模式植物拟南芥TDNA插入突变体鉴定23页PPT

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模式植物-拟南芥

模式植物-拟南芥

miR156
miR171
miR156和miR171调控表皮毛发生的分子机制
微管结合蛋白参与的下胚轴伸 长调控
微管(microtubule)的结构
微 管 的 聚 合
植物细胞周期中的微管列阵
间 期 周 质 微 管 早 前 期 微 管 带
纺 锤 体 微 管
成 膜 体 微 管
干扰微管或微丝骨架所引起的表型
Reporters
Gal4 GUS GUS LexA-Gal4-GUS LexA(2×) Gal4(2×)
转录激活子检测: 对照组 GD + Gal4-GUS 检测组 GD-Gene + Gal4-GUS
转录抑制子检测: 对照组 GD + LD-VP16 + LexA-Gal4-GUS 检测组 GD-Gene + LD-VP16 + LexA-Gal4-GUS
SA
JA
GA和CTK促进表皮毛的发生
Gibberellins
Cytokinin ZFP6
SPY ZFP5
GIS
ZFP8/GIS2
TTG1-GL1/MYB23-GL3/EGL3 GL2 Trichome Initiation
JA增加表皮毛密度和数目
SA减少表皮毛的密度和数目
JA促进表皮毛发生的机制:
2. bHLH类转录因子:
GLABRA3 (GL3), ENHANCER OF GLABRA3 (EGL3)
3. 含WD40重复序列的转录因子:
TRANSPARENT TESTA GLABRA1 (TTG1)
4. C2H2类转录因子:
GLABROUS INFLORESCENCE STEMS (GIS) ,GIS2, Zinc Finger Protein 5 (ZFP5), ZFP6, ZFP8

拟南芥TDNA插入突变体的鉴定

拟南芥TDNA插入突变体的鉴定

遗传学实验报告拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定一、实验目的:1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法,掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理,掌握其方法。

二、实验原理1、拟南芥(Arabidopsis thaliana)十字花科,植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。

植株形态个体小,高度只有30cm左右;生长周期快,从播种到收获种子一般只需8周左右;种子多,每株可产生数千粒种子;形态特征简单,生命力强,用普通培养基就可作人工培养;遗传转化简单,转化效率高;基因组小,只有5对染色体,125MB;在2000年,拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。

2、突变体突变体是遗传学研究的最重要材料。

突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。

拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。

由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪,目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体;SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。

3、T-DNA插入突变原理T-DNA,转移DNA(transferred DNA ),是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列,可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。

人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区,借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合,获得转基因植株。

除用于转基因以外,T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活,从而产生基因敲除突变体,T-DNA大多为单拷贝插入,使其利于进行遗传分析。

4、T-DNA插入突变体PCR鉴定图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计三、实验材料1、材料:T-DNA插入的突变拟南芥植株;2、仪器:离心管,离心机,水浴锅,移液枪,PCR仪,电泳槽等;3、试剂:液氮,CTAB提取液,氯仿/异戊醇(24:1),无水乙醇,70%乙醇,10xTaq buffer,MgCl2,引物,琼脂糖,溴化乙锭(EB)。

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。

T-DNA是农杆菌的一个大质粒,长度在25kb左右。

野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因,感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织,失去分化能力。

所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。

因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。

在转化子培养到F2代出现分离后,就需要对其基因型进行鉴定。

T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种:三引物法和双引物法。

在本实验中使用三引物法。

三引物法的原理如图1所示,即采用三引物(LP、RP、BP)进行PCR扩增。

野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入,所以其PCR产物仅有1种,分子量约900bp(即从LP到RP);纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入,T-DNA本身的长度约为25kb,过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成,所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物,分子量约为400-700bp;杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入,所以PCR扩增后可同时得到两种产物。

