丝状真菌蛋白提取方法(双向电泳)

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双向电泳蛋白样品的制备

〔3〕参加与酚一样体积的提取液，充分振荡后放置于冰上，每隔5min振荡一次，总共6次，4℃，5000r/min，离心30min，吸出上层酚相，转移至新的 15mL离心管中。重复一次苯酚抽提。
〔4〕参加最后得到的酚的5倍体积的醋酸铵甲醇溶液对蛋白进展沉淀，充分振荡后置于冰上保温每隔5min振荡一次，总共6次，于-20℃沉淀过夜。
双向电泳样本制备
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双向电泳样品制备：
一、蛋白质提取原那么：
二、样本裂解方式：
三、2D蛋白裂解液组成及作用： 1：裂解液组成及作用 2：常见裂解液
四、蛋白质提取步骤：
五、蛋白质样本制备实例： 1：动物组织样本制备 2：植物组织样本制备
醋酸铵甲醇溶液Ammonium acetate in methanol
用甲醇配制0.1M的醋酸铵
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以外，从而使某些蛋白质的二硫键重新配对，使溶解度降低而重新沉淀下来。使用浓度范围10~100 mmol/L.
b: 采用非离子复原剂三丁基膦TBP可以大大增加蛋白质的溶解性，并利于蛋白从第一向转移到第二向。但是TBP在水溶液中的不稳定性和不溶性，使其在第一向IEF中维持蛋白质复原状态是相对无效的。因此在IEF时建议最好使用巯基复原剂。
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三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用
2、去垢剂： (1) 作用：破坏蛋白质分子间的疏水相互作用。
(2) 种类： a: 非离子去垢剂：triton X-100, NP-40 b: 两性离子去垢剂： CHAPS,CHAPSO SB3-10(不溶于浓度高于5mol/L的脲中〕 ASB(具有比CHAPS更强的膜蛋白溶解力〕 c: 阴离子去垢剂：SDS〔小于0.25%，同时确保其他去垢剂与

双向电泳法在家蚕蛋白质分离中的应用

双向电泳法在家蚕蛋白质分离中的应用家蚕（Bombyxmori）是蚕类动物，是家养和蚕桑人类居住地区诸多蚕类中最重要的家畜，因其十分多样的蛋白质，被广泛用于分离及分析研究，如比较微生物的蛋白质组成和药物研究。

双向电泳法（SDS-PAGE）是一种用于分离家蚕蛋白质的广泛应用的方法。

它可以分离家蚕的多种蛋白质，以精确的分子量为结果，以其灵活的分离能力为科学家们提供研究机会。

原理双向电泳法（SDS-PAGE）是一种流动态电泳法（IEF），它可以分离不同大小的蛋白质。

它主要是利用电流来分离，譬如蛋白质悬浮液或者凝胶中的物质可以被电流所吸引，并被向前或向后推进，最终形成各个分离峰，从而实现按不同分子量进行电泳分离。

家蚕蛋白质的电泳分离可以通过添加一种叫做聚脂酰胺的表面活性剂。

聚脂酰胺可以在原有的和电流的作用下，使蛋白质在家蚕蛋白质电泳分离过程中变得更加稳定，从而提高分离的效率。

过程家蚕蛋白质的双向电泳分离一般以室温下进行。

蛋白质悬浮液或凝胶放入电泳室，连接电极，然后开启电源，开启正负电流，使每个组分移动不同的方向，这样便能有效地进行分离，最后得到家蚕蛋白质的分离曲线。

家蚕蛋白质电泳后，蛋白带的形态可以通过遗传自动染色法来确定，并利用紫外分光光度计来检测它们的浓度。

在染色过程中，可以将家蚕蛋白带的形态和分子量相匹配，从而确定它们的分子量。

优势双向电泳法（SDS-PAGE）利用它的灵活性，可以分离出家蚕蛋白质的多种组分，精确的分子量，并根据它们的浓度、形态及分子量进行精确分离。

它具有高灵敏度，分离过程快捷，可以进行大量分离，节省时间，实验简便，操作安全，分离的结果准确。

它的分离能力与其他传统的分离方法相比具有明显的优势，可以更好地满足实验室的日常需求。

缺点家蚕蛋白质电泳分离中，双向电泳法（SDS-PAGE）不是完美的。

它只能分离出家蚕蛋白质的一部分，并不能分离出所有种类的蛋白质，可能会遗漏一些重要的分子，还可能会出现分离的结果不准确的情况，因此使用双向电泳法进行分离时，需要进行大量的核酸和蛋白质分析，以更准确的分析出家蚕蛋白质的组成成分。

