感受态细胞的制备与质粒DNA的转化
感受态细胞的制备和转化
感受态细胞的制备和转化或者：设计好实验项⽬，如正、负对照（参考如下表格，按表格内容操作）3.细菌培养液，各加⽆菌⽔⾄150µL（不超过200µL）涂LB/ Amp/IPTG/X-Gal平板（此步骤的⽬的是计算转化率）；对其余各项，分别各取⼀半涂布于LB/ Amp平板上，余下的转化液置4℃冰箱保存。
倒置平板，37℃培养12-14⼩时。
⼀般来说，含有活性半乳糖苷酶的细菌⽐⽆活性酶的细菌⽣长慢，故过夜培养后可见到毫⽶⼤⼩的阳性⽩⾊菌落⽽阴性的兰⾊菌落只有针尖⼤⼩。
5. 将上述菌液摇匀后取100µl 涂布于含Amp的筛选平板上，正⾯向上放置半⼩时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养⽫，37℃培养16-24⼩时。
6. 计算转化率，统计每个培养⽫中的菌落数。
转化后在含抗⽣素的平板上长出的菌落即为转化⼦,根据此⽫中的菌落数可计算出转化⼦总数和转化频率,公式如下：转化⼦总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积转化频率（转化⼦数／每mg质粒DNA）＝转化⼦总数／质粒DNA加⼊量(mg)感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积感受态细胞转化效率＝转化⼦总数／感受态细胞总数[注意] 本实验⽅法也适⽤于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。
但它们的转化效率并不⼀定⼀样。
有的转化效率⾼,需将转化液进⾏多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,⽽有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离⼼),才能较准确的计算转化率。
第四节注意事项与提⽰1. 倒平板时应避免培养基温度过⾼，若温度过⾼，则加⼊的氨苄青霉素会失效，且培养基凝固后表⾯及⽫盖会形成⼤量冷凝⽔，易于造成污染及影响单菌落的形成。
若⽤⼿掌感受培养基觉得很烫但尚可忍受时，培养基温度即为55℃左右。
制备好的LB/Amp平板可于4℃冰箱储存2个⽉，时间过长氨苄青霉素将会失效。
实验5：大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化报告
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态 细胞总数
五、注意事项
1、冰上操作； 2、无菌操作； 3、重悬细胞时操作要轻； 4、实验应设有阳性对照，以估计转化效率；
应设立阴性对照，以消除可能的污染及查 明可能的失败原因。
实验四 大肠杆菌感受
态细胞的制备和质粒 DNA转化
实验目的和要求
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态 细胞；
学习用热激法将外源基因导入感受 态细胞。
实验原理 实验材料 实验步骤 预期结果 注意事项
一、实验原理（CaCl2法、热激法）
1、几个概念
转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另 一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种 手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研 究的基本实验技术。
(一) 纯化及活化菌种（无抗生素的LB ）
单菌落
l mL培养液
冻存菌在新鲜LB
平板上，划线， 37℃培养16~20 h。
挑一单菌落接种到3 mL LB液体培养基 中，37℃培养过夜
取l mL培养液加到 100 mL LB液体培养 基中，37℃摇床培养 2~3 h ，当其OD600 为0.3～0.5时(细胞数 <108/mL)，立即取出， 冰浴10～15 min。
(二) CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
l、将菌液转移到两个冰冷离心管中，平衡 后于4℃，5000 r/min离心10 min，弃尽上 清(可用加样器将残余液体尽量去净)。— —收集沉淀
2、各加10 mL 0.1 mol/L冰冷的无菌CaCl2溶 液重悬细胞，于冰上放置15 min．于4℃， 5000 r/min离心10min，弃上清。 —— CaCl2洗涤细胞转化效率的因素
感受态细胞常用的制备方法
感受态细胞常用的制备方法常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
转化，是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。
进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
?α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。
当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-?-D 硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。
所以称这种现象为α-互补现象。
由互补产生的α－半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。
所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。
杆菌电转化感受态细胞制备经验过程实验步骤：1、将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养。
2、高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）。
准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备重悬浮细胞用。
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化
一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理〔一〕大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能承受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞外表正电荷增加，通透性增加，形成能承受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA〔重组质粒〕引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间发生。
