转基因植物的检测与鉴定

收稿日期:2006-09-28转基因植物的检测与鉴定宫雪超,于丽杰,高金秋(哈尔滨师范大学环境与生命科学院,黑龙江哈尔滨150025)摘要:对植物转基因过程中报告基因的种类和应用范围、转基因植物的检测和鉴定方法、转基因植物检测和鉴定方法的评价进行了综述.关键词:转基因植物;检测;鉴定;评价[中图分类法]Q943[文献标识码]A[文章编号]1003-6180(2007)01-0015-03植物转基因实验因受体系统的限制,外源基因的转化频率较低,为了达到转化目的,必然要获得大量的转化材料,如何在数以千万计的转化植株或细胞中,快速、有效地检测出转基因阳性植株或细胞,外源基因是否整合到植物染色体上,整合的方式如何,整合到染色体上的外源基因是否正确表达等问题,就成为重要的研究课题.根据外源基因表达的不同水平,对外源基因的检测和鉴定可以分为三个水平进行:整合水平、转录水平和翻译水平.本文从外源基因表达的不同水平,阐述转基因植物的检测与鉴定.1外源基因整合水平的鉴定检测外源基因是否转化成功,首先是对报告基因进行检测,必要时再进行目的基因的检测,检测目的基因需要采用分子杂交方法.1.1报告基因报告基因必须具有两大特点:一是表达产物和产物的类似功能在未转化的植物细胞内并不存在;二是便于检测.目前植物基因工程中使用的报告基因一般是编码酶的基因.大致分为两类:抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因.现在常用的报告基因主要有:gus基因、cat基因、冠瘿碱合成酶基因、np tÒ基因、gf p基因、bar 基因[1]、荧光素酶基因、二氢叶酸还原酶基因等.近年来,绿色荧光蛋白基因作为一种新型的报告基因在植物基因转化及基因表达调控中得到应用,并显示出较其他几个报告基因更大的优越性.gf p基因的检测gf p基因具有以下优点:¹适用于各种生物的基因转化;º检测方法简便,无需底物、酶、辅因子等物质,只要有紫外光或蓝光照射,其表达产物就可以发出绿色荧光,这对转化细胞的检测极为有利;»便于活体检测,十分有利于活体内基因表达调控的研究;¼检测时可获得直观信息,有利于转基因植物安全性问题的研究及防范.若此报告基因通过自然杂交扩散到其他栽培植物或杂草中时,很容易通过光照获得直观信息.gus基因的检测g us基因也是广泛用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因,尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化试验中,gus基因应用的最多.gus基因3-端与其他结构形成的融合基因能正常表达,所产生的融合蛋白仍具有gus活性,这为研究外源基因表达的具体细胞部位及组织部位提供了条件,这是它的一大优点.但是需要注意的是,有一些植物在胚胎状态时能产生内源gus活性,Sory u[2]在转基因R0和R1代的子叶、花粉和胚珠中检测到g us活性,随着组织的成熟衰老,g us表达逐渐停止.在实验过程中要设定严格的阴性对照.g us活性的检测方法有很多,包括组织化学法、色谱法、荧光法等,其中植物切片gus 组织化学定位分析是分辨组织中不同细胞个体和不同的细胞类型基因表达差异的一种有效方法.1.2转基因植株的PCR检测PCR(聚合酶链式反应poly merase chain re-actio n)是首选的转基因产品检测方法.PCR技术能够有效地扩增低拷贝的靶片段DNA,可以检测到每克样品含有20pg~10ng的转化基因成分,对转基因产品大分子量DNA检测的灵敏度可以达到样品含量的0.0001%[3].因为PCR的高度特异性及检测所需的模板量仅为10ng以内,所以为外源基因整合的检测提供了便利条件,尤其是在转化材料少又需及早检测的时候.