绿色荧光蛋白结构
绿色荧光蛋白简述
四、骨
架和 细胞 分裂
1、酵母菌内SPB 和微管动力学 2、酵母菌中肌动蛋白的动力 3、果蝇中MEI-S332蛋白 4、网丙菌属细胞骨架动力，细 胞运动，趋化作用，细胞骨架 动力，细胞动力
网丙菌属中细胞骨架 动力和细胞运动.gif
12
五、 在其 他方 面的 应用
1、在肿瘤发病机制研究 中的应用 2、在信号转导中的应用 3、在生物防治中的应用 4、在生态学中的应用 5、目的基因的功能研究 6、作为报告基因构建基 因工程载体 7、神经生物学等
•⑥增加荧光强度和热稳定性，促进了生色 团的折叠，其荧光特性也得到了改善。 •因为GFP分子质量小，能够在异源细胞中稳 定表达并发射荧光，不需要任何辅助因子参 加，对细胞没有毒性，因而将会得到广泛应 用。随着人们对GFP的基础理论研究的进一 步深入和新型突变体的不断出现，有理由相 信GFP将会绿色荧光蛋白（GFP）
—21世纪的显微镜
绿色萤光蛋白 (green fluorescent protein)
基本介绍
GFP性质
GFP应用
应用前景
3
基本介绍
• 绿色荧光蛋白(green fluor escent protein)，简称GFP， 是一种化学性能稳定的小分 子蛋白质（分子质量为26kD a，由238个氨基酸构成 ） 在蓝色波长范围的光线激发 下，会发出绿色萤光 • 1962年由下村修等人，在维 多利亚多管水母（Aequorea vi 囊运输
三 、 发 育 生 物 学
1、用GFP显示小囊运输 2、用GFP观察TGN运输 3、细胞骨架动力学和胞内运输
1、用GFP观察线虫的神经发育 2、分析果蝇神经发育的不对称性细胞 分裂 3、用GFP观察网丙菌属的形态发生学 4、 GFP在小鼠发育中的标记方法
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达(新手详细注释版)
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白( green fluorescent protein ， GFP)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时， GFP 发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子。
发色团是其蛋白质一级序列固有的。
GFP 由 3 个外显子组成，长 2.6kb ；GFP 是由 238 个氨基酸所组成的单体蛋白 ,相对分子质量为27. 0kMr ，其蛋白性质十分稳定，能耐受 60℃处理。
1996 年 GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长 420 nm，宽 240 nm，由 11 个围绕中心α螺旋的反平行β 折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第 65-67 位的 Ser-Tyr-Gly 自身环化和氧化形成 .实验一质粒DNA 的分离与纯化一、实验目的掌握一种最常用的质粒 DNA 提取方法：碱裂解法。
该法用于从小量培养物中抽提质粒 DNA ，比较方便、省时，提取的质粒 DNA 质量较高，可用于 DNA 的酶切、 PCR 甚至测序。
二、基本原理质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。
迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链 DNA 分子，分子量范围从 1kb 到200kb 。
质粒 DNA 可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
在大多数情况下质粒 DNA 复制中的酶体系和细菌染色体复制10-200 个拷贝。
当宿主细胞的蛋白时所用的酶是相同的。
有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制，因此每个细胞中只含一个或几个拷贝，称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严，称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达质合成受到抑制时（例如经氯霉素处理），细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒 DNA 可继续被复制，以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。
