模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定资料讲解
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▪ 第一管:
▪
10xTaq buffer
min,再转移上清入新管。 5. 向上清液中加等体积的冷异丙醇,小心混匀。-20 ℃ 放置30 min,12000 rpm离心10 min,
弃上清。 6. 用70%乙醇洗涤沉淀一次,12000 rpm稍离心,弃上清。 7. 将沉淀在超净工作台上吹干,或空气中晾干。加50 μl TE (pH 8.0)放4 ℃缓慢溶解。 8. 电泳检测DNA的浓度和质量。
▪
81.8 g NaCl
▪
0.2%(V/V)β-巯基乙醇
▪注:先将除巯基乙醇之外的药品配好,高压蒸汽灭菌后加入巯基乙醇
▪酚/氯仿/异戊醇: 25:24:1
▪氯仿/异戊醇: 24:1
▪TE缓冲液:Tris-HCl (pH 8.0) 10 mmol/L,EDTA 1 mmol/L
▪3 M NaAc(pH 5.2)
左引物 LP: TCATCCACCATGGAAGAAAAG 右引物 RP:
TTGGATACGATGCGAGTAACC 中间引物LB: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 用LP+RP产生大带:1107bp 用LB+RP产生小带:560-860bp
三、实验步骤
▪ 实验材料:拟南芥T-DNA插入突变体分 离群体30个株号的植株。
3. 用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体
▪ 农杆菌Ti质粒转化植物细胞后,在获得的后代分离群体中, 有T-DNA插入的纯合突变体,杂合突变体,和野生型。在 突变体研究中,需要的材料是纯合突变体,所以必须从分 离群体中将纯合突变体鉴定出来。
▪ PCR方法为鉴定纯合突变体提供了有利手段。它利用三 个引物LP、RP和BP,其中LP和RP是植物基因组上TDNA插入位点两测的引物,BP是T-DNA区段上的引物。 经过PCR,在野生型植株,LP和RP这对引物扩增出分子 量较大的产物(野生型基因,大带);在杂合突变体, LP和RP能扩增出分子量较大的产物(野生型基因,大 带),另外BP和RP还能扩增出分子量较小的产物(小 带);在纯合突变体,只有BP和RP能扩增出分子量较小 的产物(小带)。因此,利用以上三种引物做PCR,根 据扩增结果能够容易地从群体中区分出纯合突变体。
▪ 实验方法:(每人做1个株号的检测)
(一) 拟南芥基因组DNA提取
1. 原理
▪ 分离动物、植物、微生物DNA是进行遗传操
作(基因组DNA序列分析、遗传标记分析、基 因克隆、基因定位)的第一个步骤。不同的研 究目的对DNA对纯度要求高; ▪ 用于PCR分析的DNA则应不含干扰PCR反应的 污染物; ▪ 用于遗传标记分析的DNA,纯度要求低但产量 则要高。
十三 模式植物拟南芥T:
▪ 1. 学习用PCR方法检测生物遗传差异; ▪ 2. 了解植物T-DNA插入突变体的鉴定原理。
二、实验原理
1. Ti质粒和T-DNA ▪ Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒,该质粒上有一段特殊的
DNA区段,当农杆菌侵染植物细胞时,该DNA区段能自 发转移,插入植物染色体DNA中,Ti质粒上的这一段能转 移的DNA被叫做T-DNA。人们根据这一现象,将Ti质粒进 行改造,将感兴趣的基因放进T-DNA区段中,通过农杆菌 侵染植物细胞,实现外源基因对植物的遗传转化。 2. T-DNA插入基因内部导致基因突变 ▪ T-DNA插入到植物染色体上的什么位置,是随机的。如果 T-DNA插入某个功能基因的内部,特别是插入到外显子区, 将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物 细胞,是获得植物突变体的一种重要方法。
▪ 酚/氯仿/异戊醇的作用是去除核酸制品中的蛋白质,并 有利于水相与有机相的分开,而且可以消除泡沫。
▪ 异丙醇或乙醇的作用是脱去DNA周围水分子,使DNA 失水而聚合沉淀。
2、药品
▪CTAB提取液(1000 ml)组成: 20 g CTAB
▪
100 ml 1 M Tris-HCl pH 8.0
▪
40 ml 0.5 M EDTA pH 8.0
3. DNA提取步骤
1. 用液氮将100 mg 幼嫩叶片研磨成细粉,置于1.5 ml 离心管中,加入预热至65℃的600 μl 的2×CTAB提取液,轻摇混匀。
2. 65℃水浴1 h,其间轻摇混匀。 3. 12000 rpm离心15 min,弃沉淀,取上清转移至另一1.5 ml 离心管中。 4. 向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),轻轻混匀10 min,然后12000 rpm离心15
提取动物、植物、微生物基因组的DNA所面 临的问题不尽相同,在这个实验中学习植物 总DNA提取与鉴定。
▪ 本实验采用CTAB法。 CTAB的主要作用是破膜。
CTAB属阳离子表面活性剂,能溶解膜蛋白与脂类,也 可解聚核蛋白。在高离子强度的溶液里,CTAB与蛋白 质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物,但 是不能沉淀核酸。因此,CTAB可以用于从大量产生粘 多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌(包括 E.coli的某些株)中制备纯化DNA 。
注意事项
▪ 1.研磨后应迅速加入提取液,因为提取液中含 EDTA,能够螯合Mg2+等二价阳离子,防止破碎 细胞中的DNA酶降解DNA。
▪ 2.提取过程中,避免剧烈震荡,以免对DNA造 成不必要的机械损伤。
▪ 3. 干燥DNA时,要注意过干或过湿都不利于 DNA的溶解。
(二) PCR反应
步骤
▪ 1. 按如下方法调制PCR反应液,因每管加样量少,可几人一组预混除模板DNA之外的 成分。分装后各人再加入自己的模板DNA。PCR管上注意写明株号和引物类型:
一个好的分离程序应符合三个标准: ①所得DNA的纯度满足下游操作要求; ②所得DNA应完整; ③所得DNA量足够。
DNA在化学上是稳定的,但它在物理上是易 碎的,高分子质量的DNA长而弯曲,即具有 极微弱的侧向稳定性,易受到最柔和的流体 剪切力的伤害,由吸液、振荡、搅拌所致的 水流能剪切断DNA双链。