【干货】真菌检测中常见问题专家解答

【干货】真菌检测中常见问题专家解答

近年来，随着恶性肿瘤的高发、艾滋病的流行、化疗药物、广谱抗生素、糖皮质激素和免疫抑制剂等药物的广泛使用，以及人工导管等侵入性操作、器官移植等有创诊疗技术的应用，由真菌所引起的感染日益成为临床各科室面临的巨大挑战。为了提高临床诊断水平，加强真菌的检验能力显得至关重要，现在临床微生物实验室有关真菌检验的常见问题汇总如下，供大家学习参考。1、为什么培养要设定35℃？实验室通常将孵箱温度设定为35℃，是为了防止温度的波动对细菌或真菌生长的影响。临床常见细菌的最适生长温度为33~37℃(嗜热，嗜中温菌除外，占少数)，设定为35℃时上下波动2℃对培养无影响，如设定为37℃C显然就不合适了。至于真菌培养,要视标本来源而定。一般怀疑浅部真菌感染的标本如皮屑、甲屑、头屑及毛发等分离培养于26~28℃。来源于人体深部组织的标本如痰、胸腹水、血及骨髓深部脓肿等,建议放35℃培养,是刚离体的标本在35℃更接近于人体温度,其次临床最常见的白念珠菌在35℃能形成更为典型的伪足样菌落,这与血清出芽试验在35℃做是同样的道理。同时,来源于35℃初分离的光滑念珠菌具有更高的酶活性。怀疑温度型双相真菌感染或个别真菌需要较高温度生长时则需要

两种温度同时培养。还要注意培养环境的湿度,一般要求大于

60%,如果培养箱的湿度不够,最好在平板附近放置盛有无菌水的容器以保证湿度。2、CO2对真菌生长影响大吗?真菌属于异养型微生物，主要从有机化合物中获得碳源,而自养型微生物才需要从CO2中获得碳源，所以真菌一般不需要在二氧化碳环境中培养，而且CO2对真菌的生长和繁殖均不利,但一定浓度可刺激孢子形成。

3、在血培养中培养出真菌2次，但是患儿没有临床表现，而且临床也没用抗真菌药患儿就好了，是考虑污染吗?

这种情况要判断是否为污染菌，调查采血过程是否规范、血瓶转运过程是否符合要求、针孔是否适当封口、转运箱是否受到污染等众多因素，最关键的还是患者的临床表现，如没有真菌感染的症状，要么考虑污染，要么考虑定植(可能性不大)。4、我们基层医院实际工作中做阴道分泌物真菌培养，生化鉴定几乎做不了，很多直接报白念珠菌，这样合适吗？这样做不合适。目前有些检验科甚至分不清酵母菌和霉菌，在阴道白带、尿液和粪便中镜检发现念珠菌后报告为“找到霉菌”。霉菌是指丝状多细胞真菌；酵母菌是指单细胞形态的真菌，二者不可混为一谈。阴道中感染的酵母菌大多是白念珠菌，但不排除其他酵母菌。克柔念珠菌对氟康唑和5-氟胞嘧啶天然耐药，如果遇到类似存在天然耐药的菌株，会影响后续的治疗。

5、痰标本中少量念珠菌需要在报告中体现吗?还是不报告?

标本要求和检验程序用要体现，临床医生会综合考虑。虽然白色念珠菌导致肺部真菌感染的概率很小，遇到痰标本真菌培养中分离出该真菌，还是建议报告，临床医生结合影像学结果综合考虑。先进性痰标本直接涂片，标本质量合格的情况下，见到真、假菌丝或大量孢子，痰培养有真菌生长，还是要报给临床医生，临床医生会综合考虑的。至于是否要做药敏，可和医生沟通后决定。①建议留样本前5%苏打水漱口；②清晨第一口痰；③连送3d结果是否一致。最好和临床医生沟通一下,或平时对医生、护士进行标本采集方法的培训。报告之前,结合痰涂片镜检结果,备注标本质量信息及污染可能性。