上述3种情况的电泳结果差异明显,能有效区分不同基因型的植株。

此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。

图1 T-DNA插入示意图CATB,即十六烷基三甲基溴化铵,是一种离子型表面活性剂。

能溶解细胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,从而使DNA得以游离出来。

并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀,但不沉淀核酸。

本实验使用CATB抽提DNA。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是体外核酸扩增技术。

它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍,使肉眼能直接观察和判断。

拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定

拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定

拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定余振洋(高山山、潘红芳)、09级生技1班、200900140156、2011/12/14摘要本实验通过CTAB法提取目的拟南芥的DNA,再用三引物法PCR扩增所需的目的基因后,用电泳检测该拟南芥是否为转基因的拟南芥,并判断其是纯合突变还是杂合突变。

关键词拟南芥;T-DNA;突变纯和体1.引言T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列,它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。

T—DNA在植物中一般都以低拷贝插入,多为单拷贝。

单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中,就会表现出孟德尔遗传特性,在后代中长期稳定表达,且插入后不再移动,便于保存。

T—DNA插入突变在反向遗传学和功能基因组学研究中发挥着重要作用。

,T—DNA插入突变能方便地进行正向和反向遗传学研究,因而受到重视。

同时,基因组测序工作的完成使得从位点到表型的反向遗传学研究成为可能,从而使通过T—DNA插入技术构建突变体来研究功能的反向遗传学技术逐渐取代了传统的化学诱变、图位克隆等技术。

借助于农杆菌介导的遗传转化技术,T—DNA插入技术已被广泛应用于拟南芥等模式植物的突变体库构建中。

以T—DNA作为插入元件,不但能破坏插入位点基因的功能,而且能通过插入产生的功能缺失突变体的表型及生化特征的变化,为该基因的研究提供有用的线索。

由于插入的T—DNA序列是已知的,因此可以通过已知的外源基因序列,利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析,并对比突变的表型研究基因的功能。

还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列,建立侧翼序列数据库,对基因进行更全面的分析。

由此可见,T—DNA 插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。

CTAB法提取植物叶片中的DNA是我们常用的方法。

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞,由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响,在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。

实验十、模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定-23页精选文档

实验十、模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定-23页精选文档
基础上,通过对靶基因进行特定的加工和修饰,如定 点突变、插入、缺失、置换等,再研究这些修饰对生 物体的表型、性状可能有何种影响,从而了解基因和 其编码蛋白质在生物体内的功能。
模式植物拟南芥
拟南芥(Arabidopsis thaliana )又称为阿拉伯芥,是一种十字花 科植物,广泛用于遗传、发育和分子生物学的研究,已成为一种典 型的模式植物。该植物具有以下特点:
植株形态个体小,高度只有30cm左右,1个茶杯可种植好几棵; 生长周期快,每代时间短,从播种到收获种子一般只需8周左右; 种子多,每株可产生数千粒种子; 形态特征简单,生命力强,用普通培
养基就可作人工培养; 基因组小,只有5对染色体。 拟南芥是严格的闭花自花受粉植物,
基因高度纯合。易获通过理化处理 获得各种功能的突变体。
外成像仪
实验步骤-拟南芥的栽培
一.在播种前将种子进行消毒,然后置于4℃冰箱中,使 种子在湿润条件下春化2至3天。
二.将春化好的种子播种于有麦氏培养基(MS培养基)的 培养皿中,置于培养室内培养。
三.待幼苗长出后,再选择茁壮的幼苗移栽到土壤中,置 于培养室内培养。
实验步骤-拟南芥T-DNA插入突变体PCR鉴定法
1. CATB法提取DNA:液氮、2×CTAB抽提缓冲溶液、氯仿:异戊醇 =24:1、无水乙醇、70%乙醇、TE
2. PCR:ddH2O、Buffer、MgCl2、dNTP、引物(LP、RP、BP) 、DNA模版、Taq DNA聚合酶
3. 电泳:琼脂糖、Maker、Buffer、EB、TAE
❖ 仪器:离心机,水浴锅,移液器,PCR仪,电泳槽,紫
每小组按10倍准备混合体系; 每个同学需做一颗植株的鉴定(两管PCR)。
LP: JDM17-1NR2 RP: JDM17-1F2 BP: LBb1.3