双向电泳技术的原理及应用

双向电泳技术的原理及应用1. 原理双向电泳技术是一种分离和鉴定蛋白质的常用方法。

它结合了凝胶电泳和电泳移动的优势，可以在同一实验中实现更高的分辨率和更好的分离效果。

双向电泳的原理基于两个关键因素：分子大小和电荷。

在实验中，蛋白质样品首先沿一个方向进行电泳。

由于蛋白质的不同大小和电荷，它们会在凝胶中形成不同的带状图案。

然后，凝胶会旋转90度，使蛋白质在垂直方向上进行电泳。

这样一来，蛋白质会在另一个方向上发生分离。

双向电泳的核心是双向凝胶，其结构类似于二维网络。

在第一个方向上，凝胶中的蛋白质会形成一维图案，而在第二个方向上，蛋白质会形成另一维图案。

通过对这两个图案的分析，可以得到更为准确的蛋白质信息。

2. 应用2.1 蛋白质分离和纯化双向电泳技术在蛋白质分离和纯化中有着广泛的应用。

由于双向电泳可以提供更高的分辨率，可以分离和鉴定更多的蛋白质。

这在研究蛋白质结构和功能以及疾病诊断中具有重要意义。

2.2 蛋白质组学研究双向电泳技术在蛋白质组学研究中发挥着重要作用。

通过双向电泳，可以分离出复杂样品中的蛋白质，并获得其质量和电荷信息。

这些信息可以用于鉴定蛋白质和研究其功能。

2.3 药物研发双向电泳技术在药物研发中也有广泛的应用。

通过双向电泳，可以分离和鉴定药物的靶点，进一步了解药物与蛋白质的相互作用机制。

这对于药物设计和优化具有重要意义。

2.4 分子生物学研究双向电泳技术在分子生物学研究中有着重要的应用。

通过双向电泳，可以鉴定蛋白质的表达变化，从而了解基因表达调控机制。

这对于研究细胞功能和疾病发生机制具有重要意义。

2.5 环境监测双向电泳技术在环境监测中也有着广泛的应用。

通过双向电泳，可以分离和鉴定环境中的污染物，从而评估环境质量和污染程度。

这对于环境保护和治理具有重要意义。

3. 优缺点3.1 优点•分辨率高：双向电泳可以提供更高的分辨率，可以分离和鉴定更多的蛋白质。

•信息丰富：双向电泳可以获得蛋白质的质量和电荷信息，有助于了解蛋白质的结构和功能。

双向电泳的原理应用

双向电泳的原理应用1. 原理介绍双向电泳是一种用于分离和分析蛋白质的技术。

它利用电场的力作用将蛋白质分子根据其大小和电荷分离成不同的带状条带，从而实现对蛋白质的分离和分析。

在双向电泳中，电泳液在两个方向（水平和垂直）上施加电场。

水平的电场用于推动蛋白质分子在凝胶中移动，而垂直的电场用于将蛋白质分子根据其电荷进行分离。

2. 双向电泳的步骤双向电泳通常包括以下几个步骤：2.1 凝胶制备首先制备凝胶，常用的凝胶包括聚丙烯酰胺凝胶和聚酰胺凝胶。

凝胶的选择取决于所要分析的蛋白质的分子量范围。

2.2 样品制备将待分析的蛋白质样品进行处理，通常包括蛋白质提取、蛋白质纯化和蛋白质标记等步骤。

2.3 水平电泳将样品加载到凝胶上，并将凝胶放入水平电泳槽中。

施加水平电场后，蛋白质会根据其分子量在凝胶中移动，形成水平方向上的分离。

2.4 凝胶固定水平电泳后，将凝胶固定，通常使用乙醇或甲醛进行固定，以防止蛋白质在后续步骤中的移动。

2.5 垂直电泳固定后的凝胶被垂直放置，然后施加垂直电场。

此时，蛋白质会根据其电荷进行进一步的分离。