目前对感受态细胞能承受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞外表的细胞壁构造发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：〔1〕发芽的芽孢杆菌容易转化；〔2〕大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；〔3〕适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的外表形成一种能承受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：〔1〕蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；〔2〕细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；〔3〕别离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进展探索，试图从实验中获得明确答复。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化[荟萃知识]
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行业知识
• CaCl2 法是目前常用的感受态细胞制备方 法，简便易行，且其转化效率完全可以 满足一般实验的要求，制备出的感受态 细胞暂时不用时，可加入占总体积15％ 的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此 CaCl2法使用更广泛。
行业知识
③ 彻底弃去上清液，再加入0.6mL冰冷的 0.1mo1／L CaCl2溶液缓和悬菌，冰浴10 min ； ④ 4000r／min离心10min； ⑤ 弃去上清液，加入0.2mL冰冷的0.1mo1/L CaCl2溶液缓和悬菌，冰上放置待用。
行业知识
• 质粒DNA的转化
① 分别用2个100µl感受态细胞悬液(如是冷 冻保存液，则需化冻后马上进行下面操 作：
大肠杆菌感受态细胞的制备 与质粒DNA的转化
行业知识
• 实验目的 • 实验原理 • 实验试剂 • 实验步骤 • 注意事项
行业知识
一、实验目的
• 了解转化的概念及其在分子生物学研究 中的意义。
• 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞 的方法。
• 学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并 筛选转化体的方法。
行业知识
四、实验步骤
• 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
①从E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于LB 液体培养基中，37℃振荡培养过夜。将该菌悬液 以1:30～100接种于LB液体培养基中，37℃ 250r/min活化培养2-3h至OD600=0.2-0.4时停止培 养;
②每人取1个离心管，加入1.5ml菌液，在冰上放置 10min后，于4℃，4000r／min离心2min（从这一 步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而 稳）；
25 生物化学实验--大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化【目的】1. 掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验方法和技术。
2. 熟悉大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验原理。
【原理】1. 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化原理细菌的生物学特性由于吸收外源 DNA 发生可遗传的改变叫转化，在基因克隆技术中，转化（ transformation ）特指以质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
转染（ transfection ）是指噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导入细胞的过程。
未经特殊处理的宿主细胞较难进行转化，细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。
重组 DNA 转化细菌的技术操作关键就是通过一定的方法，人工诱导细菌进入一个敏感的感受态，以便外源 DNA 进入细胞内。
本实验采用氯化钙溶液处理对数生长期的E.coli. DH-5α细胞 , 使E.coli. DH-5α细胞的通透性增加，摄取外来 DNA （本实验中的质粒 DNA 为 pUC-18 ）能力增加，其原理为当细菌处于0 ℃ ， CaCl 2 低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNAase 的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃ 短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。
2. 转化大肠杆菌的筛选由于 pUC-18 （如图）含有 Amp r （氨苄青霉素抗性）基因便具有在含 Amp 培养基上生长的能力，形成单个菌落，而未转入 pUC-18 的E.coli. DH-5α细胞，不具有 Amp r 基因，在含 Amp 的培养基中，生长受到抑制，不能形成肉眼可见的菌落，从而使转化和未转化宿主细胞得以区分开来。
进一步将转化菌涂布在含IPTG 和 X-gal 的 LB 平板上，由于 pUC-18 还带有一段大肠杆菌β- 半乳糖苷酶基因（ lacZ ）的启动子及其编码α- 片段的 DNA 序列，此结构成为lacZ ＇基因，在 lacZ ＇基因中的靠近 5 ＇端有一段多克隆位点（ MCS ），而大肠杆菌含有β- 半乳糖苷酶ω片段的编码基因，尽管载体和宿主编码的这两个片段都没有活性，但两者同时存在时能够融为一体，形成具有酶活性的蛋白质，这样 lacZ 基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α- 互补。
感受态的制备与转化,质粒提取(原理和操作步骤)
感受态的制备与转化，质粒提取（原理和操作步骤）感受态细胞: 理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。
即指细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA并使其基因型和表现型发生相应变化的能力。
如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。
一般来说,感受态细胞的最基本要求是：1、没有质粒2、容易被转进去（一般是G-细菌，细胞壁薄）3、营养条件一般，非苛养菌CaCl2法：操作原理：1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。
2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。
进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。
意义：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。
