—48小时观察结果，两管均有菌落生长为阳性，而对照管有菌落生长，试验管无菌落生长为阴性。

2.2.4赖氨酸脱羧酶试验：取疑似菌斜面培养物分别接种于赖氨酸脱羧酶培养基及对

照培养基，置36± 1C培养24—48小时，对照管应为黄色，试验管呈紫色为阳性，呈黄色为阴性。

2.2.5动力试验：取疑似菌斜面培养物穿刺接种于半固体营养琼脂培养基中，置36±

1C培养24小时，细菌沿穿刺外周扩散生长，为动力阳性，否则为阴性。阴性培养物，应在室温保留2—3天后，再判定。

2.2.5血清凝集试验：在洁净载波片一端，以接种环取沙门氏菌属A—F “ 0”多价血清

2—3环，再取斜面上部的培养物少许，与血清混合，将玻片前后侧动，如出现凝集现象，应以0.9%氯化钠溶液与同株培养物作对照试验，无凝集现象时判为血清凝集阳性，时有反应迟缓，需将玻片与湿棉球置平皿内，约过20分钟，再观察。仍未出现凝集时，应取斜面培养物，置少量0.9%氯化钠溶液溶液中，制成浓菌悬液，在100C水浴中保温30分钟，待冷，再作凝集试验。如出现凝集，应判为阳性否则为阴性。

上述各项试验反应，一般为硫化氢阳性（或阴性），靛基质阴性，脲酶阴性，氰化钾阴性，赖氨酸脱脂酶阳性，动力阳性，A—F “0”多价血清凝集试验阳性。各鉴定结果按下表判定。

沙门氏菌检查结果判定