冷冻电镜演示(2)精品PPT课件
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冷冻电镜技术知识分享36页PPT
冷冻电镜技术知识分享
36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。
39、没有不老的誓言，没有不变的承 诺，踏 上旅途 ，义无 反顾。 40、对时间的价值没有没有深切认识 的人， 决不会 坚韧。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根
36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。
39、没有不老的誓言，没有不变的承 诺，踏 上旅途 ，义无 反顾。 40、对时间的价值没有没有深切认识 的人， 决不会 坚韧。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根
生物物理为冷冻电镜实验PPT28页
66、节制使快乐增加并使享受加强。 ——德 谟克利 特 67、齐 68、决定一个人的一生，以及整个命运 的，只 是一瞬 之间。 ——歌 德 69、懒人无法享受休息之乐。——拉布 克 70、浪费时间是一桩大罪过。——卢梭
生物物理为冷冻电镜实验
6、法律的基础有两个，而且只有两个……公平和实用。——伯克 7、有两种和平的暴力，那就是法律和礼节。——歌德
8、法律就是秩序，有好的法律才有好的秩序。——亚里士多德 9、上帝把法律和公平凑合在一起，可是人类却把它拆开。——查·科尔顿 10、一切法律都是无用的，因为好人用不着它们，而坏人又不会因为它们而变得规矩起来。——德谟耶克斯
冷冻电镜技术PPT课件
蛋白原子水平的三维结构模型，第一个用冷冻电镜解析出来的
膜蛋白结构。
13
冷冻电镜技术的发展 2
细菌视紫红质3D结构
1975年，Richard Henderson（理查德·亨德森）利用电子显微三 维重构技术首次获得7埃分辨率的细菌视紫红质3D结构的历史性突破。 这是人们首次观测到膜蛋白的跨膜螺旋三维结构。
冷冻电镜技术 Cryo-EM
1
1 冷冻电镜技术的概述
什么是Cryo-EM、冷冻电镜的分类
目
C
O录
N T E N T S
2 冷冻电镜技术的发展
1968—→Now
3 冷冻电镜技术的原理
样品冷冻、冷冻成像、三维重构
4 冷冻电镜技术的应用
结构生物学、医疗、具体应用场景
2
1
PA R T
冷冻电镜技术的概述
3
该原理所涉及的步骤在数学上是复杂的，将这个原理应用于电镜图像: 一个三维物体的 电镜图像的傅立叶变换等于该三维物体的傅立叶变换通过物体中心并垂直于摄像方向的截面。 一个物体( 如蛋白质、病毒、细胞器、细胞) 从不同方向所摄取的n个电镜图像做傅立叶变换， 这些2D傅立叶变换图像的集合构成傅立叶空间，即该物体三维结构的三维傅立叶变换，对此 三维傅立叶变换作逆傅立叶变换就恢复原物体的三维结构。
11
2
PA R T
冷冻电镜技术的发展
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1968
Aaron Klug开创了基于负染的 噬菌体病毒的电镜三维重构技术
冷冻电镜技术的发展 2
1975
Richard Henderson利用电子显微三维重 构技术首次获得7埃分辨率的细菌视紫红 质3D结构的历史性突破
1982
Jacques Dubochet开发出真正成熟 可用的快速投入冷冻制样技术制作的不
冷冻电镜.ppt
3. Provide initial molecular displacement model and initial phase for X-ray crystallographic analysis Such as: ribosome three-dimensional structure (为X-射线晶体学结构解析提供初始分子置换模型及初始相位） 如：核糖体的三维结构 4. Study the structure of biological macromolecular complexes. Such as: virus - receptor complex structure （研究生物大分子复合物的结构）如：病毒-受体复合物的结构 5. Study organelles and even the structure of living cells. Such as: biological molecules in the movement of the structure and structure changes.（研究细胞器甚至是活细胞的结构) 如:生物分子在运动过程中的结构和结构的变化
the early 20th century to the development of ergodic virus single particle three-dimensional reconstruction technology.
