实验十、模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定-23页精选文档

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t-DNA插入突变体检测

2.2.3.6.点样完成后，加上110v电压，跑胶大约30-40分钟，直到DNA大概跑到凝胶的三分之二处；
2.2.3.7.取出凝胶，放入EB（溴乙锭，强突变剂，剧毒慎碰）染液中染色10-15分钟；
2.2.3.8.之后放入凝胶成像仪中，观察DNA跑胶的情况。
3.结果
3.1.第一次
TPS法提取44号样品DNA，以DL2000为Marker。
DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer（本实验中为TAE）中带负电, 在电场中向正极移动。自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；同样条件对Marker电泳；起到鉴定的作用。不同浓度的琼脂糖凝胶对应线状DNA分子分离范围不同。（如下图）
本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确东样品是否为T-DNA插入突变纯和体。
PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。（PCR基本原理如右图）
4.2.实验分析
4.2.1.加液氮碾磨叶片时，最好保持离心管中始终有液体氮存在，如果碾磨一段时间后中途要加液氮继续碾磨，一定注意，液氮沸腾时极易将已经碾磨好的叶片吹走；另一点，碾磨时要迅速，避免空气中的水汽在离心管上凝结。
4.2.2.DNA有一定的物理脆性，所以在提取过程中混匀时一定要缓慢的摇晃，切忌剧烈震荡。

T-DNA插入鉴定实验报告

T-DNA插入突变体的鉴定时明辉同组者：薛敏学号：201000220069摘要 Ti质粒是上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。

所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。

将感兴趣的基因改造插入到T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化，得到含有突变的植株。

通过本实验，我们将学习如何用PCR的方法检测所得植株是否为T-DNA的插入突变体。

1.引言T-DNA作为一种实验常用的遗传转化方法，在插入突变过程中，插入到植物染色体上的位置是随机的。

如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。

所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。

农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA 插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。

在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。

本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确定样品是否为T-DNA插入突变纯和体。

PCR（Polymerase ChainReaction），即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。

（PCR基本原理如右图）DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer（本实验中为TAE）中带负电, 在电场中向正极移动。

自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；同样条件对Marker电泳；起到鉴定的作用。

拟南芥TDNA插入突变体的鉴定

遗传学实验报告拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定一、实验目的：1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。

二、实验原理1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。

植株形态个体小，高度只有30cm左右；生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；种子多，每株可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；遗传转化简单，转化效率高；基因组小，只有5对染色体，125MB；在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。

2、突变体突变体是遗传学研究的最重要材料。

突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。

拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。

由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。

3、T-DNA插入突变原理T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。

人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。

除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。

4、T-DNA插入突变体PCR鉴定图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计三、实验材料1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。