6、请问一下：前几天遇到一个抽出的脓液标本，打到血培养中，报阳后涂片显示真菌孢子，转种后涂片，形态上圆形，墨汁染色阳性，但是没有莢膜，转种科玛嘉没有颜色，后有白色有点黄色，用某国产鉴定显示近平滑，药敏全耐。问题是:①这个结果可信不?②墨汁用的是普通汁有影响吗?③该

如何改进?墨汁染色是针对标本中怀疑隐球菌属的荚膜进行负染，特别是新生隐球菌才做的试验，对纯培养的隐球菌属不可作为鉴定试验。(1)将之前的脓液标本做个10%KOH湿片检，寻找真菌孢子和真、假菌丝。(2)培养结果应该是可信的，最好和临床医生沟通一下，看患者是否有症状。(3)对某国产品牌不熟悉,鉴定结果和药敏结果不好判断(4)按照全国

操作规程配制念珠菌的鉴定生化管，用原卫生部质控真菌鉴定符合率还是很好的，可以考虑自配生化鉴定管，用质控真菌进行验证。(5)对每批号的某国产鉴定管用质控真菌进行验证,如果结果符合,应该没问题。(6)最好参加原卫生部微生物质控培训，无论细菌、酵母菌方面,都会帮助你提高业务水平和验证你所用的试剂质量。(7)墨汁只要粗细均匀，颗粒越细小越好，推荐曹素功墨汁，试剂公司也有印度墨汁可采购。

7、临床常见痰标本初次检出曲霉后,流程是怎么进行下去的?

(1)痰标本初次培养出丝状真菌菌落，前提是痰标本必须是新鲜的或不能立即送检应4℃冰箱保存。流程是接受痰标本→镜检→培养→鉴定。在痰标本合格的情况下,先做个10%KOH 湿片镜检,低倍镜寻找真菌菌丝，是透明或暗色，是否有45度分枝。如果痰标本合格，又找到菌丝，电话联系临床，告诉医生有丝状真菌生长，怀疑是XXXX，容易的直接报告临床，难的点种沙氏琼脂平板或察氏琼脂平板，再做进步鉴定。

(2)若标本不合格或合格但标本中未见菌丝，和临床医生电话沟通，告知有真菌生长，让医生综合考虑。鉴定正常进行,

并报告临床,备注不排除污染可能。

8、酵母菌同化试验为什么放28℃而不是35C?同化试验和发酵试验有何区别?为什么教科书上说凡能发酵某种糖，一定能同化该糖，同化某种糖则不一定发酵该糖?多数酵母菌体外最适生长温度为28-30℃，故其体外试验选用此温度。通话和

发酵分别指真菌的有氧呼吸和无氧酵解，前者将糖类分解为二氧化碳和水，后者将糖类分解为二氧化碳和酒精等。其代谢首先进行的是有氧呼吸获得能量，再进一步进行无氧酵解，这由细菌和真菌的相关酶类决定。酵母菌多数为专性需氧菌，所以其试验设计多以糖同化试验为主。比如隐球酵母只能进行有氧呼吸，所以只能同化葡萄糖而不能发酵，而酿酒酵母可将粮食发酵为酒，既发酵也同化葡萄糖。

9、鉴于目前真菌培养不是很规范，如何选择培养基、温度、报告时间和方式?请讲述实验室的具体流程。

(1)培养基：沙氏葡萄糖琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂、脑心浸膏琼脂等适宜真菌生长的培养基，临床疑似酵母菌及酵母样菌感染，有条件实验室可平行接种显色培养基，推荐采用螺口管斜面培养法，标本处理后接种于培养基斜面中下部，真菌绝大多数为需氧菌建议平行接种两管。(2)培养条件及报告时间：深部真菌28±1℃培养7~14d，如怀疑双相真菌感染，应同时在28士1℃及35士1℃培养。怀疑罕见真菌慢生长真菌感染或临床已用抗真菌药物时，延长观察时间至少培养4周。如CSF宜置28℃及35℃两个温度培养至少一周；痰/尿/粪一般35℃48h即可，如未见丝状真菌生长，则延长培养时间；组织标本一般30℃，2~4周。10、是否可以用科玛嘉显色培养基作为真菌初代培养基?

可作为初代培养基之一，建议另外接种沙氏培养基或酵母氮