绿色荧光蛋白的结构与应用
GFP荧光持续时间较长，在450-490nm蓝光激发下，能保持 10min以上荧光。
03 GPF的应用
显像与示踪技术
绿色荧光蛋白（GFP）的结构与应用
由于GFP稳定无毒，所以可 使动物体内复杂结构可视化，使 得实验研究更加直观清晰。You 等通过GFP标记的裸小鼠，检测 GFP基因在小鼠各器官中的表达 状况，为选择疾病模型和移植供 体提供了依据。
报告基因
绿色荧光蛋白（GFP）的结构与应用
GFP由于具有光信号传导机制，可用 作活细胞内的荧光感受器。荧光感受器常 用于检测各种分子对生物的有效性，甚至 可以用于研究活细胞中蛋白质的构象变化。 在检测某物质对于某种生物是否有毒性方 面，GFP荧光感受器也有较大的利用价值。
荧光感C 受器
绿色荧光蛋白（GFP）的结构与应用
GFP
GFP的发光现象由其生色团决定，GFP表达后折叠，在有氧条件下 第66位氨基酸残基脱氢，使Ser65-Tyr66-Gly67环化形成对羟基苯咪唑啉 酮，即生色团。
02 GPF的优点
GPF的优点
绿色荧光蛋白（GFP）的结构与应用
性质极其稳定，高温、甲醛固定和石蜡包埋不影响其发光性 能，对强光或长时间光照都有较强的耐受能力，对大多数普 通酶有较强抗性。
GFP
Байду номын сангаас
目录
CONTENTS
01 GFP的结构
03 GFP的应用
02 GFP的优点
04 +
参考文献
01 GPF的结构
绿色荧光蛋白（GFP）的结构与应用
GFP
绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）是一类能被蓝紫光激 发而发出绿色荧光的蛋白。
绿色荧光蛋白(GFP) 的特性及其在分子生物学研究中 的应用课件
3 GFP的稳定性
❖ GFP荧光极其稳定,在荧光显微镜强光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素 (fluorescein)强[19]。特别在450~490 nm蓝光波长下更稳定,但在340~390 nm或395~440 nm范围内,仍会发生光漂白现象。GFP在不同物种中稳定性不同,在果蝇和斑纹鱼(Zebra fish)中极稳定;在大肠杆菌中会有光漂白;在线虫中10 mM的NaN3将加速光漂白。GFP需要 在氧化状态下产生荧光,强还原剂如5 mM Na2S2O4或2 mM FeSO4能使GFP转变为非荧 光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂,如2% 巯基乙醇、10 mM DDT、10 mM还原谷胱甘肽、10 mM半胱氨酸等并不影响GFP荧光。 中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等,但GFP对 某些封片指甲油特别敏感,苯氧丙烷对GFP荧光也有影响。强氧化剂如1% H2O2,或硫氢基 试剂如1 mM DTNB会造成GFP不可逆性破坏[20]。大多数中等浓度的有机试剂不减弱GFP 荧光,但其最大吸收峰值会改变[21]。在高蛋白、高盐条件下,GFP通过疏水反应形成二聚体, 使470 nm吸收峰值下降近4倍。GFP很容易从细胞中分离并结晶[22]。在离体状态下,GFP 蛋白对热(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通蛋白酶(链霉蛋白酶Pronase 除外)有较强抗性[23]。GFP荧光在pH值为7~12时稳定,在pH值为5.5~7.0时开始受影响[24]。 在纳克级水平,SDS-聚丙烯酰胺电泳凝胶中仍能观察到GFP荧光。在高温、极端pH、或胍 基氯化物条件下,GFP会变性,荧光消失。一旦复性,荧光会部分恢复[25],但可能需要某些硫 醇类化合物的作用[26]。GFP在各种生物活体条件下表现稳定。例如氯霉素乙酰转移酶 (CAT)在生物体内很稳定,用35S-甲硫氨酸分别标记CAT和GFP,并转染玉米叶肉原生质体,用 放线菌酮处理原生质体,通过CAT检测,发现5~10μg/ml放线菌酮可完全抑制CAT在玉米原生 质体中的蛋白合成,但通过GFP观察,转染24小时后,仍未发现GFP荧光有明显减弱,仅有部分 GFP被放线菌酮降解。说明GFP在植物活体细胞中比CAT还要稳定[27]。此外,尽管GFP的 消光系数较低,但和荧光素一样,额定含量可高达80%。在荧光显微镜下,GFP融合蛋白的荧 光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。 但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋 白。由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP 是迄今为止唯一一种活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。