（20世纪初期发展至二十面体病毒的单颗粒三维重 构技术）
In 2010, the three-dimensional reconstruction technique of cryoelectron microscopy was used to determine the structure of protein TRPV1, which marked that the cryostat was involved in the era of "atomic resolution" （2014年利用冷冻电镜三维重构技术确定蛋白质TRPV1结构， 标志着冷冻电镜跨入“原子分辨率”时代）
冷冻电镜
冷冻电镜
扫描电镜的超低温冷冻制样及传输技术
目录
01 电镜观察
02 课题研究
冷冻电镜，是用于扫描电镜的超低温冷冻制样及传输技术(Cryo-SEM)，可实现直接观察液体、半液体及对电 子束敏感的样品，如生物、高分子材料等。
电镜观察
样品经过超低温冷冻、断裂、镀膜制样（喷金/喷碳）等处理后，通过冷冻传输系统放入电镜内的冷台（温度 可至-185℃）即可进行观察。其中，快速冷冻技术可使水在低温状态下呈玻璃态，减少冰晶的产生，从而不影响 样品本身结构，冷冻传输系统保证在低温状态下对样品进行电镜观察。
课题研究
中国科学技术大学教授毕国强、刘北明与美国பைடு நூலகம்州大学洛杉矶分校教授周正洪组成课题组，利用冷冻电镜技 术对完整突触进行了系统性定量分析。美国神经科学学会会刊《神经科学》日前以封面形式对此进行了报道 。
课题组利用冷冻电镜技术，结合自主研发的冷冻光电关联显微成像技术，实现了对中枢神经系统中两类最主 要突触——兴奋、抑制性突触的精确区分以及结构特征的定量化分析。他们将大鼠的海马神经元培养在冷冻电镜 的特型载网上，快速冷冻并直接成像，获得了一系列完整突触在近生理状态下的三维结构。结合定量分析手段， 了解了抑制性突触的均匀薄片状突触后致密区结构，获得了突触在分子水平的精细组织架构，实现了在突触原位 直接观察单个神经递质受体蛋白复合物及其与支架蛋白的相互作用。
感谢观看
扫描电镜的超低温冷冻制样及传输技术
目录
01 电镜观察
02 课题研究
冷冻电镜，是用于扫描电镜的超低温冷冻制样及传输技术(Cryo-SEM)，可实现直接观察液体、半液体及对电 子束敏感的样品，如生物、高分子材料等。
电镜观察
样品经过超低温冷冻、断裂、镀膜制样（喷金/喷碳）等处理后，通过冷冻传输系统放入电镜内的冷台（温度 可至-185℃）即可进行观察。其中，快速冷冻技术可使水在低温状态下呈玻璃态，减少冰晶的产生，从而不影响 样品本身结构，冷冻传输系统保证在低温状态下对样品进行电镜观察。
课题研究
中国科学技术大学教授毕国强、刘北明与美国பைடு நூலகம்州大学洛杉矶分校教授周正洪组成课题组，利用冷冻电镜技 术对完整突触进行了系统性定量分析。美国神经科学学会会刊《神经科学》日前以封面形式对此进行了报道 。
课题组利用冷冻电镜技术，结合自主研发的冷冻光电关联显微成像技术，实现了对中枢神经系统中两类最主 要突触——兴奋、抑制性突触的精确区分以及结构特征的定量化分析。他们将大鼠的海马神经元培养在冷冻电镜 的特型载网上，快速冷冻并直接成像，获得了一系列完整突触在近生理状态下的三维结构。结合定量分析手段， 了解了抑制性突触的均匀薄片状突触后致密区结构，获得了突触在分子水平的精细组织架构，实现了在突触原位 直接观察单个神经递质受体蛋白复合物及其与支架蛋白的相互作用。
感谢观看
电镜超薄切片课件PPT
与常规切片技术的比较
切片厚度
电镜超薄切片技术使用的切片厚度通常在50-100纳米之间， 远小于常规切片技术的切片厚度，能够更好地保留细胞和组 织的细微结构。
观察效果
由于超薄切片的厚度极薄，电镜下观察时能够获得更高的分 辨率和更清晰的图像，更准确地反映细胞和组织的形态。
与其他电镜技术的比较
透射电镜与扫描电镜
发展高效的数据处理和分析方法，应 对海量数据带来的挑战，挖掘更多有 价值的信息。
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感谢您的观看
应用领域
01
02
03
04
生物学
研究细胞、组织、器官的超微 结构和功能，如细胞器、细胞
膜、染色体等。
医学
诊断疾病、研究病变组织、药 物作用机制等。
材料科学
研究材料的微观结构和性能， 如金属、陶瓷、高分子业、食品科学等 。
02 电镜超薄切片制备流程
样品选择与处理
样品选择
选择合适的电镜型号
根据实验需求，选择具有高分 辨率和高成像质量的电镜型号
，如透射电镜或扫描电镜。
操作电镜前的准备
确保电镜处于良好的工作状态 ，检查真空度、电源和控制系 统是否正常。
样品制备
将超薄切片置于电镜载网上， 调整位置，确保切片平整且不 与载网接触。
观察与成像参数设置
根据样品特性，调整加速电压 、工作距离、物镜光圈等参数
，以获得最佳成像效果。
图像的获取与处理
1 2
图像获取
通过电镜的摄像系统或数字成像系统获取切片图 像。
图像处理
对获取的图像进行对比度、亮度调整，以及伪彩 色标记等处理，以增强图像的可视化效果。
