蛋白酶活性测定方法

将肝胰脏及肠道组织用4℃去离子水清除肠道内容物后，用滤纸吸去表面水，取样各1.0g。按样品重量加10倍的4℃冷却去离子水在冰浴下匀浆（稀释匀浆液匀浆4min,800rpm匀浆玻璃管外设冰浴）。匀浆液在4℃下离心20分钟（13，000g），上清液标号分装，并于4℃冰箱冷却保存，24Hr内测定完毕。
酶粉及饲料：
水产动物酶活性测定方法
一、分析样品的采取与处理
每箱随机各取3尾异育银鲫，称重,于冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度，剔除脂肪组织，用4℃冷却的去离子水冲洗；然后用滤纸轻轻吸去水分，放入—26℃冰箱中迅速冷却保存，供测酶活性用。
二、酶液的制备
将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后，肠道匀分三等份，从前、中、后肠分别取有代表性食靡0.5g，放入离心塑料管中，加4ml，4℃冷却去离子水稀释，4℃下离心20min（13，000g），上清液标号分装，并与4℃冰箱中冷却保存，24Hr待测。
2．2试剂
1．0.4mg/ml底物缓冲液：60ml×2瓶，4℃冰箱保存。
2．0.1mol/L碘储备液：7ml×2瓶，4℃避光保存。
0.01mol/L碘应用液的配制：将储备液：蒸馏水=1：9稀释，4℃避光保存。
2．3操作
测定管（u管）
空白管（o）管
底物缓冲液(ml)30℃预温5分钟
1.0
1.0
酶液（ml）
0.02
混匀，30℃水浴，准确反应7.5分钟
碘应用液(ml)
1.0
1.0
蒸馏水
6.0
6.02
混匀在660nm波长，1cm光径，蒸馏水调零测光密度。
2．4活性单位：
1克食靡或组织中AMS，在30℃与底物作用1min，水解1mg淀粉为1个单位。
2．5计算公式
AMSu/dl=
注：
0.4---------底物缓冲液浓度
1.5操作步骤
将酪蛋白溶液放入30℃恒温水浴中预热5min，取1ml酶液注入试管中，按以下程序操作。
酶液1ml——————————————在30℃恒温水浴中预热1—2min
+
2%酪蛋白1ml——————————加入时立即记时，精确反应10min
+
0.4MTCA 2ml—————————立即摇匀，终止反应。
1.1原理：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯乙酸（TCA）的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等），这些氨基酸可用福林试剂使之发色（蓝色反应），用分光光度计测定。
1.2蛋白酶活性单位：
1克食靡或组织在30℃，PH在7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸的酶量为1个酶活力单位。
1.3试剂
取2．0克酶粉，先用10倍PH7.0缓冲液溶解，并放在40℃水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。测定前再稀释10倍，20倍，100倍即可。
取2.0克饲料，加PH7.0缓冲液20ml溶解,并放在40℃水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。
三、酶活性测定
1.蛋白酶测定：前、中、后肠，肝胰脏。
方法：福林—酚试剂法
将各管剧烈混合并在30℃保持30min，以完全沉淀反应后过量的酪蛋白。
从水浴中取出静止10min过滤（11cm的whatman43#滤纸）
+
滤液1ml
+
0.4MNa2CO35ml
+
稀释福林试剂1ml
摇匀，30℃恒温水浴显色20分钟
测定OD值————————用720型分光光
度计测定（波长680nm）
空白试验：酶液1ml，先向其中加入三氯醋酸，然后加酪蛋白溶液。其余步骤同试验。
脂肪酶活性定义为：在上述反应条件下，1g组织中的脂肪酶1min催化脂肪水解产生1μmol脂肪酸的酶量定为一个活力单位(U)。
4——————反应ห้องสมุดไป่ตู้总体积
10——————反应10分钟
n——————酶稀释倍数
m------------------样品的质量（g）
2碘—淀粉比色法测定淀粉酶
2．1原理
淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖及糊精，在底物浓度已知并且过量的情况下，加入碘液与未水解的淀粉生成蓝色复合物，根据蓝色的深浅可推算出水解的淀粉量，从而计算AMS的活力。
1.福林试剂（已配）
2.0.4M碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g用水溶解和定容至1，000ml，存放与具胶塞的试剂瓶中。
3.0.1M三氯醋酸（TCA）：用小烧杯称取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容为1，000ml。
4.L—酪氨酸。
5.缓冲液：磷酸二氢钙—氢氧化钠缓冲液。
A：0.2mol/L KH2PO4 (ml): 50;
B：0.2mol/L NaOH(ml) 29.63
C：水（ml）120.37
PH（20℃）：7.0
6．酪蛋白溶液：精确称取酪素2.000g，先用少量0.5N氢氧化钠浸润后，加入少量缓冲液，在沸水浴中加热，经常但不要剧烈的搅拌使之完全溶解，冷却后移入100ml容量瓶中，并用相应的缓冲液定容到刻度。若定容时泡沫过多，可加入1~2滴乙醇消泡。酪蛋白溶液可在4℃保存一周，变质后不能使用。
1.4标准酪氨酸曲线的绘制
1.将精确称取L—酪氨酸（先在105℃干燥2~3Hr）100mg小心地溶于60ml 0.1mol/L HCL中制得酪氨酸溶液。酪氨酸必须完全干燥并且是色谱级别，一定要酪氨酸完全溶解，并且用去离子水稀释至1L，该溶液含酪氨酸100微克/毫升。
2.根据下面的规定，从上述储备溶液制备含酪氨酸10、20、30、40、50、70、80微克/毫升。
1.0---------活性单位定义水解1mg淀粉量
4-----------酶液稀释了4倍
0.02 --------酶液
F------------测定时稀释的倍数
W-----------样品重量（g）
]
3脂肪酶活性测定
加5mL 0.025mol/L pH7.5磷酸缓冲液和4mL聚乙烯醇橄榄油乳化液于100 mL锥形瓶中，置反应温度（37℃）水浴中预热5～10min，然后加入匀浆粗酶液1mL，准确反应30min后，立即加入95%乙醇15mL，终止酶反应。加1%酚酞指示剂3滴，用0.05mol/L标准氢氧化钠滴定至微红色，同时以1mL已变性失活的酶液做空白对照。
1.6计算公式
（公式1）
活力单位=4/10×K×OD×n/m
其中：4————反应总体积为4ml
10————反应的时间为10min
K————比色计常数
n————酶液稀释倍数
m----------样品的质量（g）
（公式2）
活力单位=∧×4×n/10/m
其中：∧——————酶活力测定的光密度值，在标准曲线上查得响应的酪蛋白的微克数。
3.移取上述溶液2ml，加入一系列试管中，加5ml 0.4M Na2CO3然后加稀释的福林试剂1ml至各试管，立即混合均匀，并在30℃恒温水浴中显色20min，以721型（或72型）分光光度计在波长680nm处测定光密度（O。D值）。
4.计算K值；以OD值为纵坐标，酪氨酸溶度为横坐标，绘制标准曲线，`微克数，确定K值。