2.6 染色和可视化分离完成后，凝胶通常会被染色，以便观察和分析分离的蛋白质条带。

常用的染色方法包括银染和荧光染色。

3. 双向电泳的应用双向电泳在蛋白质分离和分析方面具有广泛的应用。

3.1 蛋白质组学研究双向电泳可以用于研究蛋白质组学，包括蛋白质的组成、结构和功能等。

通过双向电泳可以分离出不同的蛋白质条带，从而有助于研究蛋白质的表达和变化。

3.2 蛋白质质量测定双向电泳可以用于测定蛋白质的质量。

通过与已知质量的蛋白质进行比较，可以确定待测蛋白质的质量范围。

3.3 蛋白质互作研究双向电泳还可以用于研究蛋白质之间的相互作用。

通过在凝胶中一同加载多个蛋白质样品，可以观察到不同蛋白质之间的相互作用。

3.4 蛋白质标记双向电泳常常与蛋白质标记技术结合使用。

通过将蛋白质样品与荧光染料或同位素标记剂结合，可以在凝胶上可视化和定量分析蛋白质。

细菌蛋白提取方法(双向电泳用)

细菌总蛋白提取试剂盒（双向电泳用）
产品组成：
产品组成规格
细菌蛋白提取液 A（2D）细菌蛋白提取液 B
蛋白酶抑制剂混合物
BB-3182-1 50 assays
25ml 250ul 100ul
BB-3182-2 100 assays
50ml 500ul 200ul
储存条件：蛋白提取液 A 室温保存；蛋白提取液 B 和蛋白酶抑制剂-20℃保存。
凝胶阻滞实验、免疫共沉淀、酶活分析等下游实验的试剂盒，请联系本公司选购其他货号的试剂盒。
使用方法：裂解液的准备：根据所需要提取的样本量，每 500ul 蛋白提取液中 A 加入 5ul 试剂 B 和 2ul 蛋白酶抑制剂混合物，充分混匀后置冰上备用。在 4℃ 12000RPM 条件下将菌液离心 5min，弃上清，尽量吸干剩余液体，收集菌体，用 PBS 洗菌体 2 次。若为冷冻菌体直接进行下面操作步骤即可。按每 20mg 湿重菌体样本加入 500ul 裂解液，吹打混匀，冰上放置 30 分钟，间隔一段时间振荡。（选做步骤：300w，10s 超声/10s 间隔条件下冰浴超声至菌液变清。若不做，请延长裂解液作用时间至 2 小时。）在 4℃ 12000RPM 条件下将提取液离心 5 分钟。快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到细菌总蛋白。将上述蛋白提取物定量①后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
BB-3152 BB-3301 BB-3311 BB-3703
பைடு நூலகம்相关产品：
产品总蛋白提取试剂盒核蛋白提取试剂盒 Bradford 蛋白定量试剂盒 ECL 化学发光检测试剂盒细胞蛋白提取试剂盒组织蛋白提取试剂盒
产品号 BB-3101 BB-3102 BB-3411 BB-3501 BB-3121 BB-3122

蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析

蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析操作步骤:1.样品准备:将待测蛋白质混合物进行样品处理，如蛋白质提取、浓缩和去污等步骤，以获得高纯度、高浓度的样品。