拟南芥属植物分子遗传学和突变体筛选研究方法

拟南芥属植物分子遗传学和突变体筛选研究方法随着生物技术的快速发展，从分子到基因组层面的遗传研究已经成为许多生物学实验室的重要研究方向。

拟南芥(Arabidopsis thaliana)则是其中一种最常用的模式植物，它拥有许多基因遗传和发育过程的相似性，因此被广泛用于生物学研究。

本文将着重介绍拟南芥属植物分子遗传学和突变体筛选研究方法。

1. DNA转化和质粒构建在拟南芥基因研究中，DNA转化和质粒构建是十分重要的实验方法。

DNA转化即将外源DNA导入拟南芥细胞内，常使用的方法有冷冻处理法、电穿孔法等。

而质粒通常可以用于转化拟南芥细胞，以研究基因结构、调节元件、绿色荧光蛋白构建等。

2. 基因敲除基因敲除是在已知某个基因的功能和表达模式，并通过基因突变得以验证。

敲除分为生理性敲除和人工性敲除两种，其中后者可以通过质粒导入方法实现。

基因敲除在拟南芥遗传学研究中被广泛应用，可以探究基因对于生长发育过程的途径以及在各种逆境下的适应能力等。

3. 基因表达基因表达研究是在基因的各种调节元件上构建不同启动子，将被测量的基因与这些元件进行组合，从而研究基因表达的条件和模式。

例如通过全基因组转录组分析方法，可以了解到各种条件对基因表达的影响。

基因表达研究在植物逆境抗性和发育过程等方面都有广泛的应用。

4. 突变体筛选突变体是指基因序列中发生变异引起的表型重要变化，通常是由于自然或人为诱变引起。

突变体的筛选在拟南芥属植物分子遗传学中有着重要的地位。

目前已开发出几十种突变体筛选方法，包括靶向突变、随机诱变、胚乳培养及基因组分析等。

通过筛选突变体，我们可以了解到基因在植物生长发育中的重要性和相互间的关系。

5. 遗传交叉和构建突变遗传交叉是通过交叉杂交的方式寻找某一特定基因或显性性状的控制，以了解基因型和表型特征之间的关系。

而构建突变则是利用特定的载体将人工合成的单个核苷酸序列插入到目的基因中，从而创造特定的基因突变。

这些方法在研究基因调控途径、寻找新型基因等方面都有着重要的应用。

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。

T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。

野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。

所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。

因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。

在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。

T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。

在本实验中使用三引物法。

三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。

野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。

上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。

此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。

图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。

能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。

并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。

本实验使用CATB抽提DNA。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。

它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。

拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定

拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定余振洋（高山山、潘红芳）、09级生技1班、200900140156、2011/12/14摘要本实验通过CTAB法提取目的拟南芥的DNA，再用三引物法PCR扩增所需的目的基因后，用电泳检测该拟南芥是否为转基因的拟南芥，并判断其是纯合突变还是杂合突变。

关键词拟南芥;T-DNA；突变纯和体1．引言T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列，它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。

T—DNA在植物中一般都以低拷贝插入，多为单拷贝。

单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中，就会表现出孟德尔遗传特性，在后代中长期稳定表达，且插入后不再移动，便于保存。

T—DNA插入突变在反向遗传学和功能基因组学研究中发挥着重要作用。

，T—DNA插入突变能方便地进行正向和反向遗传学研究，因而受到重视。

同时，基因组测序工作的完成使得从位点到表型的反向遗传学研究成为可能，从而使通过T—DNA插入技术构建突变体来研究功能的反向遗传学技术逐渐取代了传统的化学诱变、图位克隆等技术。

借助于农杆菌介导的遗传转化技术，T—DNA插入技术已被广泛应用于拟南芥等模式植物的突变体库构建中。

以T—DNA作为插入元件，不但能破坏插入位点基因的功能，而且能通过插入产生的功能缺失突变体的表型及生化特征的变化，为该基因的研究提供有用的线索。

由于插入的T—DNA序列是已知的，因此可以通过已知的外源基因序列，利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析，并对比突变的表型研究基因的功能。

还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，对基因进行更全面的分析。

由此可见，T—DNA 插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。

CTAB法提取植物叶片中的DNA是我们常用的方法。

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。

拟南芥atcwinv1基因T_DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察

河南农业科学,2011,40(5):62 66Jour nal of H enan Ag ricultural Sciences拟南芥atcwinv1基因T DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察阮燕晔*,张莹,王波(沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁沈阳110866)摘要:以拟南芥atcw inv1基因T DNA插入纯合突变体和野生型植株为材料,比较研究了2种基因型植株在营养期和生殖期的形态差异。

结果表明:拟南芥atcw inv1基因T DNA插入纯合突变体(简称突变体)较野生型萌发率平均下降5 88个百分点;突变体在44d抽薹,较野生型延后4d;分支数平均4支,较野生型下降20 84%;果荚开裂时间6d左右,较野生型延长2d;单株果荚数平均62 27个,较野生型降低11 00%;单株果荚种粒数平均45 87粒,较野生型降低21 46%;突变体的单果荚长度平均14 52cm,较野生型降低10 24%;单株果质量平均50 83mg,较野生型降低23 70%。