拟南芥atcwinv1基因T-DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察

拟南芥atcwinv1基因T-DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察
变体 ( 简称 突 变体 ) 野 生型 萌发 率平 均 下 降 5 8 较 . 8个 百分 点 ; 变体在 4 突 4 d抽 薹 , 野 生 型延 后 较 4 ; 支数 平 均 4支 , 野 生型 下降 2 . 4 ; 荚 开裂 时 间 6 分 d 较 0 8 果 右 ,较 野 生型 延 长 2 ; 株 果 荚 d左 单 d 数 平均 6 . 7个 , 野 生型 降低 1. 0 ; 22 较 1 O 单株 果 荚种 粒 数平 均 4 . 7粒 , 野 生型 降低 2 . 6 ; 58 较 14 突变体 的单 果 荚长度 平均 1 . 2 m,较野 生 型 降低 1 . 4 ; 4 5 c 0 2 单株 果质 量 平均 5 . 3 , 野 生 型 0 8 mg 较 降低 2 . 0/。拟 南芥 突变体在 营养 生长 时期 的株 高平 均 1 . 4 m, 野 生 型 下 降 2 . 3 ; 3 7 9 6 O4 较 c 1 0 主根
PCR d n iia i n a d Ph n t p c Ob e v to fa c i v I e tfc to n e o y i s r a i n o tw n l Ge e T— n DNA n e to a u a to r b do i I s r i n lM t n fA a i pss
u e o c m pa e p a s d t o r l ntmor hol i a if r nc s i he pe i ge a i e g owt nd r pr duc p og c ld f e e e n t rod ofve t tv r h a e o — tv o h. i e gr wt Ther s t h e uls s owe ha o p r d t he wid t pe t r i a i n r t fatwi l d t tc m a e o t l y he ge m n to a e o c nv a e a e y de r a e 5 v r g l c e s d by .88 pe c nt ge p n s; ompa e o h wid t e, li i e f ar- r e a oi t c r d t t e l yp bo tng tm o c

模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定 共21页PPT资料

模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定 共21页PPT资料

一个好的分离程序应符合三个标准: ①所得DNA的纯度满足下游操作要求; ②所得DNA应完整; ③所得DNA量足够。
DNA在化学上是稳定的,但它在物理上是易 碎的,高分子质量的DNA长而弯曲,即具有 极微弱的侧向稳定性,易受到最柔和的流体 剪切力的伤害,由吸液、振荡、搅拌所致的 水流能剪切断DNA双链。
实验方法:(每人做1个株号的检测)Βιβλιοθήκη (一) 拟南芥基因组DNA提取
1. 原理
分离动物、植物、微生物DNA是进行遗传操
作(基因组DNA序列分析、遗传标记分析、基 因克隆、基因定位)的第一个步骤。不同的研 究目的对DN对纯度要求高; 用于PCR分析的DNA则应不含干扰PCR反应的 污染物; 用于遗传标记分析的DNA,纯度要求低但产量 则要高。
min,再转移上清入新管。 5. 向上清液中加等体积的冷异丙醇,小心混匀。-20 ℃ 放置30 min,12000 rpm离心10 min,
弃上清。 6. 用70%乙醇洗涤沉淀一次,12000 rpm稍离心,弃上清。 7. 将沉淀在超净工作台上吹干,或空气中晾干。加50 μl TE (pH 8.0)放4 ℃缓慢溶解。 8. 电泳检测DNA的浓度和质量。
3. 用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体
农杆菌Ti质粒转化植物细胞后,在获得的后代分离群体中, 有T-DNA插入的纯合突变体,杂合突变体,和野生型。 在突变体研究中,需要的材料是纯合突变体,所以必须从 分离群体中将纯合突变体鉴定出来。
PCR方法为鉴定纯合突变体提供了有利手段。它利用三 个引物LP、RP和BP,其中LP和RP是植物基因组上TDNA插入位点两测的引物,BP是T-DNA区段上的引物。 经过PCR,在野生型植株,LP和RP这对引物扩增出分子 量较大的产物(野生型基因,大带);在杂合突变体, LP和RP能扩增出分子量较大的产物(野生型基因,大 带),另外BP和RP还能扩增出分子量较小的产物(小 带);在纯合突变体,只有BP和RP能扩增出分子量较小 的产物(小带)。因此,利用以上三种引物做PCR,根 据扩增结果能够容易地从群体中区分出纯合突变体。