2.第一维电泳:将样品加载到等电点聚焦凝胶中。

等电点聚焦是根据蛋白质的等电点进行分离的方法，即根据蛋白质电荷差异使其定位到等电点位置。

通常使用毛细管等电点聚焦，具体操作步骤是：将样品注入到毛细管中，两端分别连接正负电极，施加电压使得蛋白质开始迁移，直到在等电点位置停止。

这个阶段的电流较低。

3. 第一维凝胶电泳结束后，可使用pH梯度(pH gradient)的凝胶电泳或两种缓冲液浸泡在两边以建立静电场将蛋白质进一步扩散。

4.第二维电泳:将第一维电泳分离得到的凝胶嵌入到另一种凝胶中进行第二次电泳。

通常使用SDS-凝胶。

该凝胶使用离子溶液降解电荷，所有的蛋白质都将带有同样的电荷。

这个阶段的电流较高。

5. 染色和图像分析: 电泳结束后，可以用染色剂进行染色，如Coomassie蓝染色或银染色。

然后使用透射扫描或数字图像分析仪，获取电泳凝胶的图像，并进行质谱分析。

解析与解释:1.蛋白质双向凝胶电泳可以提供更高的分辨率和更好的分离效果，因为它结合了等电点聚焦和SDS-的优势。

2.在等电点聚焦过程中，蛋白质根据其等电点的差异而聚集在凝胶中的不同位置。

这一步骤可以将样品分离成多个窄条带，每个窄条带包含具有相似等电点的蛋白质。

3.在第二维电泳中，蛋白质将根据其分子质量而进一步分离。

较小分子量的蛋白质可以迁移到更远的位置，而较大分子量的蛋白质则停留在较近的位置。

4.通过染色和图像分析，可以将电泳凝胶的图像数字化并用于质谱分析。

这将帮助确定每个蛋白质的分子质量和相对丰度。

蛋白质双向凝胶电泳是一种非常有价值的蛋白质分析方法，尤其适用于分析复杂的混合物。

通过合理的操作步骤和解析方法，可以获得高质量的实验结果。

这些结果对于了解蛋白质的功能和相互作用，以及发现新的生物标志物具有重要的意义。

真菌总蛋白提取方法(双向电泳)

产品号 BB-3108 BB-3103 BB-3106 BB-3401 BB-3154 BB-3151 BB-3152
-1-
植物蛋白提取盒（2D 电泳用）细菌膜蛋白提取盒（2D 电泳用）
BB-3183 BB-3187
酵母蛋白提取盒（2D 电泳用） BB-3185 线粒体蛋白提取盒（2D 电泳用） BB-3191
使用方法：
1. 提取液制备：每 500ul 真菌蛋白提取液中加入 2ul 蛋白酶抑制剂混合物，混匀后备用。
2. 取培养真菌样本，在 4℃，3000g 条件下离心 5-10 分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集菌体。
3. 用冷 PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。 4. 将菌体置于研钵中用液氮研磨 5 分钟左右至粉末。若无液氮研磨条件，可直接
产品总蛋白提取试剂盒核蛋白提取试剂盒膜/胞浆/核蛋白分步提取试剂盒 Bradford 蛋白定量试剂盒 ECL 化学发光检测试剂盒细胞蛋白提取试剂盒细菌蛋白提取试剂盒
产品号 BB-3101 BB-3102 BB-3104 BB-3411 BB-3501 BB-3121 BB-3123
产品磷酸化蛋白富集试剂盒膜蛋白提取试剂盒活性蛋白提取试剂盒 BCA 蛋白定量试剂盒植物核蛋白提取试剂盒细菌膜蛋白提取试剂盒植物膜蛋白提取试剂盒
用蛋白提取液研磨。 5. 每 100mg 菌体中加入 500ul 蛋白提取液，混匀后，振荡 30-45 分钟。 6. 在 14000g 条件下离心 15 分钟。 7. 将上清吸入另一干净离心管，即可得到真菌总蛋白。 8. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验②。
相关产品：
真菌蛋白提取试剂盒

双向电泳--郭吉星PPT教学课件

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利用双向电泳可以分辩出5000—10000个蛋白质组分
分离得到的蛋白质组分纯度达到90%以上，可以稳定地保存在凝胶上
2020/12/09
6
注意
双向电泳分离的结果使蛋白质点而不是条带。根据
Cartesin坐标系统，从左到右是pI的增加，从下到上是分子
质量的增加。
PI增加
分子质量增加
2020/12/09
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PPT精品课件
谢谢观看
Thank You For Watching
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蛋白质双向电泳技术
—— 基本原理
2020/12/09
姓名：郭吉星学号：2010103024 任课老师：祝建波教授