拟南芥突变体在营养生长时期的株高平均10 44cm,较野生型下降21 03%;主根长平均7 62cm,较野生型下降14 96%;单株莲座叶面积平均3 16cm2,较野生型下降13 90%;单株地上部分鲜质量平均81 81m g,较野生型下降11 11%;单株根鲜质量平均6 21m g,较野生型下降17 64%;单株地上部分干质量平均6 17m g,较野生型下降15 60%;单株根干质量平均0 55mg,较野生型下降6 78%。

拟南芥突变体在生殖生长时期的株高平均18 78cm,较野生型增加4 22%;主根长平均16 48cm,较野生型下降5 88%;单株莲座叶面积平均6 80cm2,较野生型下降6 21%;单株地上部分鲜质量平均129 85mg,较野生型下降9 69%;单株根鲜质量平均9 97mg,较野生型下降13 23%;单株地上部分干质量平均9 22mg,较野生型下降4 16%;单株根干质量平均0 70mg,较野生型下降6 67%。

拟南芥突变体的功能鉴定及应用

拟南芥突变体的功能鉴定及应用拟南芥是一种模式植物，因其具有小型、短周期、基因底子丰富等特点，成为了植物学和遗传学领域的研究工具。

通过突变体的筛选，拟南芥成为了研究植物生长发育和基因功能的重要模式植物之一。

在拟南芥突变体筛选中，以T-DNA插入技术为主，通过敲定不同基因，以观察植物的生长发育状态，挖掘新的生物学机制。

拟南芥突变体是利用突变体筛选技术，自然形成的或通过基因操作人工获得，产生了某些特殊表型的植物。

以T-DNA插入技术为例，将T-DNA随机插入到植物基因组中，导致部分基因的功能紊乱，从而产生了特殊的表型表现。

因此，拟南芥突变体不仅具有丰富的基因型资源，也是研究基因功能、分子生物学和植物生长发育的重要材料，其发现和应用有直接联系。

因此，如何鉴定拟南芥突变体的功能尤为重要。

目前鉴定方法主要包括：表型分析、基因克隆、启动子分析、蛋白质相互作用网络分析、分子标记等技术手段。

表型分析是首先考虑的鉴定方法，通过比较突变体与野生型在不同生长条件下的表型差异，筛选出表现异常的突变体。

对鉴定有难度的突变体，使用其他鉴定方法，如基因克隆，会有更好的效果。

其中，启动子元素克隆有助于探究基因表达特异性。

蛋白质相互作用网络分析有用于探究基因调控网络方式。

分子标记在表型特征不明显时，如果phentoype特征无法激活突变体，可以发现突变原因及搜索对应的遗传切口。

同时，拟南芥突变体在研究中的应用也非常广泛。

例如：研究花器官发育中的关键基因，通过拟南芥突变体突变鉴定方法，筛选出相关基因，进而探究开花的分子机制。

利用拟南芥突变体进行耐盐性、耐旱性等方面的研究。

在探究植物防御基因的调节网络时，拟南芥突变体也广泛地使用。

此外，还可用作药物和环境污染物筛选的生物传感材料，如zinc、生物染色体修复等方面的研究。

拟南芥突变体是全面了解植物生物学机理的重要材料，是揭示生长发育和基因功能的主要途径之一。

随着逆境应对、营养吸收、发育调控等方向的研究的深入，对拟南芥突变体的催生和应用必将愈加广泛。

植物DNA提取——拟南芥

【实验目的】1、采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体和琼脂糖凝胶电泳。

2、掌握CTAB法从植物叶片中提取DNA的原理和方法。

3、掌握应用PCR技术扩增目的基因的原理和方法。

4、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作和原理及分析方法。

【实验原理】DNA是分子生物学研究的基本材料，依不同实验目的采取相应的抽提DNA方法，获取数量、质量不等的DNA。

CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，也称六癸基三甲基溴化铵)是一种非离子去污剂，用CTAB法抽提植物总DNA，操作简便、快速、产量高，但纯度稍次，适用于一般分子生物学操作。

