衣原体病,弓形虫间接血凝(IHA)试验操作方法

十一、衣原体病间接血凝（IHA）试验操作方法衣原体属的三个种都存在共同的属特异性抗原。衣原体病间接血凝试验，则是用已知的属抗原检测人、畜、禽血清或分泌物中的抗体。具有特异、敏感、简便、快速之优点。

（一）试剂盒内容

包括衣原体属抗原致敏绵羊红细胞、阳性和阴性对照血清。

（二）试验方法

1．将生理盐水滴于V型反应板也孔中，每孔50微升。

2．取被检样品（血清或分泌物）50微升于第1孔中，与生理盐水混匀后吸50微升加于第2孔，依次作对倍稀释至所要求的稀释度。

3．每孔加抗原25微升，作定性检查时只需加两孔。人血清只加1：4和1：8两孔。阴道分泌物只加1：2和1：46。孔哺乳动物血清只加1：32和1：64两孔，禽类血清只加1：8和1：18两孔。如作定量试验则可根据实际需要自行决定。

试验：设阳性血清+抗原、阴性血清+抗原、生理盐水+抗原各1孔。

（三）结果判定

1．判定标准

“++++”红细胞全部凝集，形成一层均匀的膜，布满整个孔底

“+++”红细胞在孔底形成一层薄膜，面积比前者稍小

“++”红细胞在孔底形成薄层凝集，边缘松散或呈锯齿状

“+”红细胞在孔底呈稀薄、、散在、少量凝集，孔底有小圆点

“±”红细胞沉于孔底，但周围不光滑或中心有空斑

“-”红细胞完全沉于孔底，呈光滑的圆点

“++”经上的凝集判为阳性凝集

2．对照试验出现如下结果试验方可成立，否则应重试，阳性血清+抗原呈“++++”；阴性血清+抗原呈“—”，抗原+生理盐水呈“—”。

3．被检样品判定标准：

人群血清效价≥1：8（++）者判为阳性；效价≤1：2者判为阴性；介于二者之间判为可疑。人群阴道分泌效价≥1：2（++）者判为阳性；效价≤1：2（++）者判为阴性。

哺乳动物血清效价≥1：64（++）者判为阳性；效价≤1：16（++）者判为阴性；介于二者之间判为可疑。

禽类血清效价≥1：16（++）者判为阳性；效价≤1：4（++）者判为阴性；介于二者之间判为可疑。

[注]被检样品采集及处理方法：

1.血清：按常规方法采血及分离血清，要求无腐败。

2. 阴道分泌物：用灭菌棉拭子插入阴道3厘米，蘸取分泌物，浸入1毫升生理盐水中，挤压后取液体，经20000转/分钟离心5分钟，取上清液作待检样品。

(邱昌庆)

十二、弓形体间接血凝集试验（IHA）操作方法本细试验系用弓形体间接红细胞凝集试验冻干抗原（IHA抗原），检测人和动物血清中弓形体（虫）抗体的方法。检测在96（12×8）孔110°V型有机玻璃（聚苯乙烯）微型反应板上进行。

（一）操作方法

1．将IHA抗原按瓶签所标毫升数用灭菌蒸镏水稀释摇匀，1 500~2 000转/分钟离心5~10分钟，弃上清液，加等量稀释液摇匀，置4℃左右24小时后使用。稀释后诊断液，10天内效价不变。

2．被检血清（以下称样品）的采取采欲测弓形虫抗体的人或动物血液2~2.5毫升，大约能分离1毫升左右血清（应无血球）。

3．加稀释液每孔加0.075毫升，如果没有取液器（移液器），可以把磨钝（齐）了的12号针头接在盐水接头（针头接嘴）上，后装一橡皮乳头，组成移液管，将移液管竖直加三滴，每一滴约0.025毫升（每毫升约40滴，下同）。

定性检查时，每个样品加4孔，定量检查加8孔，一块反应板上定性能检20个样品，定量能检10个样品。

每块板上不论检测几个样品，均应设阳、阴性血清对照，对照均加8孔。

4．加样品、阳、阴性对照血清第一孔加相应血清0.025毫升。

5．稀释定性检查时，稀释至第3孔，定量和对照至第8孔，为稀释液对照至第7孔。定性的第4孔，定量和对照的第8孔，为稀释液对照；按常规用取液器稀释，如无取液器，可用0.025毫升的稀释棒稀释。将稀释棒放入第1孔内，用左手掌、右手背夹住稀释棒，左右往复搓动，使棒旋转30次以上，然后将棒夹紧、夹平提起，移入相应的第2孔内，如法依次往下稀释，至应稀释的最后一孔，将棒取出。棒上带走0.025毫升液体。每个孔内的液体仍为0.075毫升，移棒时切莫使棒相互接触，旋转时不要让棒上下捣，否则容易产生气泡。

6．加诊断液（IHA抗原）将诊断液摇匀，每孔加0.025毫升。用移液管加，每孔一滴，加完后将反应板置微型振荡器上振荡1~2分钟，直至诊断液中的血球分布均匀、从振荡器上取下反应板，盖上一块与反应板大小相近的玻璃片或干净的纸，以防灰尘落入，置22~37℃下2~3小时后观察结果。

（一）结果判定

在阳性对照血清滴度不低于1：1 024（第5孔），阴性对照血清除第1孔允许存在前滞现象（+）外，其余各孔均为（—），稀释液对照为（—）的前提下，对被检血清进行判定，否则应检查：①操作是否正确无误；②反应板、稀释棒等是否洗涤干净；③稀释液、诊断液、对照血清是否有效；④其它原因。

(兰州兽医研究所)