双向电泳技术
双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
2020/12/09
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第二向SDS-PAGE
SDS-PAGE是利用SDS使蛋白质变性，多肽链变成长棒状，不同长短肽链间短轴基本相等，长轴长度与肽链长度成正比。SDS与蛋白质形成复合物，并且按1.4gSDS与1g蛋白质等比例结合（相当于两个氨基酸残基结合一分子的SDS）使之带上大量负电荷
2020/12/09
2020/12/09
2
双向电泳技术
第一向按蛋白质等电点的不同，每个蛋白质分子沿pH梯度迁移至与其等电点相等的位置

双向电泳--标准操作(完整版)

细胞裂解（蛋白质提取）一、试剂配置：PBS配方氯化钠(MW 58.44) 130mM 8g氯化钾(MW 74.5) 2.7mM 0.2g十二水和磷酸氢二钠(MW 358) 10 mM3.63g磷酸二氢钾(MW 136) 2 mM0.24g加水至1L配好后进行高压灭菌。

Washing buffer（500mL）配方Tris（MW 121.1） 10mM 0.605g蔗糖（MW 342） 250mM 42.75g加水溶解，用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22µm滤膜过滤（使用1M盐酸略高于2750uL调pH）裂解储液配方（细胞）：尿素(MW 60.06) 7M 4.2g硫脲(MW 76.12) 2M 1.52gCHAPS(MW614.89) 4%（W/V）0.4g 加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。

裂解储液配方（组织）：尿素(MW 60.06)5M3g硫脲(MW 76.12) 2M1.52gCHAPS(MW614.89) 2% 0.2gTris（MW 121.1）40mM 0.048g加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。

裂解液：裂解液储液 100uLIPG buffer（pH可选） 2% 2uLPi 2uLNucLease mix（100×） 1uLPMSF（100mM：20mg/mL） 1mM 1uLDTT（0.411g/mL） 40mM 1.5uLPi：每片使用200uL超纯水溶解后按10 uL分装考马斯亮蓝G-250：考马斯亮蓝G-250 0.01% 100g95%乙醇 4.7% 50mlH3PO4 8.5% 85g 将考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇中，与用水溶解的100ml H3PO4混合后稀释至1000ml，之后使用滤纸过滤。