现在已经利用该技术对欧美杨[4]、番茄[5]、辣椒、葡萄、豆瓣菜、小麦[6]等转基因植物进行鉴定,是转基因植物鉴定中最简单、最常用的方法[7].PCR检测具有DNA用量少,操作简单,成本低,耗时少,不需要同位素等优点,但PCR检测也存在缺点,由于PCR扩增十分灵敏,有时会出现假阳性扩增,因此检测只能作为初步结果.1.3Southern杂交证明外源基因在植物染色体上整合情况的最可靠方法是DNA So uther n杂交,只有经过分子杂交鉴定为阳性的植株才可以称为转基因植物.#15#利用Southern杂交,可以确定外源基因在植物中的组织结构和整合位置、拷贝数以及转基因植株F1世代外源基因的稳定性[8].分子杂交是进行核酸序列分析、重组子鉴定及检测外源基因整合表达的强有力手段,它具有灵敏性高、特异性强的特点,是当前鉴定外源基因整合及表达的权威方法. Southern杂交可以清除操作过程中的污染以及转化愈伤组织中质粒残留所引起的假阳性信号,准确度高,但Southern杂交程序复杂,成本高,且对实验技术条件要求较高.根据杂交时所用的方法,核酸分子杂交又可分为印迹杂交(blo t)、斑点(do t)杂交或狭缝(slot)杂交和细胞原位(in situ)杂交等.现在已在水稻[9]、玉米、大白菜[10]、豆瓣菜[11]、马铃薯、杏、烟草等植物中得到广泛应用. 2外源基因转录水平的鉴定转录水平上的检测方法主要就是No rthern 杂交,它以RNA和探针杂交的技术检测基因在转录水平上的表达.2.1Northern杂交Northern杂交和Southern杂交相比,更接近性状表现,更具有现实意义,被广泛用于转基因植物的检测[12,13],现已用于杨树、豆瓣菜、马铃薯、草莓、烟草等转基因植物的检测中.但RNA 提取条件严格,在材料内含量不如DNA高,不适于大批量样品的检测.2.2RT-PCR检测RT-PCR(rev erse transcribed PCR)也是检测外源DNA在植物体内转录表达的一种方法.如果从细胞总RNA提取物中得到特异的cDNA 扩增条带,则表明外源基因实现了转录.此法简单、快速,但对外源基因转录的最后决定,还需与Northern杂交的实验结果结合.3外源基因表达蛋白的检测外源基因编码的蛋白在转基因植物中能够正常表达并表现出应有的功能是植物基因工程的最终目的.3.1Western杂交Western杂交是集蛋白质电泳、印迹和免疫测定为一体的检测方法.它具有很高的灵敏性,可以从植物细胞总蛋白中检出50ng的特异蛋白质,若是提纯的蛋白质,可检出1~5ng.Western 杂交检测目的基因在翻译水平的表达结果,可得知被检植物细胞内目的蛋白是否表达、表达的浓度大小及大致的分子量.能直接显示目的基因在转化体中是否经过转录、翻译最终合成蛋白而影响植株的性状表现.一般来讲,Wester n杂交的结果与性状表现有直接关系[9,13].3.2ELISA检测ELISA(酶联免疫吸附法enzy me-linked im-m uno sor bent assay)是一种利用免疫学原理检测抗原、抗体的技术.由于酶的放大作用,使测定的灵敏度极高,可检测出1pg的目的物,同时酶反应还具有很强的特异性.除了可溶性抗原(抗体)之外,ELISA还可以检测含表面抗原的细胞.该方法已用于辣椒、水稻、烟草、番茄[14,15]等转化植株的鉴定工作中.ELISA的检测虽然很灵敏,但容易出现本底过高的问题,应予以充分的注意.3.3蛋白检测试纸蛋白检测试纸是一种基于ELISA的改进方法Q uick Stix Strip或者Lateral Flow strip,用于转基因植物表达量的检测[16].先将特异性抗体吸附在膜上,将膜蘸入样品溶液,蛋白质随着液相扩散,遇到抗体,发生抗原-抗体反应,通过阴性对照筛选阳性结果,给出转基因成分含量的大致范围.此方法操作简单,费用低,耗时少(5~10m in).4原位杂交检测原位杂交技术目前在植物基因工程研究中已成为外源基因在染色体上整合定位及在组织细胞内表达定位的主要方法.原位杂交技术主要有同位素原位杂交和荧光原位杂交(FISH),使用放射性同位素标记,放射自显影检出.该方法灵敏性强,对于单拷贝的DNA序列检出非常有效.