微生物的生长和纯培养

（二）微生物生长量和生理指标测定法 直接法(干重法，堆体积法) 间接法（比浊法，碳、氮含量法，其它生理指标）
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一、直接计数法
1、显微计数法（血球计数板法） 原理：将1cm2×0.1mm的薄层空间划分为400小格，
从中均匀分布地选取80或100小格，计数其中 的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。
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数
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3
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4、干重测定法
将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离 出来,然后烘干(干燥温度可采用105℃、100℃或 80℃)、称重。一般干重为湿重的10%—20%，而 一个细菌细胞一般重约10-12—10-13g。
该法适合菌浓较高的样品。
如大肠杆菌一个细胞一般重约10–12~10–13g，液体 培养物中细胞浓度达到2×109个/ml时，100ml培 养物可得10~90mg干重的细胞。
1ml 1ml 1ml
1m l
1ml
×3
9ml 9ml 1ml
×3
9ml 1ml
9ml
×3
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9、薄膜过滤计数法
常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微 生物数目。
将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、 醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上， 取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求 出样品中所含菌数。
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在微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞 经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养。
在微生物学中培养和发酵两个概念是相同。在 工业上大规模的进行微生物培养称为微生物 发酵。
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第一节 微生物生长测定
描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况， 需选用不同的测定指标。
（一）微生物细胞数目的检测法 直接法（血球计数板、比例计数法） 间接法（活菌计数法、液体稀释法、膜过滤法）
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10、涂片染色法
应用：可同时计数不同微生物的菌数，适 于土壤、牛奶中细菌计数。
方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取 0.1ml菌液涂于1cm2面积上，计数后代入公式：
该方法方便、快捷，但不能测定含有颗粒的菌液， 对链状和丝状菌无效。
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8、液体稀释法
液体稀释法
对 样 品 做 10倍 连 续 稀 释 ， 从 适 宜 的 3个 连 续 稀 释 度 中 各 取 5m l试 样 ， 接 种 3组 共 9支 装 有 培 养 液 的 试 管 中 （ 每 管 接 入 1m l） 。 经 培 养 后 ， 记 录 每 个 稀 释 度 出 现 生 长 的 试 管 数 ， 然 后 查 M .P .N .表 （ m ost probable num ber， 最 大 可 能 数 ） ， 根 据 样 品 稀 释 倍数就可计算处其中的活菌含量。
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6、细胞堆积体积测定法
方法：将细胞悬浮液装入毛细沉淀管内，离心， 根据堆积体积计算含菌量。
该法快速、简便，培养液中如有其他固体颗粒， 则误差较大。
也可以用有刻度的离心管离心，通过所得的沉淀 体积推算出细胞的质量。
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7、电子计数器法
方法：在计数器中放有电解质及两个电极，将电 极一端放入带微孔的小管，通电抽真空，使含 有菌体的电解质从小孔进入管内。当细胞通过 小孔时，电阻增大，电阻增大会引起脉冲变化， 则每个细胞通过时均被记录下来。因样品的体 积已知，故可以计算菌体的浓度，同时菌体的 大小与电阻的大小成正比。
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2、比浊法（比色发）
原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞 浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比， 菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光 光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度， 就可反应出菌液的浓度。
特点：快速、简便；但易受干扰。
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3.平板菌落计数法
技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速 （15~20min完成操作），严格无菌操作；
9ml
1ml
1ml
×2 ×2
1ml
×2
最常用的活菌计数法。
将适当稀释的菌液倾注平板或涂布在平板表面，经保 温培养后，以平板上出现的菌落数乘以稀释度就可 以计算出原菌液的含菌量。
直 径 9cm的 培 养 皿 平 板 上 出 现 菌 落 数 一 般 以 50~500为
宜。按照国家标准规定的样品菌落总数测定的计数
注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品 混匀处理，倾注平板时的培养基温度；
适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂 上生长的微生物；
误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有 由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作。
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平板菌落计数法
1ml 1ml 1ml
1ml
9ml 9ml 9ml
第四章 微生物的生长和纯培养
生长与繁殖的概念
生长——微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代 谢，当同化作用>异化作用时，生命个体的重量 和体积不断增大的过程。
繁殖——生命个体生长到一定阶段，通过特定方 式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增 加的生物学过程。
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发育——从生长到繁殖，是生物的构造和机能从 简单到复杂、从量变到质变的发展变化过程， 这一过程称为发育。
个体生长——微生物细胞个体吸收营养物质，进 行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体 生长。
群体生长——群体中个体数目的增加。可以用重 量、体积、密度或浓度来衡量。（由于微生物 的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生 长的状况）个体生长个体繁殖 群体生长 群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖
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适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、 酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞， 因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在 油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。
特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出 芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死 活细胞。
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5、菌丝长度测定法
该法适用于对丝状真菌生长长度的测定。
方法：将真菌接种在固体培养基的平皿中央，定 时测定菌落的直径或面积，直到菌落覆盖整个 平皿。
缺点：不能反映菌丝的纵向生长，不能计算菌落 的厚度和培养集中的菌丝。接种量也能影响结 果，不能反映菌丝的总量。
也可用U型管培养法，该法方便不易污染，但通 气不良。