相关背景资料

关于PET-28a载体的表达

用PET-28a载体的原核表达出来的蛋白一般会是出现在上清呢，还是会出现沉淀中啊？这个载体表达出来的一般是不是包涵体？

用pet-28a载体的原核表达出来的蛋白在破菌前肯定会出现在菌体沉淀中，不会分泌在培养基上清中的。至于破菌以后，表达出来的在沉淀中还是在上清中，要由目标蛋白的性质来定了，没有固定形式的。

至于是否是包涵体，主要也是由目的蛋白的性质与表达量来决定的，pet-28a这种载体没有本身溶解性高的多肽融合蛋白，也没有催化二硫键形成的酶融合蛋白，而且不含信号肽序列，所以同一种蛋白用这个载体，形成包涵体的可能性更大些。

楼主是的是大肠杆菌作为外源基因表达的宿主吗？

相对其他生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源生物基因，特别是外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数的外源基因即便能分泌表达，其表达率通常也比包涵体方式低得多。

蛋白产物N端信号肽序列是蛋白质分泌的前提条件，如果楼主用pet-28a载体表达的外源基因的5'端不带有信号肽序列的话，将如eastrocket战友所言，表达出来的蛋白在破菌前肯定会出现在菌体沉淀中，但异源蛋白在原核细胞中的定位可能会有两种情况，可能是以可溶性存在或不可溶性（包涵体）存在于细胞质中，这主要取决于的异源蛋白的性质和表达量。

概念

pEGFP-N3载体为真核细胞表达载体。

pEGFP-N3载体特点

①从结构上看，该质粒具有很强的复制能力，可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一；

②含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达；

③具有多克隆位点，便于目的基因的插入；

④该载体具有neo基因，可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞。

这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳定表达。

pEGFP-N3载体上携带有EGFP蛋白表达基因，如上图质粒图谱所示。GFP的相关知识

绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因来源于

Jellyfish Aequorea Victoria，是Shimomura等于1962年发现的蛋白质，由238个氨基酸组成，分子量约为27Kd。GFPGFP在包括热、极端PH和化学变性剂等苛刻条件下都很稳定，用甲醛固定后会持续发出荧光，但在还原环境下荧光会很快熄灭。

与以往常用的报告基因相比，GFP具有以下优点：

①在荧光显微镜下，用波长约490 nm的紫外线激发后，即可观察到绿色荧光，直接、简捷、便于检测；

②无需任何的作用底物或共作用物,检测的灵敏度不受反应效率的影响，保证了极高的检出率；

③蛋白本身性质稳定；

④可在多种异源生物中表达且无细胞毒性；

⑤其基因片段长度较小(约717 bp)，易于构建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持荧光激发活性，为研究其他基因表达产物的分布提供了方便。

EGFP是一种优化的突变型GFP，使其产生的荧光较普通GFP强35倍，大大增强了其报告基因的敏感度。EGFP与其他蛋白的融合表达已有很多成功的例子，而且其N及C端均可融合，并不影响其发光。

NotⅠ

限制性内切酶，由豚鼠耳炎诺卡氏菌产生。

识别位点是：GCGGCCGC

切割后的片段具有黏性

它属于限制性内切酶Ⅱ类。

BamHⅠ

限制性内切酶，由淀粉芽孢杆菌产生。

识别位点是：GGATCC

切割后的片段具有黏性

它属于限制性内切酶Ⅱ类。

报告基因

报告基因 (reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。

重组质粒

基本简介

质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。

反应策略

带有非互补突出端的片段

外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：

1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。

带有相同的粘性末端

2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。

带有平末端

3、带有平末端是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。

特殊情况下

外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow 大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。