在DNA提取过程中，第一步就是使组织细胞破裂后释放出DNA，第二步就是DNA与其他细胞组分如蛋白质、碳水化合物、膜和细胞壁相分离。

在这个方法中，植物细胞首先在液氮中冰冻，然后用研钵或植物粉碎机研磨，使组织细胞破裂后释放出D14A。

研磨好的组织置于预热的1．5×CTAB(高盐1．05mol/L NaCl)缓冲溶液中，加热至65℃。

此时CTAB可与核酸形成复合物，这种复合物在高盐(＞0．7mol/L)溶液中是可溶的，并且可以稳定存在，而细胞壁纤维和大部分变性蛋白质则沉淀，从而从DNA中去除污染物，而部分蛋白质及多糖(酶抑制剂)仍溶于溶液中。

β-琉基乙醇可抑制多酚氧化酶的氧化，防止植物组织发黄变褐。

经过初次保温后，氯仿／异戊醇抽提就可除去仍溶于溶液中的蛋白质、多糖，最后用乙醇沉淀DNA(CTAB-核酸复合物在低盐溶液中因溶解度降低而沉淀)，并洗去CTAB。

分离纯化核酸总的原则，一是要保证核酸一级结构的完整性；二是要排除其他分子的污染。

抽提的DNA中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子，且其他生物大分子的污染应降到最低程度。

Ti质粒和T-DNA：Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。

模式植物拟南芥T

模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定摘要当农杆菌侵染植物细胞时，土壤农杆菌的天然质粒—Ti质粒上T-DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入染色体DNA中。

拟南芥的T-DNA插入变异是反向遗传学进行植物生物学研究的重要手段之一，在获得的Ti质粒转化植物细胞后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型，在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。

本实验以拟南芥植株的特定基因突变体作为实验材料，提取DNA，并通过PCR扩增及SDS-PAGE电泳分离检测鉴定，检测该拟南芥是否为转基因的拟南芥，并判断其是纯合突变还是杂合突变。

本次实验目的在于了解拟南芥T-DNA插入突变体鉴定的原理，掌握DNA提取技术、PCR技术以及电泳鉴定技术，对拟南芥的基因型做出判断。

关键词T-DNA插入突变体拟南芥 PCR 琼脂糖凝胶电泳1.引言1.1遗传研究途径（1）正向遗传学研究杂交或诱变→表型观察→遗传规律→确定存在的基因及数目→基因的功能及作用性质。

（2）反向遗传学研究在已知DNA序列的基础上，通过DNA重组、定点突变、插入/缺失等遗传修饰手段创造突变体并研究突变所造成的表型效应，从而研究基因的生物学功能，阐明生命的本质现象与规律。

拟南芥的T-DNA插入变异是反向遗传学进行植物生物学研究的重要手段之一。

1.2模式生物——拟南芥拟南芥广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原因主要基于该植物具有以下特点：①植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵；②生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需6周左右；③种子多，每株每代可产生数千粒种子；④形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；⑤基因组小，只有5对染色体；⑥拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。

模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定摘要：通过本次实验，了解了拟南芥T-DNA插入突变体鉴定的原理，掌握了DNA提取技术、PCR技术以及电泳鉴定技术，对拟南芥的基因型做出判断。

实验首先提取拟南芥的DNA，将获得的DNA进行PCR扩增，将扩增好的DNA加入上样缓冲液后与DNAmarker一起进行电泳，用凝胶成像系统对凝胶进行处理，可以看到大小不同的DNA条带分离。

通过这种方法鉴定出拟南芥是否为突变体。

关键词：T-DNA插入突变体、DNA提取、PCR、电泳鉴定、凝胶成像系统1.前言拟南芥作为生物学研究的模式植物，由于其易于种植、生活周期短、遗传背景清晰、易于转基因操作等特点，已被广泛应用于植物学的各种基础和应用研究领域中。