dfhbi 1t类绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）是一种具有绿色荧光的蛋白质，广泛应用于生物学领域的标记和成像技术中。
绿色荧光蛋白的研究和应用已经成为生命科学领域中的热点和前沿课题。
在这篇文章中，我们将深入探讨绿色荧光蛋白的种类、结构、功能和应用。
1. 绿色荧光蛋白的种类绿色荧光蛋白是由Aequorea victoria（水母）发光器官中分离出来的一种蛋白质。
根据不同的来源和结构特点，绿色荧光蛋白可以分为多种类别，包括标准GFP、改良GFP、超变荧光蛋白和环状GFP等。
每种类型的绿色荧光蛋白都具有不同的荧光特性和适用范围。
2. 绿色荧光蛋白的结构绿色荧光蛋白的结构是其功能的基础。
它是一个由238个氨基酸组成的蛋白质，包括一个β桶结构和一个共轭双键序列。
在特定的条件下，它可以通过自发性氧化反应形成荧光色团，并发出绿色的荧光。
绿色荧光蛋白的结构和光学特性为其在生物标记和成像领域的应用奠定了基础。
3. 绿色荧光蛋白的功能作为一种生物标记物，绿色荧光蛋白的主要功能是在转基因生物中标记特定的细胞、器官或组织，以便于研究者对其进行观察和分析。
通过转基因技术，研究人员可以将绿色荧光蛋白基因导入到目标生物体中，从而实现对其活体成像和实时监测。
绿色荧光蛋白在蛋白质定位、蛋白质-蛋白质相互作用和基因表达调控等方面也发挥着重要作用。
4. 绿色荧光蛋白的应用绿色荧光蛋白的广泛应用领域包括但不限于以下几个方面：a. 细胞成像与实时监测：通过转基因技术将绿色荧光蛋白标记到感兴趣的细胞中，可以实现对其活体成像和实时监测，从而揭示生物体内细胞的运动、分化和凋亡等过程。
b. 蛋白质定位与跟踪：通过融合绿色荧光蛋白与感兴趣蛋白质，可以实现对蛋白质在生物体内的定位与跟踪，从而研究其功能和代谢途径。
c. 蛋白质-蛋白质相互作用研究：利用双融合蛋白技术或FRET技术，可以实现对蛋白质-蛋白质相互作用的实时观察和分析，为研究蛋白质分子机制提供了有力工具。
绿色萤光蛋白
绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。
其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。
这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca+2)可产生交互作用。
由水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色萤光蛋白，395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光绿光的范围下是较弱的位置。
由海肾(sea pansy)所得的绿色萤光蛋白，仅有在498nm有一个较高的激发峰点。
在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene)。
一些经修饰过的型式可作为生物探针，绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。
我们这边细胞组的基本上都在用这个东东。
标记细胞GFP的分子结构和发光机制绿色荧光蛋白为一个由238个氨基酸残基组成的单链，GFP有两个吸收峰，主峰在395nm，次峰在470nm，其荧光发射峰在509nm。
GFP 的化学性质相当稳定，其变性需要在90℃或pH<4或pH>12的条件下用6mollL盐酸胍处理，这一性质与GFP的结构特性相关。
Yang等的研究表明，GFP是由两个相当规则的内含一个α-螺旋和外面包围l1个β-折叠的β-桶状结构组成的二聚体，β-桶状结构直径约3nm，高约4nm。
β折叠彼此紧密结合，象桶板一样形成桶状结构的外围，并且形成了一个规则的氢键带。
桶状结构和位于其末端的短α螺旋以及环状结构一起组成一个单独的致密结构域，没有可供扩散的配体进入缝隙。