原位杂交可以分为三个层次:¹染色体DNA 原位杂交,可以确定外源基因在染色体上的整合位置及整合方式,还可以研究外源基因的整合方式对外源基因遗传稳定性、外源基因表达的影响,以及不同的转化方式与外源基因整合方式的关系等重大机理问题;º组织细胞mRNA原位杂交,对特定的基因表达的m RNA进行组织细胞分布的空间定位,获得外源基因在植物组织细胞内表达情况(是否表达,表达位置,表达量等);»外源基因表达蛋白的组织细胞免疫定位,指利用外源基因表达蛋白的抗体,通过免疫反应确定表达蛋白在转基因植物组织及细胞中的分布.该方法也是研究转基因植物中外源基因功能、外源蛋白稳定性及功能蛋白含量的重要手段.5检测方法的评估用DNA提取方法对目的基因进行检测方法简便,适合大批量样品的分析,又能检测目的基因的完整性,是早期检测的较好方法[17].Southern、N orthern、Western杂交分别从整合、转录、翻译水平检测外源基因,是检测外源基因最经典、最可靠的方法.虽然现在出现了一些像PCR-Southern、RT-PCR-Northern等功能类似、方便快捷的检测技术,然而由于其技术本身的原因,还不能取代以上技术在转基因植物检测和鉴# 16 #定上的权威地位.随着科学技术的发展,各种新的检测方法也在不断涌现,例如生物传感器筛选法、远红外线光谱法、定量PCR 、实时PCR 、基因芯片等.每种检测方法都有其自身的优点和不足,应该根据不同的检测目的和要求,选择合适的方法.在实际工作中把几种方法结合运用,可获得外源基因不同表达水平的信息,是准确检测转基因植物产品的合理策略.参考文献[1]Datta S.K.,A.Petew hans,K.Datta,e t,al.H erbicide -res istan ce rice plan ts from IRRI breedin g lin e IR72after PEG -mediated trans -form ation of protoplasts[J].Plant.M ol.Biol.1992,20:619.[2]S oryu ,N.Transformation of cucu mber plant usin g Agrobaeteriu m tarme faciens and regen eratinon from hypoceotyl exolants[J].PlantCell Report,1996,15:809-814.[3]Bryant J.,S.Leather.Rem oveal of selectable marker genes from transgenic plant:needless sophis tication or social neces sity[J ].Trends in Biotechn ology,1992,10:274-275.[4]王学聘,卞祖娴,张晋华,等.欧美杨转基因植物的PCR 检测[J ].林业科学.1997,33(4):380-384.[5]M organ A.J.,P.N.Cox ,D.A.T urner,et ,al .Transformation of tomoto u sing an R-i plas mid 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要:研究了无基质喷雾栽培法生产马铃薯脱毒小薯过程中不同品种、不同苗来源及不同收获方式对块茎产量的影响,结果表明:无基质喷雾栽培法生产马铃薯小薯以扦插苗分期收获效果最佳.无基质喷雾栽培比较适合栽培早熟品种,以早大白最佳.关键词:无基质;马铃薯;脱毒小薯[中图分类法]S532 [文献标识码]A [文章编号]1003-6180(2007)01-0017-02在马铃薯良种繁育体系中,原种的生产是关键环节,其质量的高低和数量的多少直接影响马铃薯的生产.无基质喷雾栽培法是一种极有前途的核心种薯生产方法,其主要技术是将适于马铃薯不同发育时期的营养液适时适量地喷于保持在黑暗状态下的马铃薯植株根际,使马铃薯根际获得充分的养分,促进马铃薯块茎的生长.马铃薯喷雾栽培技术在我国尚属起步阶段,提高其生产效率是生产实践中亟待解决的问题.为此,本试验对无基质喷雾栽培法生产马铃薯脱毒小薯过程中不#17#。