3
图像保存与输出
冷冻电镜技术PPT课件
1 冷冻电镜技术的概述
什么是Cryo-EM
冷冻电镜即冷冻电子显微镜 (cryo-electron microscopy，cryo-EM)，是将生物大分子快速冷 冻后，在低温环境下利用透射电子显微镜对样 品进行成像，再经图像处理和重构计算获得样 品的三维结构。
4
1 冷冻电镜技术的概述
看清楚分子级别的结构必须用电子显微镜
蛋白原子水平的三维结构模型，第一个用冷冻电镜解析出来的
膜蛋白结构。
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冷冻电镜技术的发展 2
细菌视紫红质3D结构
1975年，Richard Henderson（理查德·亨德森）利用电子显微三 维重构技术首次获得7埃分辨率的细菌视紫红质3D结构的历史性突破。 这是人们首次观测到膜蛋白的跨膜螺旋三维结构。
冷冻电镜技术 Cryo-EM
1
1 冷冻电镜技术的概述
什么是Cryo-EM、冷冻电镜的分类
目
C
O录
N T E N T S
2 冷冻电镜技术的发展
1968—→Now
3 冷冻电镜技术的原理
样品冷冻、冷冻成像、三维重构
4 冷冻电镜技术的应用
结构生物学、医疗、具体应用场景
2
1
PA R T
冷冻电镜技术的概述
3
形成冰晶体的玻璃态冰包埋样品
2013
冷冻电镜三维重构技术确 定蛋白质TRPV1结构，标 志着冷冻电镜跨入“原子
分辨率”时代
1974
Robert Glaeser首次提出并进行 了冷冻含水生物样品的电镜成像。
1981
Joachim Frank完成了单颗粒
三维重构算法及软件Spider。
1990 Ric年hard Henderson利用冷冻电镜技术获得了细菌视紫红质
冷冻电镜流程
冷冻电镜流程一、引言冷冻电镜（Cryo-EM）是一种用于观察生物分子结构的先进技术。
与传统的电子显微镜相比，冷冻电镜能够在冷冻状态下直接观察生物样品，避免了生物样品在制备过程中的伪装和变性，从而提供了更真实、更准确的结构信息。
本文将介绍冷冻电镜的基本流程。
二、冷冻电镜流程1. 样品制备冷冻电镜的样品制备是整个流程中非常关键的一步。
首先，需要选择适合冷冻电镜观察的样品，如蛋白质、细胞或病毒等。
然后，将样品制备成纯净的溶液或悬浮液。
接下来，将样品滴在特制的网格上，并通过吸附或冷冻的方式将样品固定在网格上。
2. 冷冻冷冻是冷冻电镜中非常重要的一步，它能够保持样品的原始结构。
冷冻的主要目的是使样品迅速冷却到液氮温度，避免样品在冷冻过程中发生结构变化。
通常，可以使用液氮冷冻样品，或者将样品暴露在液氮中的乙烷中进行冷冻。
3. 电子显微镜扫描在冷冻样品制备完成后，需要将样品放入电子显微镜中进行扫描。
在电子显微镜中，样品受到电子束的照射，并通过透射电子显微镜模式观察样品的结构。
通过调整电子束的条件和样品的位置，可以获取不同角度和不同焦距下的图像。
4. 图像处理获得的电子显微镜图像通常是模糊且包含噪声的。
因此，需要对图像进行处理，以获得更清晰、更准确的结构信息。
图像处理的主要步骤包括去噪、增强对比度、对齐和三维重建等。
通过这些处理步骤，可以获得高分辨率的三维结构模型。
5. 结果分析需要对获得的结构模型进行分析和解释。
可以使用分子建模软件将蛋白质或其他生物分子的原子坐标与结构模型进行比较，以验证模型的准确性。
此外，还可以使用其他生物物理学和生物化学技术对结构进行进一步的验证和研究。
三、总结冷冻电镜流程是一系列严格的步骤，其中每个步骤都非常关键。
样品制备、冷冻、电子显微镜扫描、图像处理和结果分析都需要仔细操作和科学实验设计。
通过冷冻电镜，我们可以获得高分辨率的生物分子结构信息，为生物科学研究提供了强有力的工具。
未来，冷冻电镜技术的发展将进一步推动生物科学的进步和发展。
冷冻电镜技术知识分享共36页PPT
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
冷冻电镜技术知识分享
31、园日涉以成趣，门虽设而常关。 32、鼓腹无所思。朝起暮归眠。 33、倾壶绝余沥，窥灶不见烟。
34、春秋满四泽，夏云多奇峰，秋月 扬明辉 ，冬岭 秀孤松 。 35、丈夫志四海，我愿不知老。
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
冷冻电镜技术知识分享
31、园日涉以成趣，门虽设而常关。 32、鼓腹无所思。朝起暮归眠。 33、倾壶绝余沥，窥灶不见烟。
34、春秋满四泽，夏云多奇峰，秋月 扬明辉 ，冬岭 秀孤松 。 35、丈夫志四海，我愿不知老。
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
冷冻电镜揭示生物大分子六组PPT课件
冷冻电子显微技 术
• 蛋白质散射电子 的强度比X射线 大一万倍，而电 子可以通过几十 万伏的电场加速 到比蛋白质结构 中原子间距离短 得多的波长。此 外，电子的电荷 使得相对容易用 电磁透镜聚焦它 们。
可编辑
2019/9/20
10