同时，拟南芥T—DNA饱和突变体库的建立和T-DNA侧翼序列的确定，为功能基因组学提供了丰富、有效的遗传材料。

2.实验2.1实验目的（1）提取植物基因组DNA的方法；（2）PCR操作方法；（3）琼脂糖凝胶分离核酸方法。

2.2实验原理Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。

所以Ti质粒上的这一段能够转移的DNA被叫做T-DNA。

将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中没通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。

T-DNA插图到植物染色体上的什么位置，是随机的。

如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。

所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。

用PCR方法鉴定T-DNA插入船和突变体。

农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体汇总，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体和野生型。

在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。

“三引物法”的原理如图1所示，即用三种引物（LP、BP、RP）进行PCR扩增，野生型植株目的基因的两条染色体上均为发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有一种，分子量约为900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，而T-DNA 本身的长度约为17kb，过长的模版会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与LP（或RP）为引物进行扩增的产物，分子量约为410+N bp（即从LP或RP到T-DNA 插入位点的片段），长度为300+N bp,再加上从LB到T-DNA载体左边界的片段，长度为110bp）；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到410+N bp和900bp两种产物。

毕业论文-拟南芥突变体的鉴定精品

拟南芥突变体的鉴定摘要在真核细胞的细胞核中，基因组DNA缠绕在组蛋白上，形成核小体的结构。

核心组蛋白的末端会发生一系列翻译后水平上的共价修饰，主要包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和ADP－核糖基化等。

这些共价修饰在染色质的结构与功能及基因的转录调控方面起着重要的作用。

组蛋白的甲基化发生在赖氨酸和精氨酸位点，这些位点的甲基化参与异染色质形成，X染色体失活和基因转录的激活与沉默等许多重要的生物学功能。

早先认为组蛋白上的甲基化是不可逆的。

然而近年来在哺乳动物和酵母中相继发现了许多组蛋白去甲基化酶。

其中最大的一个基因家族是包含有JMJC结构域的组蛋白去甲基化酶家族。

在植物中还没有报道有组蛋白去甲基化酶。

我们通过基因组注释以及序列比对从拟南芥中鉴定出21个编码包含有JMJC结构域蛋白的基因。

并从SALK突变体库中筛选鉴定了相应的T-DNA插入突变体。

利用分子标记，我们筛选出了37个纯合T-DNA插入株系。

给我们以后分析这些基因在植物生长发育中所起的作用打下了坚实的基础。

关键词组蛋白密码, 甲基化，去甲基化，T-DNA插入突变体1 背景介绍1.1 “组蛋白密码”理论与表观遗传学在真核细胞的细胞核中，基因组DNA与组蛋白和非组蛋白相互结合，构成遗传信息的物质载体——染色质。

染色质由其基本单位核小体重复连接而成，每个核小体包含一个组蛋白八聚体（H2A/H2B-H3/H4-H3/H4-H2A/H2B）和围绕其上的两圈超螺旋DNA（146KB），核小体之间通过不同长度的超螺旋DNA和H1组蛋白前后相接。

组蛋白八聚体的成员作为核小体的基本组成元件，在所有真核生物中高度保守。

尽管核心组蛋白均具有一个三螺旋的结构严整的组蛋白折叠区，其两个末端却没有形成固定结构。

然而，这些末端却会发生一系列翻译后水平上的共价修饰，主要包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和ADP－核糖基化等。