模式植物拟南芥

模式植物拟南芥

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对拟南芥的研究
拟南芥基因组计划分为3项内容:构建基因组的遗传图, 构建基因组的物理图和测定基因组的DNA全序列。在 2000年底,这项计划已经顺利完成,科学家们已绘制出了 包含约1. 3亿个碱基对、2. 5万个基因的拟南芥基因的完 整图谱,这是人类首次全部破译出一种植物的基因序列。 我国克隆了1303个转录调控因子基因,占拟南芥全部转录 因子的85%,是世界上获得转录因子基因最多最完整的国 家,已将其中的1282个提交到拟南芥生物研究中心 (ABRC)。根据ABRC提供的数据,我国所提供的克隆 已成为全世界拟南芥研究中需求量第二大的一组克隆(转 录因子家族是需求量最大的),成为世界植物科学界了解 中国的重要窗口。
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植株形态个体小,高度只有30cm左右,1个茶杯可种植好几棵 生长周期快,每代时间短,从播种到收获种子一般只需6周左右 种子多,每株每代可产生数千粒种子; 形态特征简单,生命力强,用普通培养基就可作人工培养; 基因与大多数植物基因具有很高的同源性,能代表大多数的特 点。 拟南芥的基因组是目前已知植物基因组中最小的。每个单倍染 色体组 (n=5)的总长只有7000万个碱基对,即只有小麦染色体 组长的1/80,这就使克隆它的有关基因相对说来比较容易。 拟南芥是自花受粉植物,基因高度纯合,用理化因素处理突变 率很高,容易获得各种代谢功能的缺陷型。
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最近的研究表明,拟南芥中参
与加MIRNA初始转录本的还有必 需蛋白SERRATE(SE)。在拟南 芥MIRNA的生物合成途径中还发 现另一个重要的蛋白HENI,它的 主要功能是使MIRNA末端的核糖 被甲基化以防止MIRNA的末端特定位置的稳定性 。对MIRNA的研究为完整认识高 等生物中(包括动物和植物中)的 MIRNA生物合成过程提供了有价 值的信息。

模式植物拟南芥TDNA插入突变体的鉴定

模式植物拟南芥TDNA插入突变体的鉴定
菌 侵染植物细胞,实现外源基因对植物的遗传转化。
T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入某个功 能基因的内部,特别是插入到外显子区,将造成基因功能的丧失。利用 农杆菌Ti质粒转化植物细胞,是获得植物突变体的一种重要方法。
2012.11.28
4
模式植物拟南芥
拟南芥全部基因组测序已经完成,每个单倍染色体组 (n=5)的总长只有7000万个碱基对(只有小麦染色 体组长的1/80),预测共有29,454个基因。这样科 学家就可以准确定位插入DNA的位置。
DIFF_TM 0.55 LP TCTAGGAAATCGATCGGGTTC
Len 21 TM 60.40 GC 47.62 SELF_ANY_COMPL 0.55
3'_COMPL 0.00 RP GAGAGCATGTAAGGATGCTGG
Len 21 TM 59.85 GC 52.38 SELF_ANY_COMPL 0.55
模式植物拟南芥T-DNA插 入突变体的鉴定
201L2.O11G.2O8
目录
实验设计思路和原理
拟南芥的栽培
拟南芥T-DNA插入突变体 的PCR鉴定
2012.11.28
1
实验设计的思路和原理
经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研
究生命的发生与发展规律。
反向遗传学则是是在获得生物体基因组全部序列的
打开NCBI主页: http://www.ncbi.nl / 打开的页面如下: 在上面的search内查找 基因名称APETALA1:
从上面可以看到一共有19 个结果,其中第一个是拟 南芥中的,点击AP1:
根据上面的信息我们可以
得到基因在拟南芥内的系
统名称:AT1G69120