一般电镜技术在生物领域应用制约因素
1.生物样品含有丰富的水分，而投射电镜工作的条件是高度真 空环境 2.高能电子束会对样品造成破坏 （电压一般为300kV,200kV,120kV) 3.生物样品主要组分是碳、氢、氧等轻元素，对电子的反射和 散射作用与背景相比效果相似，所获图像衬度低， 4.观察过程中蛋白质与电子发生相互作用或者由于温度变化而 发生漂移，导致模糊
Unravelling biological macromolecules with cryo-electron microscopy
第六组成员（徐小虎，曾伟杰， 王建，刘腾飞，杨琦琦，苏婷，
温寒炎） 2018.10.13
目录
1.背景及简介
2.样品制备
3.优势
4.展望
可编辑
2019/9/20
2
1.背景及简介
可编辑
2019/9/20
17
采集过程
“分子随机冷冻在某个状态” “单颗粒冷冻” “分辨率达到2.9Å =0.29nm
可编辑
2019/9/20
18
可编辑
2019/9/20
19
优势
1.不需要结晶 2.样品保存在天然环境 3.可以研究亚稳态结构 4.样品量少（1μ L)蛋白分子需要120kd以上， 二聚体的话60kd也可以考虑）
可编辑
2019/9/20
11
辐射损伤意味着穿过样品的电子将破坏其化学键，改 变原有结构信息（比如蛋白、脂等等），将它们“烧 掉”。所以，氢键会被破坏，变成了气体，留下的只 有一些结构残骸
冷冻电镜
10
冷冻电镜在现代生物学中的应用：
4.研究生物大分子复合物的结构 如：病毒-受体复合物的结构 5.研究细胞器甚至是活细胞的结构 如:生物分子在运动过程中的结构和结构的变化
11
谢谢观赏
12
6
三维重构技术的原理：
透射电子显微镜成像过程中, 电子束穿透样品,将样品的三维电势密 度分布函数沿着电子束的传播方向投影至与传播方向垂直的二维平 面上。运用中心截面定理(图2), 从而可以通过三维物体不同角度的 二维投影在计算机内进行三维重构来解析获得物体的三维结构。
图2
中心截面定理
7
冷冻电镜优点：
冷冻电镜与结构生物学
报告者：
冷冻电镜与结构生物学
◆冷冻电镜在结构生物学上应用的历史沿革
◆冷冻电镜的流程与工作原理
◆冷冻电镜优点与局限 ◆冷冻电镜在现代生物学中的应用
冷冻电镜是什么？
冷冻电镜：应用冷冻固定技术，低温下使用透射电子显微镜观
察样品显微技术，从而得到生物大分子的结构
3
历史沿革：
★ 20世纪70年代通过利用冷冻电镜研究病毒分子的结构，从而
◆样品需求量少 ◆更接近生理状态 ◆适用研究对象广泛 ◆可以对不均一样品进行研究 ◆不需要对样品进行特殊化处理 ◆可获得不同构象或中间物的动态快照
8
冷冻电镜局限：
◆设备昂贵 ◆样品的准备困难 ◆样品需冷冻，不是在室温下进行 ◆样品可能被过强的电子束损伤
9
冷冻电镜在现代生物学中的应用：
1.研究那些不适合于应用X-射线晶体学和核磁共 振波谱学的分子及其聚合物的结构 如：Alzhiemer疾病的淀粉状蛋白纤维聚合物的 结构 2.研究生物大分子处于不同功能状态时的结构 如：离子通道开关 3.为X-射线晶体学结构解析提供初始分子置换模 型及初始相位 如：核糖体的三维结构
冷冻电镜在现代生物学中的应用：
4.研究生物大分子复合物的结构 如：病毒-受体复合物的结构 5.研究细胞器甚至是活细胞的结构 如:生物分子在运动过程中的结构和结构的变化
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谢谢观赏
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三维重构技术的原理：
透射电子显微镜成像过程中, 电子束穿透样品,将样品的三维电势密 度分布函数沿着电子束的传播方向投影至与传播方向垂直的二维平 面上。运用中心截面定理(图2), 从而可以通过三维物体不同角度的 二维投影在计算机内进行三维重构来解析获得物体的三维结构。
图2
中心截面定理
7
冷冻电镜优点：
冷冻电镜与结构生物学
报告者：
冷冻电镜与结构生物学
◆冷冻电镜在结构生物学上应用的历史沿革
◆冷冻电镜的流程与工作原理
◆冷冻电镜优点与局限 ◆冷冻电镜在现代生物学中的应用
冷冻电镜是什么？
冷冻电镜：应用冷冻固定技术，低温下使用透射电子显微镜观
察样品显微技术，从而得到生物大分子的结构
3
历史沿革：
★ 20世纪70年代通过利用冷冻电镜研究病毒分子的结构，从而
◆样品需求量少 ◆更接近生理状态 ◆适用研究对象广泛 ◆可以对不均一样品进行研究 ◆不需要对样品进行特殊化处理 ◆可获得不同构象或中间物的动态快照
8
冷冻电镜局限：
◆设备昂贵 ◆样品的准备困难 ◆样品需冷冻，不是在室温下进行 ◆样品可能被过强的电子束损伤
9
冷冻电镜在现代生物学中的应用：
1.研究那些不适合于应用X-射线晶体学和核磁共 振波谱学的分子及其聚合物的结构 如：Alzhiemer疾病的淀粉状蛋白纤维聚合物的 结构 2.研究生物大分子处于不同功能状态时的结构 如：离子通道开关 3.为X-射线晶体学结构解析提供初始分子置换模 型及初始相位 如：核糖体的三维结构