这些共价修饰在染色质的结构与功能及基因的转录调控方面起着重要的作用（1，2）。

模式植物拟南芥TDNA插入突变体的鉴定

菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。
T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
2012.11.28
4
模式植物拟南芥
拟南芥全部基因组测序已经完成，每个单倍染色体组（n=5）的总长只有7000万个碱基对（只有小麦染色体组长的1/80），预测共有29,454个基因。这样科学家就可以准确定位插入DNA的位置。
DIFF_TM 0.55 LP TCTAGGAAATCGATCGGGTTC
Len 21 TM 60.40 GC 47.62 SELF_ANY_COMPL 0.55
3'_COMPL 0.00 RP GAGAGCATGTAAGGATGCTGG
Len 21 TM 59.85 GC 52.38 SELF_ANY_COMPL 0.55
模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
201L2.O11G.2O8
目录
实验设计思路和原理
拟南芥的栽培
拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定
2012.11.28
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实验设计的思路和原理
经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研
究生命的发生与发展规律。
反向遗传学则是是在获得生物体基因组全部序列的
打开NCBI主页： http://www.ncbi.nl / 打开的页面如下：在上面的search内查找基因名称APETALA1：
从上面可以看到一共有19 个结果，其中第一个是拟南芥中的，点击AP1：
根据上面的信息我们可以
得到基因在拟南芥内的系
统名称：AT1G69120

T-DNA插入双突鉴定

DNA 提取液
上层溶液
洗涤干燥
细胞裂解
异丙醇沉淀
DNA 溶液
具体步骤
提取缓冲液：200mM Tris-Hcl(PH7.4);
25mM EDTA(PH8.0); 250mM Nacl; 0.5%SDS (1) 取拟南芥两片叶子，置于1.5ml离心管中，加入700ml 提取缓冲液；（2）用研磨棒研磨植物材料，直至缓冲液变为绿色；（3）在台式离心机上12000 rpm离心10分钟；（4）离心后将上清转移至一个新的1.5 ml离心管中；（5）在上清中加入700ml异丙醇，混匀后放入-20℃ 30分钟然后12000 rpm条件下，离心10分钟；（6）弃上清后，用70%乙醇润洗沉淀，并在室温过夜干燥；（7）100 ml dd H₂O
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
实验目的

提取植物基因组DNA的方法 PCR操作方法琼脂糖凝胶分离核酸方法

鉴定纯ห้องสมุดไป่ตู้子为进一步实验做准备
Ti-质粒与植物基因组的相互作用
Ti质粒和T-DNA
Ti质粒毒性区基因激活及 T-DNA复合物生成
T-DNA插入鉴定的原理
（以拟南芥为例）
叶片研磨离心冰浴离心
PCR-引物设计
/tdnaprimers.2 .html
以salk_080951为例： LP： TTCACAGTTTCAACGTTGTGG RP： GTAGCGTGATTTCGAGTTTGG
BP：
PCR-原理与程序
Condition 94 ℃ 5 min 94 ℃ 15sec 56 ℃ 15sec 72 ℃ 1 min 72 ℃ 10min 4 ℃ forever

实验五拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定

电泳检测
• 每个大组选两个人点样，电泳结果扫描保存，下次课看结果。
046号突变体的鉴定（1-6组）号突变体的鉴定（组号突变体的鉴定
30µl反应体系： µ 反应体系反应体系1： 30µl反应体系：反应体系3： µ 反应体系 2 µl 植物基因组DNA样品（WT） 2 µl 植物基因组DNA样品（111） 3 µl 10×扩增缓冲液 3 µl 10×扩增缓冲液 0.5 µl Taqase （5U/µl） 0.5 µl Taqase （5U/µl） 0.5 µl dNTP（10µmol/L） 0.5 µl dNTP（10µmol/L） 1 µl 046 5’引物（10µmol/L） 1 µl 046 5’引物（10µmol/L） 1 µl 0463’引物（10µmol/L） 1 µl 0463’引物（10µmol/L） 30µl反应体系：反应体系2： µ 反应体系 30µl反应体系：反应体系4： µ 反应体系 2 µl 植物基因组DNA样品WT 2 µl 植物基因组DNA样品（111） 3 µl 10×扩增缓冲液 3 µl 10×扩增缓冲液 0.5 µl Taqase （5U/µl） 0.5 µl Taqase （5U/µl） 0.5 µl dNTP（10 µmol/L） 0.5 µl dNTP（10 µmol/L） 1 µl 046 5’引物（10 µmol/L） 1 µl 046 5’引物（10 µmol/L） 1 µl LBa 引物（10 µmol/L） 1 µl LBa 引物（10 µmol/L）
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定插入突变体的鉴定拟南芥
实验目的
1．熟练掌握植物基因组DNA快速提取的方法； 2．掌握利用PCR方法鉴定拟南芥T-DNA插入突变体的方法。

