hpv检测目的及最佳检测方法PPT课件

HPV检测的目的是什么？
2015年CFDA针对HPV检测试剂阳性判断值的规定：临床灵敏度特异度的Cutoff值
不再是单纯的病毒检测，而是强调“临床”，不再是制造商说了算，而是临
床说了算 阳性判断标准是要获得理想临床敏感度和特异度的临界值，制造商不能仅凭
简单的病毒检测数据来制定，建议使用ROC曲线的方式进行评估，这需要大 量临床检测数据才能最终找到理想的临界值
最强的致癌型别，几 个致癌位点已经明确 充足流行病学证据证 实会导致宫颈癌 缺乏宫颈癌流行病学 证据，但从致癌机制 上有强的证据支持
2009 WHO IARC Special Report Policy A review of human carcinogens Part B
HPV检测的目的是什么？
无法扩増)
PCR检测可能导致假阳性结果
检测与临床不相关的感染 样本间的污染
HPV检查的最佳方法
统一的判定标准
杂交捕获
经临床验证的同一判定标准1.0pg/ml 仪器判读、结果客观可靠
PCR
缺乏统一的判定标准 结果受主观因素影响
HPV检查的最佳方法
为何要明确“临床灵敏度和临床特异度的Cutoff值”？
短暂及一过性的感染会通过自身免疫力 清除
PCR 方法检测HPV的分析敏感度可能 <10 拷贝
Adapted from Snijders et al. Journal of Pathology 2003; 201:1-6
区别：分析敏感度与临床敏感度
分析敏感度
临床敏感度
样本中能检测出的病毒最低水平 也被称作检测极限 (LOD)
2015最新CFDA指导原则以服务临床为最终目的
2015年CFDA新的指导原则，从临床目的出发，精确注册标准要求
阳性判 断值
设定与临床 风险相关的 阳性判断标
准Cutoff
临床敏 感度、 特异度
以CIN2+为 临床终点的 敏感度和特
异度
临床适 应症
• 初筛 • 联合筛查 • ASCUS分
流
一项检测技术，要想满足以上要求，必须基于长时间大量的临床验证才能实现
2015 IPV Conference，Mark. Stoler
分HPV检查的最佳方法 析敏感度与临床敏感度
杂交捕获 HPV DNA检测为阴性时并 不代表体内没有HPV，表明样品中 HPV含量不足5000拷贝.
杂交捕获 HPV DNA检测为阳性时（ 高于以上标准）可以预测未来8-10 内患CIN2/3或者进展为更高级别病 变的风险
HPV检查的最佳方法
杂交捕获技术 （HPV检测的金标准）
产品
德国凯杰的：HC2 杭州德同的：DH2、DH3
17
HPV检查的最佳方法
杂交捕获技术 的三大优势：
1、独特的探针技术：14 种全长 8000RNA 探针，避免因 区域片段（如 L1 区）丢失造成的假阴性
2、无需DNA提取，无需核酸扩增，有效避免因环境因素造 成的假阳性
Capone et al, Clin Cancer Research 2000, 6:4171-4175
“~5%的癌症和CIN3会因为HPV L1片段的缺失而无法被检测出来”
Lorincz (Methods for HPV Detection) ; Emerging Issues on HPV Infections: From Science to Practice, Monsonego 2006
HPV
β-globin
β-globin
HPV
HPV
β-globin
β-globin
反应过程中的竞争会导致假阴性结果
PCR导致假阴性的原因
• 不同HPV型别扩增效率不同 • 如果L1片段缺失，检测失败 (整合型HPV) • 通用引物会和低危型HPV结合，抑制了目
标高危型别的扩增 • 内指控（Beta-globin）会抑制HPV扩增 • 样本抑制 (有5％的样品丢失因出现抑制而
2015年中国CFDA明确HPV检测型范围
宫颈癌相关检测必须包 含13种高危HPV型别
• 高危型13种：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、 52、56、58、59、68