冷冻电镜技术知识分享
冷冻扫描电子显微镜（Cryo-SEM）
冷冻扫描电镜技术一般是在普通扫描电镜上加装低温冷冻传输系统和冷冻样品台装置，它是在扫描电镜 的基础上发展起来的一种技术，可以直接观察液体、半液体的样品，不需要对样品进行干燥处理，最大
程度地减少了常规的干燥过程对高度含水样品的影响。
冷冻蚀刻电子显微镜（ F r e e z e - e t c h i n g ）
冷冻电镜单颗粒三维重构算法
1981年，Joachim Frank（约阿希姆·弗兰克）完成了单颗粒三维重 构算法及软件Spider，利用计算机识别图像把相同蛋白质的不同影子收集 起来，并且将轮廓相似的图像进行分类对比，通过分析不同的重复模式 将图片拟合成更加清晰的2D图像。在此基础上，通过数学方法，在同一 种蛋白质的不同2D图像之间建立联系，以此为基础拟合出3D结构图像。 单颗粒三维重构算法对于实现无需结晶的蛋白质三维结构解析至关重要， 弗兰克的图形拟合程序被认为是冷冻电镜发展的基石。
形成冰晶体的玻璃态冰包埋样品
2013
冷冻电镜三维重构技术确 定蛋白质TRPV1结构，标 志着冷冻电镜跨入“原子
分辨率”时代
1974
Robert Glaeser首次提出并进行 了冷冻含水生物样品的电镜成像。
1981
Joachim Frank完成了单颗粒 三维重构算法及软件Spider。
1990 Ric年hard Henderson利用冷冻电镜技术获得了细菌视紫红质
蛋白原子水平的三维结构模型，第一个用冷冻电镜解析出来的 膜蛋白结构。
冷冻电镜技术的发展 2
细菌视紫红质3D结构
1975年，Richard Henderson（理查德·亨德森）利用电子显微三 维重构技术首次获得7埃分辨率的细菌视紫红质3D结构的历史性突破。 这是人们首次观测到膜蛋白的跨膜螺旋三维结构。
冷冻扫描电镜技术一般是在普通扫描电镜上加装低温冷冻传输系统和冷冻样品台装置，它是在扫描电镜 的基础上发展起来的一种技术，可以直接观察液体、半液体的样品，不需要对样品进行干燥处理，最大
程度地减少了常规的干燥过程对高度含水样品的影响。
冷冻蚀刻电子显微镜（ F r e e z e - e t c h i n g ）
冷冻电镜单颗粒三维重构算法
1981年，Joachim Frank（约阿希姆·弗兰克）完成了单颗粒三维重 构算法及软件Spider，利用计算机识别图像把相同蛋白质的不同影子收集 起来，并且将轮廓相似的图像进行分类对比，通过分析不同的重复模式 将图片拟合成更加清晰的2D图像。在此基础上，通过数学方法，在同一 种蛋白质的不同2D图像之间建立联系，以此为基础拟合出3D结构图像。 单颗粒三维重构算法对于实现无需结晶的蛋白质三维结构解析至关重要， 弗兰克的图形拟合程序被认为是冷冻电镜发展的基石。
形成冰晶体的玻璃态冰包埋样品
2013
冷冻电镜三维重构技术确 定蛋白质TRPV1结构，标 志着冷冻电镜跨入“原子
分辨率”时代
1974
Robert Glaeser首次提出并进行 了冷冻含水生物样品的电镜成像。
1981
Joachim Frank完成了单颗粒 三维重构算法及软件Spider。
1990 Ric年hard Henderson利用冷冻电镜技术获得了细菌视紫红质
蛋白原子水平的三维结构模型，第一个用冷冻电镜解析出来的 膜蛋白结构。
冷冻电镜技术的发展 2
细菌视紫红质3D结构
1975年，Richard Henderson（理查德·亨德森）利用电子显微三 维重构技术首次获得7埃分辨率的细菌视紫红质3D结构的历史性突破。 这是人们首次观测到膜蛋白的跨膜螺旋三维结构。
冷冻电镜的原理构造应用
冷冻电镜的原理构造应用1. 冷冻电镜的原理冷冻电镜（Cryo-electron microscopy）是一种利用电子束照射样本并通过电子透射来观察样本结构的技术。
它与传统电子显微镜的不同之处在于，对样本进行冷冻固化，以保持样本在自然状态下的结构，并使用低温下的电子束进行观察。
冷冻电镜的原理主要包括以下几个步骤：•冷冻固化：将样本冷冻至非常低的温度，通常是液氮温度以下。
冷冻可以防止样本的结构发生变化，保持样本在自然状态下的形态。
•薄片制备：将冷冻的样本切割成非常薄的薄片，一般在50至300纳米之间。
薄片的制备需要使用特殊的设备和技术，以保证薄片的质量和结构的完整性。
•电子透射：将冷冻薄片放置在电子束的路径上，使用电子束透射来观察样本的结构。
冷冻电子镜使用的电子束具有较高的能量和较高的分辨率，可以观察到样本的细节结构。
•图像重建：通过观察和记录电子透射过程中的图像，使用计算机算法对图像进行重建，以获得样本的三维结构信息。
2. 冷冻电镜的构造冷冻电镜主要由以下几个部分构成：•电子光学系统：冷冻电镜的光学系统主要由电子束发射源、透镜系统和探测器组成。
电子束发射源是产生高能电子束的装置，透镜系统用于对电子束进行聚焦和调节，探测器用于捕捉电子透射过程中的图像。
•样本处理系统：样本处理系统主要包括冷冻装置、样本制备设备和样本加载装置。
冷冻装置用于将样本冷冻至低温，样本制备设备用于制备薄片，样本加载装置用于将样本加载到电子束的路径上。