实验材料：E. col i DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA；eppendorf管。
试剂:1.LB固体和液体培养基2.Amp母液(储存浓度50mg/ml)3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
4.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
感受态细胞的制备与转化
感受态细胞的制备与转化高中生物学选择性必修三基因工程中对于细菌作为表达载体的受体细胞，只是简单地说“先用Ca2+处理使之成为感受态细胞”，但如何制备感受态细胞并使其转化未作详细说明。
常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。
所谓的感受态细胞，即指受体(或者宿主)最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。
通俗的讲，就是受体细胞经过一些特殊方法(如：CaCl2，RuCl3等化学试剂法)处理后，细胞膜的通透性变大，能够容许外源DNA分子通过，这时的细胞就称为感受态细胞。
一般来说，感受态细胞的最基本要求是：1. 没有质粒(也可以有与待转质粒复制子兼容的质粒)2. 容易被转进去(一般是G-细菌，细胞壁薄)3. 营养条件一般，非苛养菌在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法(如：电击法，CaCl2等化学试剂法)处理后使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
化学制备法大肠杆菌的转化常用化学法(CaCl2法)，该法最先是由Cohen于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。
感受态细胞的制备及重组质粒的转化
思考题
影响CaCl2法转化率的因素有哪些？如何提 高转化率？ 如何利用抗性筛选出重组克隆？
感受态细胞的制备及 重组质粒的转化
experiments of molecular biology
演讲者：
分：分离外源基因目的基因。
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转：转化宿主细胞，使复制子可以扩增复制。
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切、接：利用酶学方法，将外源基因与载体连接，形成复制子。
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筛：筛选含有目的基因的细胞(转化子)并扩增以获得目的基因克隆。
实验原理
C
B
A
抗Amp
宿主细菌
含Amp培养基
实验仪器、材料
．超净工作台 ．高速离心机 ．恒温摇床 ．恒温培养箱 ．恒温水浴锅 ．制冰机 ．移液枪
实验材料、试剂
大肠杆菌JM109菌株 重组质粒 3．1.5mL 离心管，Tip头 试管、培养皿
LB液体培养基 含有Amp的LB平板培养基（终浓度为50µg／mL） 氨苄青霉素贮存液（浓度50mg／mL） 4．0.1mol/L CaCl2溶液
受体菌的培养
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质粒向感受态大肠杆菌细胞的转化
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感受态细胞的制备
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实验 安排
单击此处添加小标题
实 验 安 排
一、受体菌的培养
从新活化的E.coli JM109平板上挑取一单菌落，接种于3ml LB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。（已做） 将该菌悬液以1:50转接于50ml LB液体培养基中，37℃ 250rpm振荡扩大培养约1-2h，当OD600nm值为0.3～0.5时，取出置冰浴。
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究一、本文概述本文旨在深入研究枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备方法，以及质粒转化技术在枯草芽孢杆菌中的应用。
文章首先将对枯草芽孢杆菌的生物学特性进行简要介绍，包括其生理结构、生长环境及其在生物技术领域的重要地位。
随后，将详细阐述感受态细胞制备的原理和步骤，包括细胞的诱导、处理和保存等关键环节，并对不同方法进行比较分析，以找出最佳制备条件。
在此基础上，本文将深入探讨质粒转化技术在枯草芽孢杆菌中的应用。
质粒转化作为一种高效的基因转移手段，对于枯草芽孢杆菌的遗传改造和功能研究具有重要意义。
文章将详细介绍质粒转化技术的操作流程，包括质粒的选择、转化条件的优化以及转化效率的评价等方面。
本文还将对枯草芽孢杆菌感受态细胞制备及质粒转化方法的应用前景进行展望。
随着生物技术的不断发展，这些方法在基因工程、生物制药、环境修复等领域的应用潜力将逐渐显现。
通过本文的研究，旨在为相关领域提供可靠的技术支持和实践指导。
二、枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备制备枯草芽孢杆菌感受态细胞是质粒转化的关键步骤之一，它涉及到细胞的生长、处理和储存等多个环节。
以下是详细的制备过程：菌种复苏与活化：从低温保存的菌种库中取出枯草芽孢杆菌菌种，在LB固体培养基上进行划线接种，然后将其置于37℃恒温培养箱中倒置培养，待菌落长出后，挑选单个菌落进行活化。
种子液制备：将活化后的菌落接种到LB液体培养基中，以一定的转速（如200rpm）在37℃下振荡培养，直至达到对数生长期。
感受态细胞制备：将种子液按照一定比例接种到新鲜的LB液体培养基中，继续培养至OD600达到4~6。
然后，将培养液转移到预冷的离心管中，冰浴10分钟，以4℃、4000rpm的条件离心10分钟，收集菌体。
细胞处理：去除上清液，用预冷的感受态细胞洗涤液轻轻悬浮菌体，冰浴10分钟，再次离心收集菌体。
重复此步骤一次，以彻底去除培养基中的盐分。
实验五农杆菌感受态细胞的制备和质粒转化
感受态细胞制备的原理
• 感受态细胞制备的原理是细菌在低温和低 渗氯化钠溶液中，菌细胞壁通透性增加。
实验原理
• 转化方法：电击法、 CaCl2、 NaCl等化 学试剂法 • 感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性 发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通 过时细胞的状态。 • 转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子 的受体细胞( TransfoKan培养基
影响转化率的因素
• • • • 细胞生长状态和密度。 转化的质粒 DNA 的质量和浓度。 试剂的质量。 防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。
实验试剂
农杆菌LBA4404 YM培养基， 0.1mol/LNaCl溶液（预冷） 20mM CaCl2溶液（预冷） 卡那霉素（50mg/ml） 质粒DNA （上周日提取）
