双标免疫荧光
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免疫荧光实验方法（连续双标法）
石蜡切片
1)烘片
▷在60℃烘箱放置2-4小时，使蜡流失。
2)脱蜡、脱水
▷二甲苯溶液中脱蜡，2次，每次5min
▷100%乙醇，2次，每次3min
▷95%乙醇，1次，每次3min
▷90%乙醇，1次，每次3min
▷85%乙醇，1次，每次3min
▷H2O，1次，每次3min
3)固定
▷样本切片在冰的甲醇中放置10min (甲醇溶液在-80℃预冷)
▷用冰的PBS溶液洗2次，每次3min (PBS溶液在-20℃短暂预冷)
4)透化
▷用含0.25%Triton X-100的PBS孵育石蜡切片10min (200mlPBS+500ul Triton X-100)
▷用PBS溶液洗3次，每次5min
5)第一荧光标记
▷用PBST配置1%的BSA封闭液，将切片在封闭液中孵育1h
▷4℃冰箱，一抗过夜（1%BSA稀释，名称、货号、使用浓度Anti-G3BP2 antibody ab86135 8ug/ml）
▷用枪吸走一抗液体，PBS溶液洗3次，每次5min
▷二抗室温1h (避光，1%BSA稀释，名称、货号、使用浓度Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (FITC) ab97063 1:400)
▷用枪吸走二抗液体，PBS溶液洗3次，每次5min（避光条件下进行）
6)第二荧光标记
▷4℃冰箱，一抗过夜（避光，1%BSA稀释，名称、货号、使用浓度Anti-Fibronectin antibody ab2413浓度1:200？OR Anti-alpha smooth muscle Actin antibody ab5694浓度1:100？）▷用枪吸走一抗液体，PBS溶液洗3次，每次5min
▷二抗室温1h (避光，1%BSA稀释，名称、货号、使用浓度Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor® 555)ab150074浓度1:500？)
▷用枪吸走二抗液体，PBS溶液洗3次，每次5min（避光条件下进行）
7)DAPI对比染色
▷2µg/ml的DAPI，15min
▷用PBS冲洗3次
8)封片
▷用移液枪吸中性树脂一小滴，盖上盖玻片，用指甲油涂抹边缘，待风干后显微镜照相。