•图像记录和处理系统：图像记录和处理系统包括图像记录设备和图像处理软件。
图像记录设备用于记录电子透射过程中的图像，图像处理软件用于对图像进行重建和分析。
3. 冷冻电镜的应用冷冻电镜在生物科学和材料科学等领域有着广泛的应用。
具体应用包括但不限于以下几个方面：•生物医学研究：冷冻电镜可以用于观察生物分子、细胞器和生物大分子的结构，帮助科学家研究疾病的发生机制和药物的作用机制。
•材料科学研究：冷冻电镜可以用于观察材料的微观结构，包括纳米材料、催化剂和晶体等。
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电子显微镜
1、为什么不使用光学显微镜？
光学显微镜利用的是光子的波动性，而光子的波长大概在500纳米左右。 蛋白质分子大小在1-100nm之间，所以光子的波长比蛋白质分子还要大，因此 光波能绕过蛋白质分子，也就看不到蛋白质了。
2、电子显微镜的原理？
电子的波长是光子波长的十万分之一左右，是一根极细的探针，理论上它 打在蛋白质分子这类生物大分子身上能被反射，这些反射的电子就能产生一张 照片，电子显微镜相当于是用电子替代光线来照射物体，由于电子的波长远低 于光波，它能够看到非常小尺度的结构。
诺贝尔奖官方称为“使得生物化学进入一个新时代”
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6
冷冻电镜产生背景
上世纪50年代，利用X射线成像技术解析蛋白质结构，人们 才首次得以拍出蛋白质晶体的螺旋状结构图片。
X射线晶体学是最早用于结构解析的实验方法之一。其中关 键步骤之一即是，为获得可供X射线衍射的单晶，需要将纯 化后的生物样品进行晶体生长。现实情况却是，目前很多 复杂的大分子物质难以获得晶体。
彼得阿格雷(美)和罗德里克麦金农(美)对细胞 膜中的水通道的发现以及对离子通道的研究， 共同分享了2003年的诺贝尔化学奖。
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8
上世纪80年代初，核磁共振成像技术问世，人们得以对溶液中 和固态的蛋白质进行成像研究，不仅进一步认识了蛋白质的结 构，更获得了蛋白质如何运动及与其他分子相互作用的基本了 解。
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冷冻电镜技术获2017诺贝尔化学奖
2017年10月4日下午5点45分许，诺贝尔奖评委会主席格荣·汉森 （Goran Hansson）宣布，因发明用于生物分子的高分辨率结构测 定的冷冻电子显微镜（cryo-electron microscopy），瑞士洛桑大 学的雅克·杜波切特（Jacques Dubochet）、美国哥伦比亚大学的 乔基姆·弗兰克（Joachim Frank）和英国剑桥大学的理查德·亨 德森（Richard Henderson）获得2017年度诺贝尔化学奖。
•
第三个问题则更加严重，因为蛋白质分子这类生物大分子是有活性的，它
们是运动的，电子打上去反射回来的方向会因为分子的运动而变得杂乱无章。
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冷冻电镜的诞生
1975年，亨德森利用电子显微镜的方法，发表出来第一个非常粗糙的视 紫红质蛋白结构，图片上可以看出七个跨膜蛋白链。证明了电子显微镜 在生物领域的适用性。这也是历史上第一张膜蛋白领域的三维结构。
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• 3、电子显微镜观测蛋白质分子有活性的生物大分子遇到的问题？
• 第一个问题是真空问题，电子显微镜的电子只能在真空中飞行的时候才能 保持稳定的动能。而蛋白质这类生物大分子一般处于溶液中，在真空环境下， 溶液会挥发出来，污染电子显微镜。液态水在电子显微镜的真空管里蒸发，会 使得生物大分子瓦解。
• 第二个问题是电子打在蛋白质这类生物大分子上容易把蛋白质打坏了，因 为电子的能量比较高，而生物大分子一般依靠氢键来形成它的空间结构，氢键 的能量很低，电子打上去以后，氢键就被打断了。
冷冻电镜的发明及其在生物学的应用
报告人：XXX
1
冷冻电镜是什么？
冷冻电子显微镜技术（cryo-
electron microscopy） 简称
冷冻电镜：应用冷冻固定技术，低
温下使用透射电子显微镜观察样品的 显微技术，从而得到生物大分子的结 构。
2
我们或许在不久的将来就能获得生命复杂 机制的原子级分辨率的图片了
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1981年，弗兰克完成了单颗粒三维重构算 法及软件Spider，利用计算机识别图像把 相同蛋白质的不同影子收集起来，并且将 轮廓相似的图像进行分类对比，通过分析 不同的重复模式将图片拟合成更加清晰的 2D图像。在此基础上，通过数学方法，在 同一种蛋白质的不同2D图像之间建立联系， 以此为基础拟合出3D结构图像。弗兰克的 图形拟合程序被认为是冷冻电镜发展的基 础。