• 若可检测的HPV基因型别不能涵盖上述13种高危型，则 可能造成阴性预期值无法达到临床要求，因此不能用于 宫颈癌筛查。-------不能少！！！
阳性判断值（Cutoff）的设定，在2013年的WHO宫颈癌筛查和管理 指南中是有具体建议的，其推荐高危型HPV 检测cut-off 值≥1.0 pg/ml
HPV检测的目的是什么？
WHO guidelines for screening and treatment of precancerous lesions for cervical cancer prevention. © World Health Organization 2013 6
另外最多可包含5种不确 定风险的HPV型别
• 可包含不确定其风险的“中等风险型”5种：HPV26、 53、66、73、82
HPV检测型别太少的产品如只检测5种型别、2种型别（如HPV16/18）等，将 不能再注册
HPV检测的目的是什么？
中国CFDA明确限制低危型HPV检测
不能盲目的追求过多的HPV检测型别 不建议将低危型HPV检测用于宫颈癌筛查
Studies sorted by year
CKausSFStlcaBaeehHsellrGmnliCrlunAsKiePealagnegdajceirhgsardaavcctuooeeemXirmeieannsoryril 000000000000223131123303
SchRWiafftrmnigaahmnt
统计学意义：检测结果与零的区分
以临床病变为终点指征，检测出高度病变的敏 感度 (CIN3+ / SCC) 初筛时，能够检测出CIN2＋或宫颈癌的比例 分析阈值必须得到严格的验证
PCR 方法的分析敏感度达到 10个拷贝/ml
阳性结果：可能没有临床相关性
杂交捕获的分析阈值经临床验证为 5,000 个拷贝/ml
HPV DNA检测技术分类
直接核酸检测（无需PCR实验室） • 杂交捕获技术 （HC2、DH1、DH2、DH3） • 酶切信号放大法 （Cervista） 核酸扩增后检测——PCR类技术（需PCR实验室） • 膜杂交法 • 基因芯片法 • 反向点杂交法 • 流式荧光杂交法 • 荧光探针法
HPV检查的最佳方法
HPV18
HPV16
12种HR 通用探针
约200bp，仅基于L1片断， 非全长
仅3种探针混合 病毒基因缺失、突变会造
成漏诊
其他其国他产国PC产RP方C法R“方寡法核苷“酸寡探核针苷”酸技探术 针”技术
13种HR 通用探针
约100-150bp，仅基于L1 片断，
非全长 仅1种通用探针 病毒基因缺失、突变会造
HPV检测的目的是什么？
2015年欧洲IPV大会：宫颈癌筛查HPV检测目的
HPV检测不是为了检测病毒，不是一过性感染，而是检测感染病毒后的进展风险 HPV检测需要关注临床敏感度，最大化的保护低风险人群，最大化的辨别高风险人群
2015 IPV Conference，Mark. Stoler
HPV检测的目的是什么？wenku.baidu.com2016年CSCCP会议
3、统一的临 床 判 定 标 准≥1.0pg/ml，避 免 因方法 学灵敏度过高产生的假阳性，结果重复性好，准确可靠。
18
杂交捕获法独特的探针技术
HPV病毒基因组为环状双链DNA，含有~8000个碱基对
德同DH系德列同DHHP系V 检列测HPV 检测 “全长鸡“尾全酒长”鸡探尾针酒技”术探针技术
HPV16 HPV18
00 00 00
Cuzick
00 99
PCR median 82% HC2 median 94%
HPV 病毒基因L1片段缺失
“L1片段的缺失并不普遍，但是任何变异或缺失都会造成PCR的检测结果为阴性…”
Unger et al JHC 1998, 46(4): 535-540
“L1片段是病毒衣壳蛋白，在HPV病毒引发的肿瘤进展过程中是不必要的，因此很可 能在HPV整合过程会导致L1片段的缺失”
成漏诊
Title, Location, Date