苹果树腐烂病菌菌丝蛋白双向电泳体系的建立

苹果树腐烂病菌菌丝蛋白双向电泳体系的建立冯浩;王海英;冯雅琼;高小宁;韩青梅;黄丽丽【摘要】[目的]建立苹果树腐烂病菌菌丝蛋白双向电泳体系,鉴定不同致病力材料的差异表达蛋白,为从蛋白质组学角度揭示苹果树腐烂病菌致病机理奠定基础.[方法]以苹果树腐烂病菌野生型03-8菌丝为材料,从蛋白提取方法、IPG胶条长度及胶条的pH范围3个方面对双向电泳体系进行优化,并利用该优化体系对苹果树腐烂病菌野生型03-8和致病力丧失突变体X900的菌丝蛋白进行双向电泳分析和比较,对二者的差异表达蛋白进行鉴定和分析.[结果]采用TCA/丙酮法-SDS/酚蛋白抽提法及17 cm pH 4.0～7.0 IPG胶条,对苹果树腐烂病菌菌丝蛋白进行双向电泳可以得到理想的蛋白图谱.利用该体系对苹果树腐烂病菌野生型菌株03-8及其致病力丧失突变体菌株X900的菌丝总蛋白进行双向电泳分析发现,2个菌株共存在27个差异表达蛋白点,其中有15个显著差异表达蛋白点;质谱分析结果表明,突变体X900中缺失的2个蛋白点4633和8518分别为丝氨酸苏氨酸蛋白激酶和假想蛋白,其他13个显著差异表达蛋白点分别为1个微管蛋白、1个线粒体内膜转移酶亚基、1个丙酮酸脱羧氧化酶、1个腺苷高半胱氨酸激酶、2个压力诱导的磷蛋白、1个己糖磷酸肌醇激酶、1个热激蛋白和5个假想蛋白.GO分析表明,该差异蛋白主要参与能量代谢、胁迫应答、细胞结构组成和未知功能.[结论]建立了适合苹果树腐烂病菌菌丝蛋白的双向电泳体系,并通过该体系分析获得了不同致病力材料的一系列差异表达蛋白.%[Objective] The research established a 2 DE gel electrophoresis system for identification of differentially expressed proteins from different virulent strains to provide theoretical basis for studyingpathogenesis from proteome level.[Method] The protein extraction method,IPG strip type for 2-DE gel electrophoresis,and pH ofmycelia protein were optimized.Then the differences in intracellular proteins between wild strain 03-8 and a no pathogenicity mutant X900 were analyzed under the optimized conditions and identified by mass spectrometry.[Result] The TCA/acetone-SDS phenol method for mycelia protein extraction with 17 cm IPG strip at pH of 4.0-7.0 were suitable for 2-DE gel electrophoresis to obtain ideal protein profile.With the seconditions,the intracellular proteins of wild strain 03-8 and mutant X900 were analyzed,and 27 proteins were differentially expressed,among which 15 showed significant difference in expression.Mass spectrometry showed that the protein points 4633 and 8518 lost in mutant X900 were serine threonine protein kinase and hypothetical protein.The other 13 proteins included one tubulin β,one mitochondrial membrane transferase subunit,one pyruvate decarboxylase,one adenosylhomocysteinase,2 stressinduced-phosphor proteins,one inositol hexakisphosphate kinase,one heat shock protein,and 5 hypothetical proteins.GO analysis showed that the proteins mainly involved in energy metabolism,stress responses,cell structure and unknown functions.[Conclusion] A suitable 2-DE gel electrophoresis system was established for mycelia protein of Valsa mali and a series of different proteins were determined from different virulent strains.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(045)006【总页数】8页(P155-162)【关键词】蛋白提取;双向电泳;蛋白质组;质谱鉴定;苹果树腐烂病菌【作者】冯浩;王海英;冯雅琼;高小宁;韩青梅;黄丽丽【作者单位】西北农林科技大学植物保护学院,旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院,旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院,旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院,旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院,旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院,旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S436.611.1+1由黑腐皮壳属真菌(Valsa mali Miyabe et Yamada)引起的苹果树腐烂病(Valsa canker)是苹果生产中的重大病害[1]，全面解析病菌的分子致病机理对该病害的有效防控策略的制定具有重要意义。

双向电泳操作步骤

3.1 全菌蛋白的制备将细菌接种于DMEM培养基，置于28℃培养箱培养18h。

参照Coelho 等（Coelho et al. 2004）的方法，略有改动。

用Wash buffer（10mmol/L TrisCl pH8.0，5mmol/L 醋酸镁）清洗细胞3次。

离心，细胞沉淀在Lysis Buffer( 7mol/L 尿素，2mol/L硫尿，1% IPG Buffer pH3-10或pH4-7，4% CHAPS，1% DTT，1%蛋白酶抑制剂，1%核酶抑制剂)中悬浮，使其浓度范围在5~10mg/mL。

置于冰上裂解2h。

13000r/min离心1h取上清，-80℃保存。

用2-D clean-up Kit 纯化蛋白，再用2-D Quant Kit测定样本中蛋白浓度。

3. 2 2-D Clean-Up Kit的使用方法（全程小心）蛋白质样本在1.5mL微型离心管中处理，所有步骤均在冰上进行。

1）将体积100μL的蛋白质样本（含1~100μg蛋白质）置于1.5mL微型离心管中。

加入300μL沉淀剂。

振荡或倒置搅匀。

冰浴中（4~5℃）培育15min。

2）加入300μL共沉淀剂，简单振荡混合一下，12000r/min离心5min。

3）将上清液尽量多地倾析或吸出，不要搅散沉淀。

保持沉淀不变，在其上面加入一层40μL共沉淀剂，冰上培育5min。

后离心5min，去上清。

4）往沉淀加入25μL蒸馏水或去离子水。

将管振荡5~10s，这时沉淀应散开，但并未溶解于水中。

在管中加入1mL洗涤缓冲液（在-20℃下至少预冷1h）和5μL洗涤添加剂，振荡直至沉淀完全散开。

-20℃下培育至少30min，每10min振荡20~30s。

5）将离心管以最大速度（至少12000r/min）离心5min。

小心地将上清液移走弃去。

此时应可见白色沉淀，将沉淀简单风干一下（不要超过5min）。

6）用裂解液溶解沉淀，以备第一向IEF电泳。

振荡管子至少30s，在室温下孵育，振荡或用移液管抽吸使之完全溶解。

双向电泳法在家蚕蛋白质分离中的应用

双向电泳法在家蚕蛋白质分离中的
应用
双向电泳法在家蚕蛋白质分离中的应用
双向电泳（Bis-Tris Electrophoresis）是一种高效、可重复性强的蛋白质分离技术，它在生物学研究中有着广泛的应用。

