第十四讲 蛋白芯片和组织芯片

共价交联－－环氧基修饰玻片
• 环氧基修饰玻片是一类较新的蛋白质微阵列载体，其 表面的环氧基活性很强，不但可以和氨基反应，还可 以和蛋白质表面的其他基团如羟基、巯基、羧基等反 应 • 经过氨丙基三甲氧基硅烷 (aminopropyltrimethoxysilane,APPS),巯丙基三甲氧 基硅烷(mercaptopropyltrimethoxysilane,MPTS)、丙 基三甲氧基硅烷 (glycidoxypropyltrimethoxysilane,GPTS)和多聚赖氨 酸修饰的700多张玻片进行了详细的比较分析，结果 各种玻片表面修饰方法中，经丙基三甲氧基硅烷处理 的环氧基玻片最为理想。
共价交联covalent coupling
• zhu等将蛋白共价交联到具有甲硅烷接头的玻璃介 质表面。 • 将液态硅酮橡胶Liquid silicone elastomer倒在蚀刻 好的模子上，再将成型的橡胶覆盖在玻片表面制备 成有微孔的芯片。用一种交联剂GPTS （glycidoxypropyltrimethoxysilane）活化表面，然 后将蛋白（激酶、底物等）交联到基质表面。与酶 联免疫吸附测定类似，在加激酶、33p γ-ATP和缓 冲液前先用1% BSA对微孔芯片进行封闭。在已知 的122种酵母蛋白激酶中，用十七种不同的底物－ 蛋白芯片对其中119种蛋白进行了分析。他们发现 了许多可以进行酪氨酸磷酸化的激酶。
被动吸附（passive adsorption）
• 是制备蛋白芯片最简单的方法：将蛋白直接点样 到疏水或荷电介质表面，蛋白将被吸收 • Lueking等用点样机器人将蛋白溶液高密度点样到 PVDF滤膜上，可以在滤膜上检测到特定的蛋白， 且具有较高的灵敏度 • 在分析自身免疫病人的血清进行自身抗体定量分 析的过程中，Joos等人利用硝酸纤维素膜、多聚 赖氨酸包被的载玻片制做芯片。另外，也可以将 硝酸纤维素膜放在载玻片上以便进行芯片的制备 及后续的检测分析。
被动吸附表面介质
• 聚苯乙烯塑料表面（polystyrene plastic surface） • 聚丙烯酰胺凝胶（3-dimensional polyacrylamide gel）是一种三维表面的介质，与二维表面相比， 可以提供更高的灵敏度、动态范围和天然构想。 它是基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。丙烯酰胺 凝胶聚合后，可以将成型的胶置于载玻片表面， Miller等人将184个抗体点样到水凝胶包被的载玻 片和多聚L赖氨酸包被的载玻片上(with a crosslinking layer) ，水凝胶表面的的信噪比更高。
共价交联－－醛基修饰玻片
• BSA封闭后，由于BSA分子层的屏障作用，阻碍 了待检物质和微阵列上小的蛋白探针的结合 • 若固定较小的蛋白质分子或肽，则用BSA-NHS修 饰载玻片，具体方法为：先在载玻片上吸附上一 层BSA分子，然后用N,N‘ 一二珑拍酞胺碳酸(N, N’ -disuccinimidylca rbonate)进行活化，BSA上的赖 氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸残基活化后可以与待 固定蛋白质氨基共价结合而把蛋白质探针固定在 载体上面，然后再用甘氨酸封闭未反应的活性基 团
蛋白芯片的操作流程
• 点样样品的准备：蛋白的纯化，并将蛋白溶解于 点样液中 • 点样 • 点样后：洗涤洗去未结合的蛋白质 • 蛋白芯片的封闭（blocking） • 将待检的蛋白样品或小的分析物加入到蛋白芯片 上；加入蛋白质样品与芯片进行抗原抗体反应 • 洗涤、检测 • 在上述各步中要特别注意降低非特异的结合，同 时增强检测的灵敏度和精确度
芯片制备
• 芯片制备的方法包括机器人接触式点样、压电喷墨点样。 这与DNA芯片相似。 • 为达到蛋白质组学分析中揭示蛋白表达特征（包括蛋白质 修饰）、蛋白质相互作用、蛋白质的功能等目的，要将蛋 白质固定在固相支持物的表面，并保持其原有的折叠构相 （functional protein activity）及生物学功能，所以在固定 及之后的操作中要保持蛋白质的水合状态以防止变性。 • 玻片由于具有廉价、表面光滑、低荧光背景及性能稳定等 优点，已经被广泛应用于蛋白质微阵列的制作 • 蛋白质一般要在点样液中加入含甘油、BSA的磷酸盐缓冲 液中，以防止微滴的蒸发。