亨德森所发展出来的方法也具有其局限性，这是因为他所研究的蛋白 本身的特性让研究者能够采用所谓“冷冻电子断层成像术”来测定其 结构。简单来说，研究人员要转动细胞膜，从不同角度对蛋白拍照， 最终构建出蛋白的三维结构。这种方法只适用于排列有一定规律的蛋 白——如果它们是杂乱无章的，这种方法就难以奏效了。
1982年，迪波什开发出真正成熟可用的快 速投入冷冻制样技术制作不形成冰晶体的玻 璃态冰包埋样品。
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在1990年，理查德·亨德森成功地使用电子显 微镜拍摄到原子级分辨率的蛋白质三维图像， 并提出了实现原子级分辨率冷冻电镜技术的 可行性理论。
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被认为比晶体结构更能够描述生物大分子在细胞内的真实结构，并且能获得氢原 子的结构位置。缺点则在于蛋白质在溶液中往往结构不稳定而难得获取稳定的信 号。
10
X射线晶体学法和核磁共振技术均对蛋白质的 纯度、结晶性和绝对量有较高的要求，使得图 像分辨率难以提升，更是无法获得蛋白质结构 的动态变化。
因此，无论是X射线晶体学成像还是核磁共振， 都不能让研究者获得高分辨率的大型蛋白复合 体结构，生物结构学领域的发展也因此受困于成功将水玻璃态化，他将水快速冷却，在生物 样本周围以液态形式固化，使生物分子即使在真空中也能维持天然形态。
雅克·杜伯切特（Jacques Dubochet）的重要贡献则是在真空环境下使生物分 子保持自然形状。
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一般情况下，通过氢键的相互作用，水分子 会在凝固过程中形成有序排列，形成晶体。 而迪波什想到的即是在水分子相互作用之前 就让其凝固，将生物样品浸入事先经液氮冷 却的乙烷中，就能使水迅速冷却、在数毫秒 之内完全凝固，这种方式得到的就不是晶体 而是无定形态，而玻璃也是处于无定形态， 玻璃化名称由此而来。生物样品嵌在无定形 冰中，堪称留下了真实的一瞬间。
细菌视紫红质较为粗糙 的三维立体结构图像
14
亨德森将未脱离细胞膜的细菌视紫红质直接放置在电子显微镜下进行 观察，借助表面覆盖的葡萄糖防止真空干涸，并采用强度更低的电 子束流，得出细菌视紫红质在细胞膜上是规整排列且朝向一致。之后， 在前述Aron Klug等人提出的三维重构技术的基础上，亨德森和同事 获得了细菌视紫红质较为粗糙的三维立体结构图像。
电子显微镜
1、为什么不使用光学显微镜？
光学显微镜利用的是光子的波动性，而光子的波长大概在500纳米左右。 蛋白质分子大小在1-100nm之间，所以光子的波长比蛋白质分子还要大，因此 光波能绕过蛋白质分子，也就看不到蛋白质了。
2、电子显微镜的原理？
电子的波长是光子波长的十万分之一左右，是一根极细的探针，理论上它 打在蛋白质分子这类生物大分子身上能被反射，这些反射的电子就能产生一张 照片，电子显微镜相当于是用电子替代光线来照射物体，由于电子的波长远低 于光波，它能够看到非常小尺度的结构。
诺贝尔奖官方称为“使得生物化学进入一个新时代”
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冷冻电镜产生背景
上世纪50年代，利用X射线成像技术解析蛋白质结构，人们 才首次得以拍出蛋白质晶体的螺旋状结构图片。
X射线晶体学是最早用于结构解析的实验方法之一。其中关 键步骤之一即是，为获得可供X射线衍射的单晶，需要将纯 化后的生物样品进行晶体生长。现实情况却是，目前很多 复杂的大分子物质难以获得晶体。
彼得阿格雷(美)和罗德里克麦金农(美)对细胞 膜中的水通道的发现以及对离子通道的研究， 共同分享了2003年的诺贝尔化学奖。
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上世纪80年代初，核磁共振成像技术问世，人们得以对溶液中 和固态的蛋白质进行成像研究，不仅进一步认识了蛋白质的结 构，更获得了蛋白质如何运动及与其他分子相互作用的基本了 解。
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冷冻电镜技术获2017诺贝尔化学奖
2017年10月4日下午5点45分许，诺贝尔奖评委会主席格荣·汉森 （Goran Hansson）宣布，因发明用于生物分子的高分辨率结构测 定的冷冻电子显微镜（cryo-electron microscopy），瑞士洛桑大 学的雅克·杜波切特（Jacques Dubochet）、美国哥伦比亚大学的 乔基姆·弗兰克（Joachim Frank）和英国剑桥大学的理查德·亨 德森（Richard Henderson）获得2017年度诺贝尔化学奖。
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第三个问题则更加严重，因为蛋白质分子这类生物大分子是有活性的，它