在家蚕蛋白质分离中，双向电泳也可以被用来进行有效的分离。

双向电泳法的原理是利用两种不同的电泳缓冲溶液，分别为酸性和碱性，将家蚕蛋白质溶解在其中，然后通过在两种缓冲溶液之间施加电压，让家蚕蛋白质随着电流移动，当家蚕蛋白质移动到两种缓冲溶液中间时，会因为环境pH变化而凝固，从而将它们分离出来。

双向电泳对家蚕蛋白质分离具有很多优势，首先，它是一种高效、快速的分离方法，能够在较短的时间内获得高精度的结果。

此外，它非常适合家蚕蛋白质分析，因为它能够将小分子量的蛋白质与大分子量的蛋白质进行有效的分离，这对于家蚕蛋白质组学研究非常有益。

此外，它还可以分离出复杂的家蚕蛋白质混合物，使得蛋白质的分析更加容易。

为了有效地利用双向电泳法，在进行家蚕蛋白质分离之前，应该先进行细胞裂解和蛋白质抽提，以获得家蚕蛋白质溶液。

其次，将抽提出来的蛋白质溶液添加到酸性和碱性缓冲溶液中，并且要确保每种缓冲溶液的pH值都足够适宜，以保证蛋白质的最佳分离效果。

最后，将两种缓冲溶液中的混合蛋白质放入电泳仪中，施加电压，让蛋白质随着电流移动，完成分离。

总之，双向电泳法在家蚕蛋白质分离中可以发挥其独特的优势，如高效性、可重复性等，使得家蚕蛋白质组学研究得以顺利进行。

双向电泳法问题回答

双向电泳法双向电泳法是一种用于分离蛋白质的方法，它可以将复杂的蛋白质样品划分成更小、更简单的部分。

通过该方法，人们可以更深入地研究蛋白质的结构、功能以及表达。

双向电泳法包括两个主要步骤：等电聚焦和SDS-PAGE。

等电聚焦利用电场的不同电势将蛋白质分离成在不同等电点停留的充电种类。

这些蛋白质将从水面通过凝胶的毛孔流动到其他场中。

最外部的电极会使凝胶中的这些蛋白质向相反方向移动，然后再进行SDS-PAGE步骤，通过蛋白质的大小来将它们分类。

尽管双向电泳法已经存在了很长时间，但它仍然是生物学研究人员中非常受欢迎的技术之一。

它可以用于各种样品，如人类组织、细胞培养物、微生物以及植物，这些样品都可以用来进行不同范围和实验室需求下的研究。

相比于其他蛋白质分析技术，双向电泳法具有许多优点。

例如：1. 高解析度。

双向电泳法可以将复杂的蛋白质混合物分离成百上千的谱带。

这使得研究人员可以在不同的谱带上针对不同的蛋白质进行研究。

2. 对小分子靶标进行优化。

一些较小的蛋白质，像激素和细胞因子，往往不能被其他分离技术轻易捕捉。

双向电泳法可以确保在凝胶中打出一个小谱带，并通过调整电泳参数来使这些小蛋白质也可以被检测到。

3. 无需标记。

使用双向电泳法，不需要先对样品进行标记，因为样品中的蛋白质被用电势和电压从样品移动到凝胶上。

虽然双向电泳法已经成为了研究蛋白质及蛋白质体系结构的主要方法，但是其也带来了许多挑战。

其中最重要的是凝胶表面的不均匀性，以及分子的截断现象。

凝胶表面的不均匀性会影响蛋白质的分离，而分子的截断现象则意味着某些蛋白质的片段可能比完整的蛋白质更容易被检测到。

总的来说，双向电泳法是对蛋白质研究进行更深入了解的重要工具。

它提供了高分辨率、高通量和无需标记的优点，仍在各种研究领域广泛应用。

随着基因和蛋白质测序技术的快速发展，相信它也将在不远的将来得到不断地改进和提升。

丝状真菌蛋白提取方法

BB-3104 BB-3411 BB-3501 BB-3121 BB-3123 BB-3183 BB-3187
活性蛋白提取试剂盒 BCA 蛋白定量试剂盒植物核蛋白提取试剂盒细菌膜蛋白提取试剂盒植物膜蛋白提取试剂盒酵母蛋白提取盒（2D 电泳用）线粒体蛋白提取盒（2D 电泳用）
BB-3106 BB-3401 BB-3154 BB-3151 BB-3152 BB-3185 BB-3191
用蛋白提取液研磨。 5. 每 100mg 菌体中加入 500ul 蛋白提取液，混匀后，在 4℃条件下振荡 15-20 分
钟。 6. 在 4℃，14000rpm 条件下离心 15 分钟。 7. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到真菌总蛋白。 8. 将上述蛋白提取物定量②后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验③。
丝状真菌蛋白提取试剂盒
产品组成：
产品组成规格
丝状真菌蛋白提取液蛋白酶抑制剂混合物
使用说明书
BB-3136-1 50 assays
25ml 100ul
1
BB-3136-2 100 assays
50ml 200ul
1
储存条件：蛋白酶抑制剂-20℃保存；蛋白提取液室温保存。
有效期：一年。
产品简介：贝博丝状真菌蛋白提取试剂盒适用于从各种丝状真菌中提取总蛋白。优化的裂解液配
使用方法：
1. 提取液制备：每 500ul 丝状真菌蛋白提取液中加入 2 4℃，3000rpm 条件下离心 5-10 分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集菌体。