亲和结合Affinity binding
• ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的 略语。 • 亲和素是一种糖蛋白，分子量60000，每个分子由4 个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化 合物，分子量244。用化学方法制成的衍生物素-羟 基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小 分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。 • 生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，亲和力 较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。
醛基修饰玻片
• 醛基修饰玻片也是在DNA微阵列中广泛应用的载体，现在 这一方法在蛋白质微阵列中得到了应用。该方法通过醛基 和蛋白质上的氨基形成Schiff碱而把蛋白质共价固定到载 体表面，由于蛋白质表面通常含有多个氨基，这些基团都 能和载体表面的醛基结合，所以蛋白质在表面的固定是无 序的。 • 通常用含乙醛的硅烷试剂处理载玻片，使载玻片表面带有 活性醛基基团，醛基与蛋白质所带的氨基反应而将蛋白质 固定在载体上，这种方法适合固定较大的蛋白质分子. • 玻片表面上未反应的醛基用小牛血清白蛋白(BSA)封闭， 同时在载体表面形成的BSA分子层作为分子屏障防止了其 他分子和微阵列载体的非特异性结合。
亲和结合Affinity binding
• 为保持蛋白地生物活性使之与配体或底物 结合，蛋白与基质结合的方向很重要。亲 和结合可以保证蛋白的方向性和牢固性。 • 亲和结合的蛋白在其末端需要一个标签， 所以要求蛋白质要适合修饰。
二维表面修饰
• 以玻片为载体的二维表面修饰如聚赖氨酸修饰、 氨基修饰、醛基修饰、环氧基修饰及链霉亲合素 修饰等都可以归为此类。这类载体大部分通过共 价键或特殊分子间的高亲合力把蛋白质固定在其 表面，所以蛋白质结合牢固。 • 制作相对简单，点样点形态较为均一，在目前应 用比较广泛。但是该类载体对蛋白质的固定量仍 不理想，固定在上面的蛋白质容易变性。
• 被动吸附适于进行灵敏的蛋白质表达及抗体特异 性的筛选，但是由于蛋白是随机吸附到介质表面 的，蛋白会有部分的变性，无法进行定量分析， 蛋白结合到基质上的方向也很难控制。不同蛋白 质的吸附能力不同，信躁比也较低。 • 由于某些吸附能力较弱，洗脱过程中一些蛋白质 有可能脱落。由于蛋白质在基质表面固定的部位 及方向不同，其生物活性将有所差别，使实验的 重复性不好。
共价交联covalent coupling
• 大部分蛋白质芯片的制备方法都依赖通过蛋白质 表面的氨基或巯基与活化的介质（通常为玻片） 表面随机的共价交联。 • MacBeath和Schreiber使用乙醛aldehydes 、甲硅 烷处理载玻片，然后将蛋白质点样到处理过的玻 片上。乙醛与蛋白N端α氨基或蛋白质表面赖氨酸 反应形成Schiff碱，这样可以使蛋白以几个特定方 向与芯片表面连接，以便蛋白可以用不同的表面 与其它蛋白或小分子反应。他们用这种方法成功 地检测了蛋白－蛋白反应，分离出蛋白激酶的底 物。
制作芯片的表面基质
• 和良好的DNA芯片表面一样，良好的蛋白质芯片 基质表面应该适合不同的化学处理。 • 能获得良好的，形态一致的样点 • 尽量降低非特异结合 • 应考虑到不同蛋白不同的理化性质，如极性、疏 水性、电荷和结构，蛋白芯片应能使点在芯片上 的不同种类的蛋白能与待检的其他蛋白或配基结 合 • 根据蛋白芯片用途的不同，使用不同的蛋白固定 方法。一般的蛋白固定方法包括：被动吸附、共 价偶联、亲和结合