PCR和HC2的临床敏感性比较： 综合1999-2005年间的主要研究
基于CIN2/3/癌症的病例数〉1,500
100% 90 80
70 60 50 40
ScBDhKMeieCufBlSapfluiiCommsnugzsthsyrialaaoacaaddlnknsnart000000000455334433
经临床证实：高度的阴性预测值
HPV检查的最佳方法
HPV检查的最佳方法 杂交捕获技术 （HPV检测的金标准） 产品 德国凯杰的：HC2 杭州德同的：DH2、DH3
• 参考2015年世界IPV大会： 理想的临床灵敏度和特异度的临界值（Cutoff），即及能够保证对≥CIN2的病人具有非常高的检出率的同时，又可以避
免因分析敏感度过高而造成的假阳性 临床敏感度与疾病进展风险挂钩 分析敏感度与是否存在病毒感染挂钩：PCR过于敏感的分析敏感度，会将病毒含量的人判断为阳性
恢复阶段：免疫响应 早期感染会自身清除
Snijders et al. Journal of Pathology 2003; 201:1-6
HPV检测的目的是什么？
HPV病毒含量与临床病变的关系
CIN病变
进展为高级病变
无CIN病变
HPV检测的目的是什么？
WHO指南对于HPVCutoff有明确推荐检测阳性判断值
hpv检测目的及最佳检测方法
主要内容 1、HPV检测的目的是什么？ 2、HPV检查的最佳方法？ 3、德同产品介绍
2
HPV检测的目的是什么？
■ 只是为了查有没有HPV病毒感染？ ■ 是为了查HPV感染型别，检测型别越多越好？ ■ 是为了发现已经存在的CIN2+病变和预CIN2+ 的
风险人群？
3
专家对HPV检测是否要临床验证如何看待？
限制申报其他型HPV
• 如申报的宫颈癌相关HPV核酸检测产品涉及上述18种以 外的其他HPV基因型，则需提出明确理由和依据
• 且应得到国际有关权威机构的文献支持。
限制申报低危型HPV
• 不建议将低危型HPV检测用于宫颈癌筛查 • 若申请人提出低危型HPV检测相关产品注册，则应详细解
释其临床意义和适应症，并提供充分的证据 。
HPV检测的目的是什么？
答案： ■只是为了查有没有HPV病毒感染？NO ■是为了查HPV感染型别，检测型别越多越好？NO ■是为了发现已经存在的CIN2+病变和预CIN2+ 的风险
人群？yes
14
主要内容 1、HPV检测的目的是什么？ 2、HPV检查的最佳方法？ 3、德同产品介绍
15
HPV检查的最佳方法
12种HR 通用探针
8000bp，基于全长，涵盖HPV DNA 所有区域
2＋12种不同型别探针混合 准确，不漏诊
Cobas HPV& Abbott HPV(12+2 Real-time PCR)
Cobas HPV& Abbott HPV(12+2 Real-time PCR)
““寡寡核核苷苷酸酸探探针”针技”术技术
HPV检测不是仅仅为了检出HPV感染，而是为了发现已经存在的CIN2+病变和预测 CIN2+的风险；
对于HPV检测来说，最重要的是临床灵敏度和阴性预测值
WHO / IRAC 明确检测13种HPV
从流行病学和致癌机制证据方面，WHO/IRAC 明确检测13种HPV型别： HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68
PCR中β-球蛋白的竞争
“β-球蛋白和HPV以共同引 物L1片段进行扩增，这样会
降低HPV检测的敏感度”
Coutlee et al. JCM 2002; 40(3): 902-907
β-globin
HPV
HPV
HPV
β-globin
β-globin
HPV HPV
β-globin
β-globin
HPV
HPV检测的目的是什么？
1个HIV/HBV = AIDS/HBV 1个HPV ≠ CIN或宫颈癌
（80-90%的女性HPV感染是一过性的，可在6-24个月通过自体免疫清除） 高危型HPV持续感会导致宫颈癌 从HPV感染到宫颈癌，一般需要10－20年
一过性的感染会自身清除
高分析敏感度
检测与临床无关的病毒 水平（假阳性）