(整理)天然产物活性成分检测.

陈羽迪2012332870002 12生物制药（1）茶叶中茶多酚的粗提取与含量测定实验报告一、实验目的：1、了解并熟悉茶多酚的元素组成、结构构成、理化性质。

2、掌握溶剂萃取法粗提取茶多酚的原理与操作。

3、掌握酒石酸铁比色法测定茶多酚的含量的原理及操作。

4、了解分光光度计的使用方法和注意事项。

二、实验原理和应用：茶多酚（Tea Polyphenols）是茶叶中多酚类物质的总称，包括黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等。

其中以黄烷醇类物质（儿茶素）最为重要。

茶多酚又称茶鞣或茶单宁，是形成茶叶色香味的主要成份之一，也是茶叶中有保健功能的主要成份之一。

研究表明，茶多酚等活性物质具解毒和抗辐射作用，能有效地阻止放射性物质侵入骨髓，并可使锶90和钴60迅速排出体外，被健康及医学界誉为“辐射克星”。

目前国内外茶多酚粗品的提取的方法主要有：溶剂萃取法、离子沉淀法、树脂吸附分离法、超临界流体萃取法、超声波浸提方法、微波浸提法等等。

在这些提取茶多酚的方法中，每种方法都有它各自的针对性和使用范围，使用时要根据各自的情况而定。

根据实验室的条件及实验要求，本实验采用溶剂萃取法对干茶叶中的茶多酚进行粗提取，即利用茶多酚易溶于乙酸乙酯等有机溶剂的原理进行液-液萃取。

茶多酚的测定方法有高锰酸钾直接滴定法和酒石酸铁比色法，由于高锰酸钾直接滴定法操作比较复杂，且靠肉眼观察颜色判断终点，如果样品溶液颜色较深时，可能影响测定结果。

本实验将应用酒石酸铁比色法测定茶多酚的含量。

酒石酸铁能与茶多酚生成紫褐色络合物，络合物溶液颜色的深浅与茶多酚的含量成正比。

因此可以用比色方法测定。

该法可避免高锰酸钾滴定法所产生的人为视觉误差。

三、实验仪器、材料和试剂实验仪器：分光光度计、干燥箱、电子天平、pH计、真空泵、纱布、漏斗、旋转蒸发仪、250ml 容量瓶、50ml 容量瓶、分液漏斗实验材料：干茶叶（市售散装茶即可）实验试剂：硫酸亚铁(FeSO4·7H2O) ，酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O) ，磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) ，磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O) ，乙酸乙酯。

四、实验步骤与方法1、溶液的配制酒石酸亚铁溶液制备：称取0.25 g （准确至0.0001）硫酸亚铁，1.25 g酒石酸钾钠（准确至0.0001），用水溶解并定容至250 ml（低温保存，有效期10天）。

2、干茶叶的预处理将干茶叶洗净、晾干，烘干，最后粉碎。

粉碎的目的是与液体的接触面增大使提取率增高。

由于试验条件的限制，用剪刀代替粉碎机将干茶叶剪碎，并且用研钵研细，干茶叶量为50. 00g。

3、茶多酚的粗提取与定性检测称取经过预处理的干茶叶末30. 00g，加入250mL 90℃接近沸水中搅拌浸提、过滤，先后用250mL的乙酸乙酯萃取两次。

合并两次有机相。

减压蒸馏除去乙酸乙酯溶剂得黄色粉末状茶多酚。

从外观上看，为黄色粉末状。

物理性能为，易溶于水及乙醇，味苦涩。

4、茶多酚溶液的配置与含量的测定称取步骤3中提取的茶多酚粉末0.2500g，加水溶解定容至250mL，混匀，即为每毫升含1mg步骤3中提取的茶多酚粉末的溶液。

分别取茶多酚溶液1. 0mL、2. 0mL、3. 0mL、4. 0mL于4个50mL容量瓶中，各加水至10mL，再加酒石酸亚铁溶液10mL，加入pH为7. 5的磷酸缓冲液至刻度，混匀后用1cm比色皿，以空白试剂作参比，于波长540nm处测定吸光度A，计算实验数据，并绘制实验数据表格。

五、实验现象和数据处理将高山茶叶磨成粉末，加入蒸馏水得混有粉末的深绿色液体，水煮后颜色变黄，变为草绿色。

乙酸乙酯萃取后，上层浅黄色透明溶液，下层墨绿色浑浊液体，两相间的乳化层有大ω—茶多酚的含量(%)，A—样品溶液的吸光度值，T—样品溶液的总体积（mL）V—测定用样品溶液的量(mL)，m—样品质量（g)3.913—用1cm比色杯，当吸光度为1.0时，试液中茶多酚的浓度为3.913(mg/mL)表 1 实验数据汇总5、实验结果检验——绘制茶多酚标准曲线根据步骤4中所得的实验数据，绘制茶多酚标准曲线，斜率R处于0.95-1.05之间方可达到实验要求。

表 2 绘制标准曲线所需数据R=0.813六、注意事项1、磷酸盐缓冲液在常温下容易生长霉菌，放冰箱中保存或临用时现配。

2、茶多酚溶液应保持澄清，若溶解后溶液浑浊应先过滤。

3、实验前需仔细阅读分光光度计使用说明书及注意事项。

4、若茶多酚标准曲线斜率R不介于0.95-1.05之间，则实验数据无效。

七、实验结果与分析本次实验，所采用的测定方法主要为酒石酸亚铁比色法。

茶叶中多酚类物质能与亚铁离子形成紫蓝色络合物，用分光光度法测定其含量。

利用比色法进行测定，可以有效地避免由视觉产生的误差，加以检验后可以得到较为准确的数据。

但经实验证明，酒石酸亚铁比色法测定的茶多酚含量明显偏高。

下表为杭州茶叶研究院用两种比色法测定茶叶中茶多酚含量的实验结果。

表 3 两种测定方法实验结果的比较陈羽迪2012332870002 12生物制药（1）实验二：茶叶中黄酮类化合物的提取和测定一、实验目的：1、了解黄酮类化合物对人体的药理和保健作用。