这种坚实的结构保证了其稳定和抗热、抗变性的特点。
GFP的生色基团附着于α-螺旋上，几乎完美的包被于桶状结构中心。
位于圆桶中央的α-螺旋含有一个由六肽组成的发光中心，而发光团是由其中的三肽Ser65-Tyr66-Gly67经过环化形成了对羟基苯咪唑啉酮。
对绿色荧光蛋白(GFP)的了解及应用
对绿色荧光蛋白的了解及应用学院：生命科学学院姓名：马宗英年级：2011学号：2011012923前言绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，是一种具有奇妙特性的“光学蛋白质”。
这种蛋白质从成分和结构上来说，没有丝毫的特殊性，它的组成单元是20种常见的氨基酸，二级结构也是普通的α螺旋和β片层。
但是，这种蛋白质却具有一个非常特别的性质——发出绿色荧光。
【关键词】绿色荧光蛋白生命科学应用一、绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白最早是由下村修等人于1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现的。
其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，吸收蓝光的部分能量，发出绿色荧光。
野生型水母GFP的一级序列已由其cDNA序列推导出来[1]，它至少存在4种同源GFP，但这些突变并不影响GFP的基本功能，只是使突变的GFP具有了新的性质。
生色团是GFP发出荧光的物质基础，也是GFP结构中的一个重要组成部分。
GFP的生色团位于氨基酸序列64~69位的六肽内,65~67位的丝氨酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸通过共价键形成的对羟基苯甲基咪唑环酮是一个独特的、相当稳定的环状三肽结构,构成了GFP生色团的核心[2],见图1。
图2为生色团的形成机制。
图1 多管水母中GFP生色团的化学结构和附近序列图2生色团的形成机制目前人们对GFP的荧光发光机制并不十分清楚，大家只是认为，GFP是生物发光过程中的能量受体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机制也有很大差异。
二、GFP在生命科学中的应用1、作为蛋白质标签（protein tagging）利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签（protein tagging），即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染到合适的细胞中进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内的活体观察。
绿色荧光蛋白
GFP作为标记蛋白的优点
①荧光稳定 ②检测方便 ③无种属特异性，也无有细胞种类和位置的限制 ④GFP对受体细胞基本无毒害 ⑤易于构建载体，不受假阳性干扰 ⑥不需任何反应底物和辅助因子 ⑦可制成永久标本
蓝色荧光蛋白
双突变体Y66H/Y145F能在381nm光的激发下产生445nm 的蓝光，故称BFP。这种蓝光能进一步激发GFP产生绿光， 即发生荧光共振能量转移现象（FRET） 。
绿色荧光蛋白变异体的发色基团结构
EBFP：增强蓝色荧光蛋白；ECFP：增强蓝绿色荧光蛋白 EGFP：增强绿色荧光蛋白；EYFP：增强黄色荧光蛋白
绿色荧光蛋白的发光基团
Model of the fluorophore and its environment superposed on the MAD-phased electron density map at 2.2 Å resolution. The clear definition throughout the map allowed the chain to be traced and side chains to be well placed. The density for Ser65, Tyr66 and Gly67 is quite consistent with the dehydrotyrosine - imidazolidone structure proposed for the fluorophore. Many of the side chains adjacent to the fluorophore are labeled.
绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达
绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆及表达摘要绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
采用PCR技术，对实验室提供的质粒pEGFP-N1中的目的基因进行扩增。
所得PCR产物和质粒pET-28b经过BamH I和Nde I双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳法检测酶切产物的酶切情况并回收凝胶，再利用T4DNA连接酶将目的基因与载体连接起来，得到重组质粒。
将重组质粒导入克隆菌E. coli DH5a中培养扩增，提取阳性菌落质粒进行重组子鉴定，进而导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中，经IPTG诱导目的基因表达产生绿色荧光蛋白。
关键词：绿色荧光蛋白 PCR 基因克隆表达1.前言1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光[1]。
1.2 GFP 的结构GFP中央是一个圆柱形水桶样结构，如图二。
长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成。
1.3 GFP的研究应用GFP可标记细胞和蛋白质，具有广泛的应用前景。
GFP及其突变体已被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物]2[等方面。
基于新型功能荧光蛋白的光学分子成像技术的发展，为在活细胞乃至活体动物内研究基因表达和蛋白质功能提供了更多的选择空间。
GFP还用于观察微生物、发育机理研究、细胞筛选、免疫学等方面。
本实验是利用实验室提供的质粒pEGFP-N1,其结构如图三所示。
其上有所用酶的酶切位点。
绿色荧光蛋白PPT模板.ppt
用荧光蛋白在鼠脑中绘制的油画
3.3 小动物体内恶性肿瘤生长过程及药物作用效果 的实时光学成像监测：
No Image
(a) 整体荧光成像系统示意图．(b)整体荧光成像监测2 胰腺癌细胞(表达红色荧光蛋白)的生长以及治疗效果．肿 瘤细胞种植后10，17，24，48 和56 天分别进行成像．粗箭头表示原位灶．细箭头表示转移灶．与对照组进行 比， 药物部分抑制原位灶和转移灶的生长，而 药物则在一个月内大大抑制肿瘤的生长，但是一个月之后，继
2. 发光机制： 生色团是由其中的三件下 不能形成荧光．生色团通过66 的脱质子 (酚盐)和质子化状态(羟酚基)的转换决定荧光发射。
生色团的66 和67 相对比较保守，而65相对易变，因此可用其他氨基酸替 换。
3. 典型应用：
3.1 技术 ——活细胞内基因表达及蛋白质-蛋白质相互作用的光学成像与可视化
R
C
Y
C
3.2 不同神经元的多色标记与光学成像:
结合其他颜色荧光蛋白，比如红色荧光 蛋白，可对同一个细胞的不同细胞器和不同 细胞进行标记．其中最具代表性的实验莫过 于2007 年的“脑虹”。
哈佛大学的研究人员通过转基因技术将 不同光谱的荧光蛋白基因整合进实验老鼠的 基因组，并且只让它们在老鼠脑神经元表 达．
谢谢！
绿色荧光蛋白
化 基：张 赫 学 号：2
2008年，诺贝尔化学奖：
Y.
目录：
发
典
结
光
型
展
构
机
应
望
制
用
1. 绿色荧光蛋白的结构：
: 分子量27 238个氨基酸残基 11个β折叠 位于圆桶中央的α螺 旋含有一个含6肽组 成的发光中心
N端 C端
绿色荧光蛋白的结构和应用
绿色荧光蛋白的结构和应用【摘要】文章就绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）的一级结构和其发光基团的形成机理进行了分析，给出了GFP的三维结构，并对GFP的优点、改进方法和实际应用进行概括。
【关键词】GFP 结构改进应用2008年10月8日，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu Shimomura（下村修）、哥伦比亚大学的Marin Chalfie和加州大学圣地亚哥分校的Roger Y.Tsien（钱永健）因发现并发展了绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）而获得2008年度诺贝尔化学奖。
GFP也因此进入了更多人的视角。
一、GFP的一级结构和发色团形成机理GFP是存在于水母、珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，是Shimomura等人从Aequorea victoria中发现的。
GFP含238个氨基酸残基，分子量27kDa。
野生型GFP的核苷酸序列和氨基酸序列在1992年即被Prasher等人测定[1]。
表1为其氨基酸序列。