3. 用冷 PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。 4. 将菌体置于研钵中用液氮研磨 15 分钟左右至粉末。若无液氮研磨条件，可直接

双向电泳的操作步骤

双向电泳的操作步骤一、第一向等电聚焦1、从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液,置室温溶解。

2、从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条，室温中放置10分钟。

3、沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。

在槽两端各1cm 左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。

注意：不要产生气泡。

否则影响到胶条中蛋白质的分布。

4、当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。

5、分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。

确保胶条与电极紧密接触。

不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。

同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。

如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。

6、在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。

需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。

7、对好正、负极，盖上盖子。

设置等电聚焦程序。

8、聚焦结束的胶条。

立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。

二、第二向SDS-PAGE电泳1、配制10%的丙烯酰胺凝胶两块,从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。

2、配制胶条平衡缓冲液I。

3、在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。

将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。

这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。

4、将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I。

将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

5、配制胶条平衡缓冲液II。

6、第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。

一种稻瘟病菌菌丝体全蛋白双向电泳样品的制备方法[发明专利]

专利名称：一种稻瘟病菌菌丝体全蛋白双向电泳样品的制备方法
专利类型：发明专利
发明人：周晓罡,余萍,姚春馨,董超,丁玉梅,陶南
申请号：CN201310533956.3
申请日：20131101
公开号：CN103592161A
公开日：
20140219
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种稻瘟病菌菌丝体全蛋白双向电泳样品的制备方法，选取TCA-丙酮法提取稻瘟病菌菌丝体蛋白，通过使用含DTT的预冷丙酮溶液漂洗沉淀并用4倍体积的预冷丙酮溶液沉淀溶于裂解液的样品蛋白，利用丙酮在水化液中对蛋白质样品进行二次沉淀，及加大TCA-丙酮试剂用量、延长处理时间，有效去除蛋白质样品中的杂质，获得纯净的样品蛋白沉淀，最后加入裂解液制备出适合双向电泳的高质量样品。

本发明制备氮胁迫条件下稻瘟病菌菌丝体蛋白双向电泳样品的方法快速可靠、简单易行，可获得较高质量且重复性较好的双向电泳图谱，便于后续的生物质谱分析鉴定蛋白，具有较大的实际应用价值。

申请人：云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所
地址：650223 云南省昆明市五华区莲华办事处学云路9号
国籍：CN
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