模式植物拟南芥的去雄和授粉实验

模式植物拟南芥的去雄和授粉实验

模式植物拟南芥的去雄和授粉实验
授粉是高等植物有性生殖的关键环节,这一过程包括花粉在柱头细胞上黏附、花粉的水合、花粉管的萌发及伸长等,其中涉及很多复杂而有序的调控机制,近年来人们在这一方面的分子机制研究中已取得诸多进展。

本研究鉴定到拟南芥UPS基因的两个不同位点的T-DNA插入突变体,这两个突变体的杂合体自交后代中杂合体植株数与野生型植株数的比例接近1∶1,没有纯合突变体。

分析杂合体植株与野生型植株互交后代基因型发现,该基因的突变导致雄配子体传递率显著下降。

但是亚历山大染色、DAPI染色和体外萌发实验表明杂合体植株的花粉在形态、活性等方面与野生型植株的花粉相比没有明显差异。

但是柱头表面突变的花粉粒容易被表面活性剂NP-40冲洗掉,突变体的花粉粒不能在柱头上萌发并生长出花粉管。

ups突变体的成熟花药中含有两种结构不同的花粉粒,一种与野生型类似,均匀分布大量电子透明的小液泡,约占花粉的62%。

另一种花粉富含许多大液泡,细胞质的电子密度也明显增大,这类花粉粒的线粒体内膜也变地较为模糊。

表明ups突变导致花粉的液泡和线粒体发育出现异常,可能是突变体花粉粒不能在柱头上萌发的原因。

GUS活性分析及原位杂交结果显示UPS在花粉发育过程中表达,11时期花药(花药开裂前,药室退化为两室)中
的花粉UPS表达量最高,但到花粉成熟散出时,却检测不到UPS的表达。

本研究通过研究UPS在花粉与柱头互作中的作用,进一步补充花粉与柱头相互作用中基因的调控网络,使人们进一步了解雄配子体基因在花粉与柱头互作中的作用。

8.2 拟南芥T-DNA基因插入突变鉴定

8.2 拟南芥T-DNA基因插入突变鉴定

拟南芥T-DNA基因插入突变鉴定摘要利用T-DNA插入拟南芥基因引起突变,获得突变植株,提取16号植株细胞DNA,利用三引物法进行PCR扩增,检测得16号植株细胞内原基因与插入突变基因同时存在,为杂合突变体。

引言反向遗传学是相对于经典遗传学而言的。

经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。

反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上,通过对靶基因进行必要的加工和修饰,如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等,再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组,让其装配出具有生命活性的个体,研究生物体基因组的结构与功能,以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。

与之相关的研究技术称为反向遗传学技术。

T-DNA插入突变技术T-DNA插入突变技术是反向遗传学的重要手段之一。

T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列,它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。

T-DNA在植物中一般都以低拷贝插入,多为单拷贝。

单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中,就会表现出孟德尔遗传特性,在后代中长期稳定表达,且插入后不再移动,便于保存。

由于插入的T-DNA序列是已知的,因此可以通过已知的外源基因序列,利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析,并对比突变的表型研究基因的功能。