GFP不含辅基，也不需要辅助因子，在22℃左右，氧条件下，用蓝光光源激发下可发出绿色荧光[2]。
其发色团形成于肽链65至67位的Ser-Tyr-Gly，是分子内自催化环化生成的对羟基吡唑啉酮。
首先肽链折叠，Gly67酰胺亲核进攻Ser65的羧基，并脱去一分子水形成咪唑啉酮，最后在氧作用下Tyr66的α，β-键脱氢，此时芳基和咪唑啉酮形成大的共轭体系，发色团成熟，可以吸收辐射并发出荧光[3]。
图1为示意图。
图1：GFP 发色团形成机理表 1：GFP 的氨基酸序列Tsien还根据发色团组分的不同将野生型GFP和其突变体分为了7类，如含中性酚类和酚离子混合发色团的蛋白，含吲哚类的蛋白，含咪唑类的蛋白，具有大π共轭电子体系的酚负离子的蛋白等[3]。
虽然它们的激发波长、吸收波长等荧光性质具有很大不同，但其发光机理都与它们的一级结构密切相关，发色团形成机理类似。
绿色荧光蛋白结构
专业文献综述题目:姓名:学院:专业:班级:学号:指导教师:2012 年6 月15 日南京农业大学教务处制绿色荧光蛋白GFP的结构以及发光特性摘要：Osamu Shimomura和Frank Johnson首次从水母Aequorea victoria中分离出依赖钙离子的生物发光蛋白，命名为aequorin。
在分离过程中，还发现第二种蛋白，它缺乏发射蓝光的生物发光成分，但是在紫外光照射时可以发出绿色荧光，故命名为绿色荧光蛋白（GFP）。
在随后的20年里，研究者测定aequorin和绿色荧光蛋白在水母体内共同作用，将依赖钙离子的生物发光信号转换为发绿色荧光特性。
本文综述了GFP 的结构和发光特性以及展望GFP的发展前景。
关键词：GFP、荧光、展望The Structure of Green Gluorescent Protein and Luminescent LropertiesAbstract: Osamu Shimomura and Frank Johnson for the first time separated from the jellyfish Aequorea victoria, a calcium-dependent bioluminescent protein, named aequorin. During the separation process, also found a second protein, which lacks the blue light emitting bioluminescence ingredients, but the green fluorescence under UV irradiation, so named for the green fluorescent protein (GFP). In the next 20 years, the researchers determined that aequorin and green fluorescent protein in jellyfish together will depend on the bioluminescence of the calcium signal is converted into green fluorescence properties. This paper reviews the development prospects of the GFP structure and luminescence properties, as well as the outlook of the GFP.Key words: GFP, fluorescence, Outlook1.GFP的发现简介绿色荧光蛋白（GFP）是一种能够发出绿色荧光的蛋白质，它存在于维多利亚多管水母体内。
绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白
1
简介 发现 应用
2
3
一、简介
绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早 是由下村修等人在1962年在一种学名 Aequorea victoria的水母中发现。其 基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围 的光线激发下，会发出绿色萤光。这个 发光的过程中还需要冷光蛋白质 Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质 与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。
这是中国东北农业 大学绿色荧光猪， 这些猪不是直接进 行基因工程改造的 结果，而是遗传它 们转基因猪妈妈的 荧光基因。这表明 转基因克隆猪的一 些性状能够保持稳 定遗传，不存在生 理缺陷。
2、跟踪观察微生物