拟南芥T-DNA插入突变

• 器材：离心机，离心管，PCR仪，点泳池，电泳现象仪
（3）筛选纯和突变体 3、实突验变原体理鉴定原理
三引物法
“三引物法”即采用三个引物（LP、RP、LB）进行PCR扩增。
野生型植株（WT）目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA 插入，所以其PCR产物仅有1种，片段大小为基因的长度（即从LP到RP的长度）
The complex that comprises of the T-DNA bound to the binding protein then moves into the nucleus and is integrated into the nuclear genome.
2、反向遗传学的重要手段——T-DNA插入突变技术
• (1) 生长周期短, 6周内完成; • (2) 基因组小, 仅有5 条染色体,113 亿个碱基对,但是它的大多数基因与
其他“复杂”的植物基因具有很高的同源性，
• (3) 具有双子叶植物的所有特性
• (4) 有效的农杆菌介导转化途径,易获得大量的突变体和基因组资源; • (5) 在有限的空间内可大量种植，体形小, 占地少 • (6) 收获大量的种子，每株拟南芥可产生多达5000 粒种子； • (7) 生活力强，用普通培养基就可作人工培养。
研究基因功能的方法
• 1、转基因技术 • 2、基因敲除 • 3、基因敲入 • 4、基因诱导超表达 • 5、基因诱捕技术 • 6、 RNAi干扰 • 7、生物信息学分析 • 8、反义技术
2、反向遗传学的重要手段——T-DNA插入突变技术
农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。
• 1.确定所要研究的基因通过生物信息学的方法推测出一些可能具有赤霉素糖基转移酶的基因。

突变体鉴定

T-DNA突变体的鉴定
T-DNA突变体的鉴定 T-DNA突变体的鉴定
• 实验目的 • 实验目的 1、了解植物DNA的提
1、了解植物DNA的提取。取。 2、掌握T-DNA插入突变体中纯合体、杂合 2、掌握T-DNA插入突体的鉴定方法。变体中纯合体、杂合
体的鉴定方法。
实验原理
• Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒,该质粒上有一段特殊的DNA区段,当农杆菌侵染植物细胞时,该DNA区段能自发转移进植物细胞, 并插入植物染色体DNA中。Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。
④ 4 ℃， 14000rpm离心8分钟。
⑤取上清至新的EP管中，加300 µl 三氯甲烷，用手轻轻震荡20s。 ⑥4 ℃， 14000rpm离心8分钟。
⑦取上清至新的EP管中，加250µl异丙醇，混匀，冰上20分钟。 ⑧4℃，12000rpm离心8分钟。
弃上清，加 6 0 0 µl 7 5 % 的乙醇， 4℃ ， 12000rpm离心8分钟。室温下干燥（一般干燥5—10分钟）后，加
2.PCR鉴定突变体纯合体、杂合体
批注：＋表示有条带，－无条带
结果与分析
• 根据PCR鉴定凝胶电泳的成像图，分析材料中突变体植株的纯、杂合性。
（1）以所提的突变体和野生型植株的DNA为模板，以F、 R、LBb1为引物两两配对成3对引物对，进行PCR扩增，20 µl反应体系如下： 10×Buffer 2 µl dNTP 0.4µl 引物 0.4µl 模板 1µl Taq 酶 0.2µl 蒸馏水 16µl （2）PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳及分析。将PCR产物中加入loading buffer，琼脂糖凝胶电泳，成像。（3）根据电泳条带的分布与数目，初步判断突变体的纯杂性