• 蛋白芯片是微缩化的如ELISA的免疫检测方法 • 跟DNA芯片类似，蛋白芯片是把抗原、抗体、多 肽样本高密度地点制在芯片上，使多种样本能同 时得到检测 • 可借用DNA芯片产业的成熟经验，如点样仪，扫 描仪，图像处理，蛋白芯片的制备以蛋白共价结 合在玻片上为主，便于快速和自动处理 • 提高了蛋白质鉴定的速度与重复性，在蛋白质的 生物活性以及大分子与蛋白质之间相互作用等方 面展示了独有的魅力
亲和结合Affinity binding
• hexahistidine－镍与目标蛋白间的连接不是 非常牢固，由于对很多常用化学试剂非常 敏感，连接容易断开。 • 生物素－抗生物素蛋白（biotin-avidin）相 互作用的连接则在许多化学环境中都很牢 固，是稳定的非共价结合。所以目前这种 连接被广泛应用于生化反应中的固定。
亲和结合Affinity binding
• 通过生物素（biotin）－抗生物素蛋白链菌素 （avidin）或hexahistidine－镍（Ni）的相互作用 介导的亲和结合是一种常用的生物学结合方法。 • zhu等人报导在5800种酵母蛋白的N端融合上谷胱 苷肽S—多组氨酸(GST-His6)。然后将这些蛋白 在酵母中表达。将蛋白样品点到镍包被的载玻片 上，融合蛋白即可以其N端的His6与载体结合。 蛋白结合的方向是一致的。同时他们还将蛋白点 到乙醛处理过的载玻片上。虽然两个载玻片上都 可以固定蛋白质，但镍包被的载玻片固定得更好。
• 聚赖氨酸修饰玻片虽然不是通过共价键固定蛋白 质的，但由于聚赖氨酸修饰玻片广泛地作为基因 芯片的载体，且制作简单，具有较高的信躁比以 及较均一的点样形态等优点，仍有许多蛋白质微 阵以聚赖氨酸修饰玻片作为载体。 • Angenendt等通过比较多种载体以及其表面修饰 方法发现，聚赖氨酸修饰的玻片上点样点的形态 比较均一，点间变异系数(11%)小于其他载体。 但是聚赖氨酸修饰玻片同其他二维载体表面一样， 敏感度不佳，最低检测限较高。 • Haab等报道了用聚赖氨酸修饰的玻片为载体的抗 体微阵列来研究抗原抗体的相互作用，但在玻片 表面固定抗体时拖尾现象很明显，而且在点的内 部抗体的分布也是不均匀的，影响结果的正确性 和精确性。
三维表面修饰
• 在玻片表面包被一层凝胶或树突状多聚物，然后 可以再在这些基质上引入活性基团，从而在玻片 表面形成了三维立体结构。如用聚丙烯酞胺在玻 片表面构建了具有三维立体结构的凝胶微阵列载 体。 • 这种三维结构的载体相比二维载体表面有以下几 个优点:首先，由于三维多孔结构，载体表面和蛋 白质探针的接触面积大大增加，从而对蛋白质的 固定量也比二维平面载体大得多;其次，凝胶内的 湿润微环境使固定在上面的蛋白质溶液不易蒸发， 从而更好地保持了蛋白质的活性，减少了蛋白质 的变性失活。
共价交联covalent coupling
• 共价交联的方法使活化的介质表面和蛋白 的连接更稳定，蛋白质也更少发生变性。 但是由于多个连接位点的拉伸作用，变性 仍不可避免。蛋白连接的方向也是多样的， 连接位点可能会封闭所固定的蛋白与抗原 相结合的位点，这是由于对抗原结合位点 的直接化学修饰，或者介质表面和相邻抗 体的空间位阻。 • 共价交联制备的芯片实验重复性较好。
蛋cs)
• 以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式 为研究对象 • 蛋白质组学不同于传统的蛋白质学科之处 在于它的研究是在生物体或其细胞的整体 蛋白质水平上进行的，它从一个机体或一 个细胞的蛋白质整体活动的角度来揭示和 阐明生命活动的基本规律。
蛋白芯片
亲和结合Affinity binding
• Silzel 等曾利用吸附在聚苯乙烯表面的亲和素 avidin将生物素化的捕捉抗体连接到载体上。他们 用到的是一种商品化的去糖基化亲和素 NeutrAvidin，在连接能力方面它与抗生物素蛋白 链菌素（streptavidin）或avidin没有统计上的差 别。在制备抗体芯片时，将点有NeutrAvidin的芯 片与过量的生物素化的捕捉抗体共同保温。 • Rowe等人也报导过类似的亲和连接方法。他们是 通过交叉连接将生物素化的抗体固定到avidin包被 的硅烷化的载玻片上。