免疫组化显色系统

一抗/HRP(U…)
显色剂 DAB或AEC(K3467或K0697) 素木精复染(S3309)
水漂洗
一步法EPOS
特点:
• 一抗孵育后直接显色 • 即用型试剂 • 快速(一步)完成 • 敏感性较差 • 昂贵 • 使用对象: • 要求快速出结果的免疫组化实验对象
二步法EnVision
• 原理: 在葡聚糖大分子上标记二抗及酶, 将传统 的二抗和三抗(酶)连接在一起,形成一个 复合物EnVision. 两步孵育完成免疫组 化.
EnVision/HRP( 1 Mo.) 蒸馏水冲洗
双染阻断剂(Kit含) EnVision/AP( 2 Rb.) 蒸馏水冲洗
TBS冲洗(S1968)
TBS冲洗(S1968) 苏木精复染(S3309)
显色剂 2Fast Read(K0597)
EnVision二步法双染
特点:
• 即用,方便,快速,省时. • 敏感性强. 背景低. • 在同一组织切片上, 用两种不同标记物标记两 种不同的抗原. 使用对象 • 需在同一张切片上标记两种抗原者 主要是形态学科研人员
EnVision二步法双染
原理: 与EnVision二步法原理相同, 只是为达 到在同一组织上标记两种抗原. 必需用两 种动物来源的一抗(常用抗小鼠和兔),分 别配相应的EnVision(二抗) , 再用两种 颜色的显色剂显色.
EnVision二步法双染
• 原理图
鼠一抗接抗原1 鼠EnV/HRP接抗鼠一抗 DAB(显色剂1)
TBS冲洗(S1968)
链亲和素/过氧化物酶 Strep./HRP(Kit含) 蒸馏水冲洗
显色剂DAB或AEC(Kit含)
苏木精复染(S3309)
催化放大系统CSA
(Catalyzed Signal Amplication System)
特点: • 敏感性极强 • 实验步骤较多 • 较贵
使用对象: • 需做免疫组化实验者, 特别适用于某些石蜡片不易 出结果的一抗.
动物研究试剂盒 ARK
(Animal Research Kit)
• 原理 在一抗与组织抗原反应之前: 小鼠一抗 F(c)与生物素化抗小鼠F(ab)片断结合, 再加入小鼠免疫球蛋白, 中和未被结合的 生物素化抗小鼠F(ab). 用该复合物再与 小鼠组织中特异抗原反应, 可降低非特异 性背景.
动物研究试剂盒 ARK
• 特点 小鼠一抗在小鼠组织切片上做免疫组化可 降低背景. • 使用对象 需用小鼠一抗做小鼠组织的免疫组化实 验者.
几种显色系统复杂与敏感性比较
目前最实用的显色系统
• EnVision System
• • • •
EnVision+ /Mo (K4000 K4001 GK400105) EnVision+/Rb (K4002 K4003 GK400305) EnVision Mo/Rb HRP (k1390 K1392 GK139305) EnVision Mo/Rb AP (K1396 k4016)
System)
• 动物研究试剂盒: ARK
(Animal Research Kit)
一步法EPOS
• 原理: 在一抗上通过多聚骨架标记过氧化物酶. 即一抗上已标记过氧化物酶. 这种一抗与 抗原结合后即可直接显色.
特异性一抗 多聚骨架分子
过氧化物酶 组织抗原
一步法EPOS
• 主要实验流程
组织片脱蜡,水化 阻断(S2001) TBS冲洗(S1968) TBS冲洗(S1968)
使用对象 可向所有做免疫组化的用户推荐.
催化放大系统CSA
(Catalyzed Signal Amplication System)
原理
在经典三步法免疫组化放大基础上,通过生物素 化酪胺的催化,将又一次加入的酶标记链亲和素 (Streptavidin-enzyme)与二抗中生物素亲和, 使已放大的分子再一次放大.