还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列,建立侧翼序列数据库,对基因进行更全面的分析。

由此可见,T-DNA 插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。

植物材料——拟南芥拟南芥是一种十字花科植物,广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究,已成为一种典型的模式植物,其原因主要基于该植物具有以下特点:(1)植株形态个体小,高度只有30cm左右,1个茶杯可种植好几棵;(2)生长周期快,每代时间短,从播种到收获种子一般只需6周左右;(3)自花授粉,有助于遗传试验的人工控制;(4)种子多,每株每代可产生数千粒种子;(5)形态特征简单,生命力强,用普通培养基就可作人工培养;(6)基因组小,只有5对染色体。

t-DNA鉴定ppt课件

t-DNA鉴定ppt课件

0.5ul 2ul
0.2ul
21
反应程序
PCR由变性--退火--延伸三个基 本反应步骤
变性— 退火— 延伸—
预变性94℃ 94℃ 53℃ 72℃ 循环35次
5min 40sec 50sec 80sec
72℃
10min
22
• LP • TCATCCACCATGG
AAGAAAAG • RP • TTGGATACGATGC
17
如何选择最合适的DNA聚合酶 -- DNA 聚合酶的特性
纯度 稳定性 酶活性
18
• 反应体系
H2O
10xTaq buffer (MgCl2free)
MgCl2 (25mM)
引物LP (10 uM)

引物RP (10 uM)
引物BP (10 uM)
dNTP (各2.5mM)
模板DNA(30-50ng/μl)
13
PCR标准反应体系
• DNA模板 • 引物 • 反应缓冲液 • dNTP • ddH2O • 耐热聚合酶
14
反应体系对PCR扩增的影响
DNA模板
•纯度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应 •完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物 •浓度 加量过多导致非特异性扩增增加
引物
•特异性 长度适当、避免二级结构和二聚体 •完整性 避免反复冻融 •浓度 应适当,过高导致非特异性增加,过低则
Taq酶(5U/μl )
19
反应体系(三引物体系)
25ul体系
H2O
15ul
10xTaq buffer (MgCl2free) 2.5ul
MgCl2 (25mM)
2ul
引物LP (10 uM)

T-DNA插入双突鉴定

T-DNA插入双突鉴定

DNA 提取液
上层溶 液
洗涤 干燥
细胞裂 解
异丙醇 沉淀
DNA 溶液
具体步骤
提取缓冲液:200mM Tris-Hcl(PH7.4);
25mM EDTA(PH8.0); 250mM Nacl; 0.5%SDS (1) 取拟南芥两片叶子,置于1.5ml离心管中,加入700ml 提取缓冲液; (2)用研磨棒研磨植物材料,直至缓冲液变为绿色; (3)在台式离心机上12000 rpm离心10分钟; (4)离心后将上清转移至一个新的1.5 ml离心管中; (5)在上清中加入700ml异丙醇,混匀后放入-20℃ 30分钟 然后12000 rpm条件下,离心10分钟; (6)弃上清后,用70%乙醇润洗沉淀,并在室温过夜干燥; (7)100 ml dd H₂O
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
实验目的

提取植物基因组DNA的方法 PCR操作方法 琼脂糖凝胶分离核酸方法



鉴定纯ห้องสมุดไป่ตู้子为进一步实验做准备
Ti-质粒与植物基因组的相互作用
Ti质粒和T-DNA
Ti质粒毒性区基因激活及 T-DNA复合物生成
T-DNA插入鉴定的原理
(以拟南芥为例)
叶片 研磨 离心 冰浴 离心
PCR-引物设计
/tdnaprimers.2 .html
以salk_080951为例: LP: TTCACAGTTTCAACGTTGTGG RP: GTAGCGTGATTTCGAGTTTGG
BP:
PCR-原理与程序
Condition 94 ℃ 5 min 94 ℃ 15sec 56 ℃ 15sec 72 ℃ 1 min 72 ℃ 10min 4 ℃ forever
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