GUS染色方法

GUS染色

一.试剂配置：

PBS：100mM磷酸盐缓冲液

A液：3.582g Na2HPO4·12H2O溶解于无菌蒸馏水，定容至10ml；

B液：1.56g NaH2PO4·2H2O溶解于无菌蒸馏水，定容至10ml；

取5.77ml A试剂、4.23ml B试剂混合，无菌蒸馏水定容至100ml；

50mL staining buffer：

取40ml PBS，依次加入试剂：

EDTA（终浓度10mM），

六氰合铁(II)酸钾（终浓度0.5mM），

六氰合铁(III)酸钾（终浓度0.5mM）（加入铁盐的目的：防止无色反应中间产物渗漏）

用PBS定容至50ml，加入1% Trrton-X 100，避光保存；

GUS染液：

用EP管称取适量X-gluc粉末，加入少量DMSO或N,N-二甲基甲酰胺助溶（一般溶解10mg 粉末约10~20ul二甲基甲酰胺），然后用staining buffer配成终浓度为1 mg/ml的GUS染液，避光保存；

固定液：

无水乙醇：冰醋酸=9：1

透明液：

30 ml H2O

80 g 水合氯醛

10 ml 甘油

搅拌约1小时，使之充分溶解

二．GUS染色步骤

1．取材（避免夹伤）；

2．PBS漂洗3次；

3．加入染色液，37℃避光反应（Col-0 3天黄化苗经染色约2小时，在根的上半部就会有明显蓝色出现）；

4．回收染液；

5．PBS漂洗3次；

6．固定液室温固定2~4小时，或者过夜；

7．95%乙醇（目的是使用接近固定液浓度的乙醇）漂洗数次至脱掉色素（室温或者37℃均可）；

8．70%乙醇漂洗（目的是让材料在接近生理浓度时恢复形状）；

9．透明液室温透明15’，或者过夜（推荐1~24h）；

10．临时压片观察，照相。

注明：阴影字为快捷操作步骤，另外绿苗在此操作基础上需要进行脱色／透明操作，快捷步骤为100%乙醇、37℃漂洗数次至脱掉绿色。

三. GUS染色步骤：

1.取材：将叶片、花瓣、根茎等组织剪成小片，放于1.5ml离心管中。

注：用于染色的植物材料的制备方法要因涉及的特定组织和器官的不同而异。例如，拟南芥的根、花和叶片以及烟草幼苗的根就可以不作任何预处理而直接染色。但是像烟草和马铃薯这些植物的茎和叶就必须在染色前切成薄片（1-3mm）。当操作大的组织和样品时，可以选用真空渗入法来帮助底物渗入细胞。

2.染色：加入适量配制好的GUS染色工作液至完全覆盖材料；锡箔纸包好后摇床摇动10分钟或更长时间至材料出现蓝色。注意要做阴性和阳性对照实验。

3.洗脱：将材料转入无水乙醇或80%丙酮中脱色2-3次，至阴性对照材料为白色。GUS染色阳性的蓝色斑点很稳定，在酒精中不褪色。

4.观察：一般染色后，GUS染色阳性的蓝色斑点肉眼就能看到。但是有些材料可能蓝色斑点很细微，要在显微镜下才能看到。