双染阻断剂
兔一抗接抗原2
兔EnV/AP接抗兔一抗
Fast Red(显色剂2)
EnVision二步法双染
• 主要实验流程
阻断内过氧化酶(S2001)
TBS冲洗(S1968)
一抗(1 Mo.)孵育 TBS冲洗(S1968)
TBS冲洗(S1968) 显色剂 1 DAB(K3467)
一抗(2 Rb.)孵育
动物研究试剂盒 ARK
(Animal Research Kit)
• 主要实验步骤
一抗与组织抗原反应之前需做试剂的预处理:
小鼠一抗 + 抗小鼠Ig的F(ab)/Bio
复合物 1 + 小鼠Ig
复合物 1
复合物 2 (已优化的一抗)
用复合物2作为一抗同LSAB三步法免疫组化染色
动物研究试剂盒 ARK
(Animal Research Kit)
(Animal Research Kit)
• 原理图
小鼠一抗 抗小鼠Ig 免疫复合物/Bio和游离 免疫复合物/Bio和游离 小鼠Ig 免疫复合物/Bio和被中 抗小鼠Ig F(ab)/Bio 和的抗小鼠Ig F(ab)/Bio 抗小鼠Ig F(ab)/Bio
F(ab)/Bio 与组织抗原结合按LSAB法继续免疫组化染色
二步法EnVision
• 原理图
一抗与抗原结合
EnVision二抗复合物与一抗结合
二步法EnVision
• 主要实验流程
阻断内过氧化酶(S2001)
TBS冲洗(S1968)
一抗孵育(Mo . Rb.)
TBS冲洗(S1968)
TBS冲洗(S1968)
EnVision(Mo.K4001 Rb.K4003)
二抗/生物素 (Mo.E354 Rb.E353) TBS冲洗(S1968)
链亲和素/HRP或AP
显色剂DAB或AEC(K3467或K0697) Fast Read(K0597或K0699)
蒸馏水冲洗
苏木精复染(S3309)
三步法 LSAB
(Labeled Streptavidin-biotin) 特点: • 便宜 • 有现成的兔, 鼠, 羊通用试剂盒 • 会有内源性生物素造成的非特异性背景
三步法 LSAB
(Labeled Streptavidin-biotin)
原理: 应用生物素标记二抗与过氧化物酶或碱性 磷酸酶标记链亲和素(Streptavidin)的 亲和作用, 连接一抗及抗原, 形成大分子. 再通过相应酶的底物(显色剂)作用使之显 色.
三步法 LSAB
(Labeled Streptavidin-biotin)
主要实验流程:
TBS冲洗(S1968) TBS冲洗(S1968)
阻断内过氧(S2001) 水洗 一抗孵育(Mo)
蛋白阻断剂(Kห้องสมุดไป่ตู้t含) 二抗孵育(Rb a-Mo/Bio) TBS冲洗(S1968)
TBS冲洗(S1968)
链亲和素/生物素 Strep./Bio (Kit含)
放大液(Kit含)
TBS冲洗(S1968)
显色剂DAB或AEC(K3467或K0697)
苏木精复染(S3309)
二步法EnVision
特点: 二抗及酶通过葡聚糖连成一个大分子试剂(避开了传统 的生物素与链亲和素结合), 不受内源性生物素干扰. • 即用,方便,快速(两步). • 敏感性强. 背景低. • 是目前最理想的免疫组化显色系统 • 使用对象 • 可向所有做免疫组化的用户推荐.
免疫组化原理图标注解
抗原2 一抗 1 过氧化物酶 碱性磷酸酶 一抗 2
双染阻断剂
显色剂(棕色)
抗兔二抗
显色剂(红色)
抗鼠二抗 葡聚糖骨架分子
组织抗原1
回顾过去
直接法
二步间接法
三步间接法
酶免疫复合物法
链亲和素-生物 素法(ABC)
目前常用的显色系统
• 一步法: EPOS ( Enhanced Polymer One-Step Staining) • 二步法: EnVision Systems • 双染: General Doublestain • 三步法: LSAB (Labeled Sstreptavidin-biotin) • 催化放大系统:CSA (Catalyzed Signal Amplication
原理图:
一抗与抗原结合
二抗/Bio与一抗结合
STPA/HRP(AP) 与二抗/Bio结合
三步法 LSAB
(Labeled Streptavidin-biotin) • 主要实验流程
阻断内过氧(S2001) TBS冲洗(S1968) 一抗孵育(Mo . Rb.)
TBS冲洗(S1968) TBS冲洗(S1968)
催化放大系统CSA
(Catalyzed Signal Amplication System)
• 原理图
一抗与抗原结合 二抗/Bio与一抗结合
STAV/Bio与 二抗/Bio结合
放大液催化
加入STAV/HRP 与Bio再结合
催化放大系统CSA
(Catalyzed Signal Amplication System)
免疫组化显色系统
Visualization Systems of Immunohistochemistry(IHC)
免疫组化技术原理
• 用标记物或显色物标记抗体或抗原 • 通过免疫学中的抗原与已知抗体反应来 检测组织或细胞内的抗原成分 • 免疫组化染色是一项综合性技术 • 组织材料的准备 • 免疫组化染色前处理 • 免疫组化染色(一抗, 显色系统)