• 传统方法中，一般用荧光 染料标记微生物，由于微生 物的分裂，染料被稀释，因 此长期以来未能观察到微生 物侵入活细胞的实时动态过 程。ＧＦＰ基因能克服上述 缺点，且在活细胞中能直接 观察到，无需破坏原有细胞 而阻止感染的继续进行。目 前，这项成果已经运用于烟 草植株中的病毒、玉米植株 中的固氮菌等的研究试验中 。
3、发育机理研究
• ＧＦＰ作为活体标记物，可用于示踪细胞发育过程中基因表 达的变化情况，对于那些透明的动物，还可观察其发育过程。 如查尔菲（Ｃｈａｌｆｉｅ）等用线虫ｍｅｏ一７基因（编码 ８一Ｔｕｂｕｌｉｎ）启动子控制基因转化线虫（Ｃ．ｅｌｅ ｇａｎｓ），发现ＧＦＰ可在特定的神经元中表达，并且可以 非常方便地检测到。
EBFP：增强蓝色荧光蛋白；ECFP：增强蓝绿色荧光蛋白 EGFP：增强绿色荧光蛋白；EYFP：增强黄色荧光蛋白
三、应用
• • • •
1、作为转基因植物和动物的筛选标记 2、跟踪观察微生物 3、发育机理研究 4、 GFP在蛋白质细胞定位中的应用
绿色荧光蛋白
荧光蛋白的应用
细胞分裂和骨架 细胞器动力学和泡囊运输 发育生物学 分子标记 药物筛选 光伏发电
细胞分裂和骨架
GFP较小，与其它蛋白质融 合后不影响自身的发光性能， 利用这一特性可以加深我们 对细胞内一些过程的了解， 如细胞分裂、染色体复制和 分裂，发育和信号转导等 。 如研究脑神经细胞的发展 或者癌症细胞是如何扩散的 等。
绿色荧光蛋白
2008年诺贝尔化学奖 获得者：马丁· 查尔菲(Martin Chalfie)、钱永健 (Roger Y. Tsien)和下村修(Osamu Shimomura) 小组成员：张艳嫡 邱丹丹 郎平 肖欢 颜旭 张忠丽 黄春林 刘凯 郭高尚 曾万强
绿色荧光蛋白（green fluorescence protein; GFP）
科学使用绿色荧光蛋白跟踪大脑细胞的活动
药物筛选
由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞 毒性较小，因而常用作荧光探针。 将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋 白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况， 并推断该分子在迁移中的功能。利用这一原理， 已经成功构建了一个筛选模型，用于研究药物 介导的糖皮质激素受体(hGR)的迁移过程。
绿色荧光蛋白分子的形 状呈圆柱形，就像一个 桶，负责发光的基团位 于桶中央。装在“桶” 中的发光基团对蓝色光 照特别敏感。当它受到 蓝光照射时，会吸收蓝 光的部分能量，然后发 射出绿色的荧光 。
特性决定广泛用途
GFP是无毒的，它可在不同的有机体中， 高水平地予以表达，而对有机体的生理学 则仅有很小的影响．可用于在时间和空间 上监视越来越多的活细胞中的现象和机制, 如基因表达、蛋白质的定位和动态学等.因 此可以说,绿色荧光蛋白质的发现是联系到 生物科学上的一次技术革命.
gfp荧光蛋白的n和c端
gfp荧光蛋白的n和c端
在探讨GFP荧光蛋白的N端和C端时，首先需要理解GFP的结构和功能。
GFP，全称为绿色荧光蛋白，是一种蛋白质，由于其独特的荧光性质，被广泛用于生物学研究中，尤其是在荧光显微镜技术中。
其结构包括一个环状结构和一个桶状结构，其中环状结构中的生色团负责发出绿色荧光。
现在来谈谈N端和C端。
在大多数蛋白质中，N端是指向氨基酸序列的起始端，而C端是指向序列的结束端。
对于GFP来说，其N端和C端的功能和特性也是不同的。
1. N端：通常与蛋白质的定位有关。
例如，当目标蛋白与荧光蛋白的N端融合时，该融合蛋白可能会被定位到特定的细胞器。
2. C端：通常与蛋白质的稳定性有关。
某些情况下，C端的特定序列可以增加蛋白质的稳定性，使其在细胞内更持久地表达。
因此，在构建融合蛋白或进行相关研究时，了解目标蛋白的性质以及希望获得的结果是非常重要的。
不同的融合方式可能会影响实验结果，因此在实验设计和实施过程中要特别注意这一点。
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绿色荧光蛋白结构
野生型绿色荧光蛋白，最开始是 238 个氨基酸的肽链，约 25KDa。
然后按一定规则，11 条β-折叠在外周围成圆柱状的栅栏；圆柱中，α-螺旋把发色团固定在几乎正中心处。
发色图被围在中心，能避免偶极化的水分子、顺磁化的氧分子或者顺反异构作用与发色团，致使荧光猝灭。
荧光是荧光蛋白最特别的特点，而其中的发色团起着主要的作用。
在α-螺旋上的 65、66、67位氨基酸——丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸经过环化、脱氢等作用后形成发色团。
有意思的是，发色团形成过程是由外周栅栏上的残基催化，底物只需要氧气。
这暗示绿色荧光蛋白被广泛用于不同物种的潜力：在不同物种中能独立表达成有功能的蛋白，而不需要额外的因子。
不过，现在依然在讨论准确的过程。
发色团上的共轭π键能吸收激发光能量，在很短的时间后，以波长更长的发射光释放能量，形成荧光。