2、掌握茶叶中提取黄酮类化合物的方法。

3、掌握测定黄酮类化合物含量的方法。

二、实验原理和应用：黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环（A-与B-环）通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮。

黄酮类化合物结构中常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团。

芦丁是黄酮类化合物之一，且对于紫外光具有极强的吸收作用。

天然黄酮类化合物多以苷类形式存在，一般易溶于水、乙醇、甲醇等极性强的溶剂中；但难溶于或不溶于苯、氯仿等有机溶剂中。

实验首先用紫外分光光度法，利用芦丁溶液在波长510nm处具有最大吸收的特点，测定标准芦丁溶液的吸光值，绘制标准曲线。

用无水乙醇提取茶叶中的黄酮类化合物，得到茶叶提取液。

取一定量的茶叶提取液，用紫外分光光度法测定吸光度，根据标准曲线测定提取液中总黄酮的含量。

绝大多数的植物中都含有黄酮类化合物，掌握对茶叶中黄酮类化合物的提取和测定方法，有利于对茶叶资源的综合利用。

对茶叶中黄酮类物质的提取、测定和纯化除以上方法外，还有其他几种常用方法：1）大孔树脂吸附法因为茶叶黄酮具有糖苷链和多酚结构，有一定的亲水性和极性，利于弱极性和极性树脂对其吸附。

而非极性树脂吸附黄酮的量偏小。

2）微波提取法微波具有试剂用量少、加热均匀、提取批量大、选择性好等优点。

以微波辐射的方式可加快反应速度。

在提取黄酮类化合物上取得很好的效果。

3）超声波辅助提取法是利用超声波具有的机械效应，空化效应和热效应，通过增大介质分子的运动速度、增大介质的穿透力来提取生物有效成分。

近年来越来越受到广泛重视。

超声波提取具有节时、节能、节料、提取率高的特点。

三、实验仪器、材料和试剂仪器：分光光度计，电子天平，恒温水浴锅，真空泵，布氏漏斗，250ml容量瓶，试管。

材料：茶叶粉末。

试剂：无水乙醇，芦丁标准品，亚硝酸钠，氢氧化钠，硝酸铝试剂（以上均为分析纯）。

四、实验操作1）绘制标准曲线总黄酮含量测定采用Al(NO3)3—NaNO2分光光度方法，黄酮与铝离子在碱性条件下与亚硝酸钠形成黄酮的铝络合物，生成稳定的黄色。

黄色的深浅与黄酮含量呈一定的比例关系，可与芦丁标准品作对照，于510 nm 波长处比色定量测定。

本实验中茶叶总黄酮含量测定的标准品为芦丁。

准确称取于115℃烘干至恒重的芦丁25 mg，用70％的乙醇溶解并定容至250 mL，使其浓度为100 μg/mL。

用70％乙醇将芦丁溶液稀释成10种不同浓度(0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL)的溶液5 ml。

分别量取不同浓度的芦丁溶液1mL，同时加人70％乙醇1 mL、5％NaNO2溶液0.3 mL，混匀后静置6 min，加入10％Al(NO3)3溶液0.3 mL，混匀，静置6 min，再加入4％NaOH溶液2 mL，混匀，静置20 min，于510 nm波长处测定吸光度(A)。

测得线性回归方程。

2）提取茶叶中的黄酮类化合物称取1g茶叶粉末于烧杯中，加入20mL70%乙醇，用保鲜膜封口，置于80℃恒温水浴锅内1h，抽滤后得滤液。

3）量取1mL滤液，加人70％乙醇1 mL、5％NaNO2溶液0.3 mL，混匀后静置6 min，加入10％Al(NO3)3溶液0.3 mL，混匀，静置6 min，再加入4％NaOH溶液2 mL，混匀，静置20 min，于510 nm波长处测定吸光度。

根据黄酮溶液的浓度与吸光度值成正比，吸光度值越大，黄酮溶液浓度越大，可测定茶叶提取液中黄酮类物质的含量。

五、注意事项乙醇浓度，样品和乙醇溶液的固液比（g/mL），水浴温度和水浴时间均对总黄酮的提取率和测定浓度产生影响。

各个因素对茶叶黄酮提取得率的影响顺序是：乙醇浓度>固液比>温度>时间。

所以实验中要严格按照实验要求进行实验，样品准确量取，以减小实验误差。

实验用到的乙醇溶液浓度较高，实验时间较长，乙醇溶液要注意密封保存，防止乙醇溶液挥发，浓度减小，导致的对实验的影响。

六．实验现象芦丁稀释为一定浓度梯度的溶液，颜色由无色到黄色，随浓度上升而变深。

茶叶的乙醇溶液抽滤后得草绿色滤液。

经过稀释后接近无色，加入硝酸铝变浅黄绿色。

再加NaOH变橙红色溶液。

R=0.942茶叶提取液中黄酮类化合物的测定含量实验数据，填于表1中表1 茶叶提取液中总黄酮的含量平均总黄酮含量。