们是运动的，电子打上去反射回来的方向会因为分子的运动而变得杂乱无章。
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冷冻电镜的诞生
1975年，亨德森利用电子显微镜的方法，发表出来第一个非常粗糙的视 紫红质蛋白结构，图片上可以看出七个跨膜蛋白链。证明了电子显微镜 在生物领域的适用性。这也是历史上第一张膜蛋白领域的三维结构。
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• 3、电子显微镜观测蛋白质分子有活性的生物大分子遇到的问题？
• 第一个问题是真空问题，电子显微镜的电子只能在真空中飞行的时候才能 保持稳定的动能。而蛋白质这类生物大分子一般处于溶液中，在真空环境下， 溶液会挥发出来，污染电子显微镜。液态水在电子显微镜的真空管里蒸发，会 使得生物大分子瓦解。
• 第二个问题是电子打在蛋白质这类生物大分子上容易把蛋白质打坏了，因 为电子的能量比较高，而生物大分子一般依靠氢键来形成它的空间结构，氢键 的能量很低，电子打上去以后，氢键就被打断了。
冷冻电镜的发明及其在生物学的应用
报告人：XXX
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冷冻电镜是什么？
冷冻电子显微镜技术（cryo-
electron microscopy） 简称
冷冻电镜：应用冷冻固定技术，低
温下使用透射电子显微镜观察样品的 显微技术，从而得到生物大分子的结 构。
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我们或许在不久的将来就能获得生命复杂 机制的原子级分辨率的图片了
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1981年，弗兰克完成了单颗粒三维重构算 法及软件Spider，利用计算机识别图像把 相同蛋白质的不同影子收集起来，并且将 轮廓相似的图像进行分类对比，通过分析 不同的重复模式将图片拟合成更加清晰的 2D图像。在此基础上，通过数学方法，在 同一种蛋白质的不同2D图像之间建立联系， 以此为基础拟合出3D结构图像。弗兰克的 图形拟合程序被认为是冷冻电镜发展的基 础。
亨德森所发展出来的方法也具有其局限性，这是因为他所研究的蛋白 本身的特性让研究者能够采用所谓“冷冻电子断层成像术”来测定其 结构。简单来说，研究人员要转动细胞膜，从不同角度对蛋白拍照， 最终构建出蛋白的三维结构。这种方法只适用于排列有一定规律的蛋 白——如果它们是杂乱无章的，这种方法就难以奏效了。
1982年，迪波什开发出真正成熟可用的快 速投入冷冻制样技术制作不形成冰晶体的玻 璃态冰包埋样品。
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在1990年，理查德·亨德森成功地使用电子显 微镜拍摄到原子级分辨率的蛋白质三维图像， 并提出了实现原子级分辨率冷冻电镜技术的 可行性理论。
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被认为比晶体结构更能够描述生物大分子在细胞内的真实结构，并且能获得氢原 子的结构位置。缺点则在于蛋白质在溶液中往往结构不稳定而难得获取稳定的信 号。
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X射线晶体学法和核磁共振技术均对蛋白质的 纯度、结晶性和绝对量有较高的要求，使得图 像分辨率难以提升，更是无法获得蛋白质结构 的动态变化。
因此，无论是X射线晶体学成像还是核磁共振， 都不能让研究者获得高分辨率的大型蛋白复合 体结构，生物结构学领域的发展也因此受困于成功将水玻璃态化，他将水快速冷却，在生物 样本周围以液态形式固化，使生物分子即使在真空中也能维持天然形态。
雅克·杜伯切特（Jacques Dubochet）的重要贡献则是在真空环境下使生物分 子保持自然形状。
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一般情况下，通过氢键的相互作用，水分子 会在凝固过程中形成有序排列，形成晶体。 而迪波什想到的即是在水分子相互作用之前 就让其凝固，将生物样品浸入事先经液氮冷 却的乙烷中，就能使水迅速冷却、在数毫秒 之内完全凝固，这种方式得到的就不是晶体 而是无定形态，而玻璃也是处于无定形态， 玻璃化名称由此而来。生物样品嵌在无定形 冰中，堪称留下了真实的一瞬间。
细菌视紫红质较为粗糙 的三维立体结构图像
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亨德森将未脱离细胞膜的细菌视紫红质直接放置在电子显微镜下进行 观察，借助表面覆盖的葡萄糖防止真空干涸，并采用强度更低的电 子束流，得出细菌视紫红质在细胞膜上是规整排列且朝向一致。之后， 在前述Aron Klug等人提出的三维重构技术的基础上，亨德森和同事 获得了细菌视紫红质较为粗糙的三维立体结构图像。