模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定资料讲解
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十三 模式植物拟南芥T-DNA插入 突变体的PCR鉴定
一、实验目的：
▪ 1. 学习用PCR方法检测生物遗传差异； ▪ 2. 了解植物T-DNA插入突变体的鉴定原理。
二、实验原理
1. Ti质粒和T-DNA ▪ Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的
DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自 发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上的这一段能转 移的DNA被叫做T-DNA。人们根据这一现象，将Ti质粒进 行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，通过农杆菌 侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。 2. T-DNA插入基因内部导致基因突变 ▪ T-DNA插入到植物染色体上的什么位置，是随机的。如果 T-DNA插入某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区， 将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物 细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
提取动物、植物、微生物基因组的DNA所面 临的问题不尽相同，在这个实验中学习植物 总DNA提取与鉴定。
▪ 本实验采用CTAB法。 CTAB的主要作用是破膜。
CTAB属阳离子表面活性剂，能溶解膜蛋白与脂类，也 可解聚核蛋白。在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白 质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，但 是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘 多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括 E.coli的某些株）中制备纯化DNA 。
一个好的分离程序应符合三个标准： ①所得DNA的纯度满足下游操作要求； ②所得DNA应完整； ③所得DNA量足够。
DNA在化学上是稳定的，但它在物理上是易 碎的，高分子质量的DNA长而弯曲，即具有 极微弱的侧向稳定性，易受到最柔和的流体 剪切力的伤害，由吸液、振荡、搅拌所致的 水流能剪切断DNA双链。
▪ 酚/氯仿/异戊醇的作用是去除核酸制品中的蛋白质，并 有利于水相与有机相的分开，而且可以消除泡沫。
▪ 异丙醇或乙醇的作用是脱去DNA周围水分子，使DNA 失水而聚合沉淀。
2、药品
▪CTAB提取液（1000 ml）组成： 20 g CTAB
▪
100 ml 1 M Tris-HCl pH 8.0
▪
40 ml 0.5 M EDTA pH 8.0
wenku.baidu.com
3. DNA提取步骤
1. 用液氮将100 mg 幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5 ml 离心管中，加入预热至65℃的600 μl 的2×CTAB提取液，轻摇混匀。
2. 65℃水浴1 h，其间轻摇混匀。 3. 12000 rpm离心15 min，弃沉淀，取上清转移至另一1.5 ml 离心管中。 4. 向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀10 min，然后12000 rpm离心15
左引物 LP： TCATCCACCATGGAAGAAAAG 右引物 RP：
TTGGATACGATGCGAGTAACC 中间引物LB: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 用LP+RP产生大带：1107bp 用LB+RP产生小带：560-860bp
三、实验步骤
▪ 实验材料：拟南芥T-DNA插入突变体分 离群体30个株号的植株。
▪ 实验方法：（每人做1个株号的检测）
(一) 拟南芥基因组DNA提取
1. 原理
▪ 分离动物、植物、微生物DNA是进行遗传操
作（基因组DNA序列分析、遗传标记分析、基 因克隆、基因定位）的第一个步骤。不同的研 究目的对DNA的纯度和产量要求不同。 ▪ 如：构建基因文库及用于限制性片断长度多态 (RFLP)等对纯度要求高； ▪ 用于PCR分析的DNA则应不含干扰PCR反应的 污染物； ▪ 用于遗传标记分析的DNA，纯度要求低但产量 则要高。
3. 用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体
▪ 农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中， 有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在 突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分 离群体中将纯合突变体鉴定出来。
▪ PCR方法为鉴定纯合突变体提供了有利手段。它利用三 个引物LP、RP和BP，其中LP和RP是植物基因组上TDNA插入位点两测的引物，BP是T-DNA区段上的引物。 经过PCR，在野生型植株，LP和RP这对引物扩增出分子 量较大的产物（野生型基因，大带）；在杂合突变体， LP和RP能扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大 带），另外BP和RP还能扩增出分子量较小的产物（小 带）；在纯合突变体，只有BP和RP能扩增出分子量较小 的产物（小带）。因此，利用以上三种引物做PCR，根 据扩增结果能够容易地从群体中区分出纯合突变体。
min，再转移上清入新管。 5. 向上清液中加等体积的冷异丙醇，小心混匀。-20 ℃ 放置30 min，12000 rpm离心10 min，
弃上清。 6. 用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。 7. 将沉淀在超净工作台上吹干，或空气中晾干。加50 μl TE (pH 8.0)放4 ℃缓慢溶解。 8. 电泳检测DNA的浓度和质量。
注意事项
▪ 1．研磨后应迅速加入提取液，因为提取液中含 EDTA，能够螯合Mg2+等二价阳离子，防止破碎 细胞中的DNA酶降解DNA。
▪ 2．提取过程中，避免剧烈震荡，以免对DNA造 成不必要的机械损伤。
▪ 3. 干燥DNA时，要注意过干或过湿都不利于 DNA的溶解。
（二） PCR反应
步骤
▪ 1. 按如下方法调制PCR反应液，因每管加样量少，可几人一组预混除模板DNA之外的 成分。分装后各人再加入自己的模板DNA。PCR管上注意写明株号和引物类型：
▪ 第一管：
▪
10xTaq buffer
▪
81.8 g NaCl
▪
0.2%(V/V)β-巯基乙醇
▪注：先将除巯基乙醇之外的药品配好，高压蒸汽灭菌后加入巯基乙醇
▪酚/氯仿/异戊醇： 25：24：1
▪氯仿/异戊醇： 24：1
▪TE缓冲液：Tris-HCl (pH 8.0) 10 mmol/L，EDTA 1 mmol/L
▪3 M NaAc（pH 5.2）
一、实验目的：
▪ 1. 学习用PCR方法检测生物遗传差异； ▪ 2. 了解植物T-DNA插入突变体的鉴定原理。
二、实验原理
1. Ti质粒和T-DNA ▪ Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的
DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自 发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上的这一段能转 移的DNA被叫做T-DNA。人们根据这一现象，将Ti质粒进 行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，通过农杆菌 侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。 2. T-DNA插入基因内部导致基因突变 ▪ T-DNA插入到植物染色体上的什么位置，是随机的。如果 T-DNA插入某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区， 将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物 细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
提取动物、植物、微生物基因组的DNA所面 临的问题不尽相同，在这个实验中学习植物 总DNA提取与鉴定。
▪ 本实验采用CTAB法。 CTAB的主要作用是破膜。
CTAB属阳离子表面活性剂，能溶解膜蛋白与脂类，也 可解聚核蛋白。在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白 质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，但 是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘 多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括 E.coli的某些株）中制备纯化DNA 。
一个好的分离程序应符合三个标准： ①所得DNA的纯度满足下游操作要求； ②所得DNA应完整； ③所得DNA量足够。
DNA在化学上是稳定的，但它在物理上是易 碎的，高分子质量的DNA长而弯曲，即具有 极微弱的侧向稳定性，易受到最柔和的流体 剪切力的伤害，由吸液、振荡、搅拌所致的 水流能剪切断DNA双链。
▪ 酚/氯仿/异戊醇的作用是去除核酸制品中的蛋白质，并 有利于水相与有机相的分开，而且可以消除泡沫。
▪ 异丙醇或乙醇的作用是脱去DNA周围水分子，使DNA 失水而聚合沉淀。
2、药品
▪CTAB提取液（1000 ml）组成： 20 g CTAB
▪
100 ml 1 M Tris-HCl pH 8.0
▪
40 ml 0.5 M EDTA pH 8.0
wenku.baidu.com
3. DNA提取步骤
1. 用液氮将100 mg 幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5 ml 离心管中，加入预热至65℃的600 μl 的2×CTAB提取液，轻摇混匀。
2. 65℃水浴1 h，其间轻摇混匀。 3. 12000 rpm离心15 min，弃沉淀，取上清转移至另一1.5 ml 离心管中。 4. 向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀10 min，然后12000 rpm离心15
左引物 LP： TCATCCACCATGGAAGAAAAG 右引物 RP：
TTGGATACGATGCGAGTAACC 中间引物LB: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 用LP+RP产生大带：1107bp 用LB+RP产生小带：560-860bp
三、实验步骤
▪ 实验材料：拟南芥T-DNA插入突变体分 离群体30个株号的植株。
▪ 实验方法：（每人做1个株号的检测）
(一) 拟南芥基因组DNA提取
1. 原理
▪ 分离动物、植物、微生物DNA是进行遗传操
作（基因组DNA序列分析、遗传标记分析、基 因克隆、基因定位）的第一个步骤。不同的研 究目的对DNA的纯度和产量要求不同。 ▪ 如：构建基因文库及用于限制性片断长度多态 (RFLP)等对纯度要求高； ▪ 用于PCR分析的DNA则应不含干扰PCR反应的 污染物； ▪ 用于遗传标记分析的DNA，纯度要求低但产量 则要高。
3. 用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体
▪ 农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中， 有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在 突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分 离群体中将纯合突变体鉴定出来。
▪ PCR方法为鉴定纯合突变体提供了有利手段。它利用三 个引物LP、RP和BP，其中LP和RP是植物基因组上TDNA插入位点两测的引物，BP是T-DNA区段上的引物。 经过PCR，在野生型植株，LP和RP这对引物扩增出分子 量较大的产物（野生型基因，大带）；在杂合突变体， LP和RP能扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大 带），另外BP和RP还能扩增出分子量较小的产物（小 带）；在纯合突变体，只有BP和RP能扩增出分子量较小 的产物（小带）。因此，利用以上三种引物做PCR，根 据扩增结果能够容易地从群体中区分出纯合突变体。
min，再转移上清入新管。 5. 向上清液中加等体积的冷异丙醇，小心混匀。-20 ℃ 放置30 min，12000 rpm离心10 min，
弃上清。 6. 用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。 7. 将沉淀在超净工作台上吹干，或空气中晾干。加50 μl TE (pH 8.0)放4 ℃缓慢溶解。 8. 电泳检测DNA的浓度和质量。
注意事项
▪ 1．研磨后应迅速加入提取液，因为提取液中含 EDTA，能够螯合Mg2+等二价阳离子，防止破碎 细胞中的DNA酶降解DNA。
▪ 2．提取过程中，避免剧烈震荡，以免对DNA造 成不必要的机械损伤。
▪ 3. 干燥DNA时，要注意过干或过湿都不利于 DNA的溶解。
（二） PCR反应
步骤
▪ 1. 按如下方法调制PCR反应液，因每管加样量少，可几人一组预混除模板DNA之外的 成分。分装后各人再加入自己的模板DNA。PCR管上注意写明株号和引物类型：
▪ 第一管：
▪
10xTaq buffer
▪
81.8 g NaCl
▪
0.2%(V/V)β-巯基乙醇
▪注：先将除巯基乙醇之外的药品配好，高压蒸汽灭菌后加入巯基乙醇
▪酚/氯仿/异戊醇： 25：24：1
▪氯仿/异戊醇： 24：1
▪TE缓冲液：Tris-HCl (pH 8.0) 10 mmol/L，EDTA 1 mmol/L
▪3 M NaAc（pH 5.2）