2.挑取单菌落接种到40ml YM液体培养基（硫酸链 霉素，25mg/ml）中，28℃条件下，250rpm悬 浮培养12-20小时。
3．在超净工作台上将菌液转入灭过菌的50ml离心管 中，4℃ ，5000×rpm离心8min。 4．在超净工作台上弃上清，用100mM NaCl （4℃ 预冷）重悬农杆菌，4℃， 5000×rpm离心8min。 5．在超净工作台上弃上清，加入原始农杆菌菌液 1/50体积（800ml）的20mM CaCl2溶液重悬菌体， 并分装成500ml/管。 6．将分装后的离心管置于液氮中10秒，-80℃保存。
农杆菌感受态细胞的制备
1.将农杆菌LBA4404（抗硫酸链霉素，25mg/ml）接 种在YM平板上，26-28℃ 培养48小时。
YM培养基的配方：酵母提取物0.4g/L；甘露醇 10g/L；NaCl 0.1g/L；MgSO4 0.1g/L； K2HPO4 0.5g/L；琼脂粉 15g/L pH：7.2-7.4
感受态细胞的制备与质粒DNA的转化
二、 转化 1、取200μl感受态细胞悬液置冰上。 2、加入1-10ulDNA,轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。 3、42℃水浴中热击2min，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。 4、向管中加入1ml LB液体培养基,混匀后37℃振荡培养 45min-1小时。 5、将上述菌液摇匀后取200μl 涂布于含Amp的筛选平板上, 待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。 对照： 另取未转化感受态细胞分别涂布筛选平板（Amp终浓度 50ug/ml）和空白平板
2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是 超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度 在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或 体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使 50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液 的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
一、原理
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞, 使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分 子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl) 等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性 的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞 (Competent cells)。将经过转化后的细胞在筛选培养基 中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源 DNA分子的受体细胞)。
3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是 最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好 分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程 均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的 试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或 杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必 要的麻烦。
实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化(板书)
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化（8学时，6小时）一、实验目的：通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞制备及转化的方法和技术。
二、实验原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态称感受态。
其原理是细菌处于0℃、CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。
经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA质粒。
将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型得到表达，然后将此细菌培养物涂在选择性培养基上。
三、仪器、材料和试剂：（一）仪器：1.超净工作台2.离心机3.恒温摇床4.高压灭菌锅5.移液枪6.振荡器7.天平8.恒温水浴9.离心管10.锥形瓶（二）材料：1.大肠杆菌DH5α2.氯化钙3.胰蛋白胨4.氯化钠5.酵母提取物6.琼脂粉7.羧苄青霉素8.NaOH9.pUC-18质粒DNA（三）试剂：1. 0.1mol/l CaCl2溶液2. LB液体培养基3. LB固体培养基4. 50mg/ml羧苄青霉素。
5.70%酒精四、实验步骤：（一）大肠杆菌感受态的制备1.从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于3ml LB液体培养基的试管中，37℃震荡培养过夜。
2.取1 ml菌夜转接到一个含有50ml LB液体培养基的锥形瓶中，37℃震荡培养2-3h（此时，A600应在0.4-0.5之间，细胞数务必﹤108/ml，此为实验成功的关键）。
3.用移液枪取1ml菌液转移到1.5ml离心管中，冰上放置10min。
（1000µl的枪，蓝色枪头，旋转不要太快，不能超过量程。
）（每组做两管）4.离心10min（4000r/min）。
（离心机，严禁空转和不平衡，使用之前用太平平衡，对称放。
上离心机之前，用卫生纸擦离心管。
不要贴标签。
用记号笔标记就可以。
盖紧离心管口。
盖好离心机内盖）5.倒出培养液，将管倒置1min，以使培养液流尽。
（在超净工作台中操作，在同一离心管中重复3-5步骤两次）6.用冰冷的0.1mol/l CaCl2200µl悬浮沉淀（用振荡器），立即放在冰上保温30min。
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（一）CaCl2 转化法 核心：目标细胞在 CaCl2· 2O 溶液中浸泡一段时间， 转化效率 H 107-109 cell/ 。 gD NE.coli: DH5 TG1, XL-1Blue, JM105 , （1）冰上 30min （2）热激 42℃ 90“ （3）恢复 1～2min （4）复苏 37℃ 45-60 min （二）原生质体转化法（protoplast） 适用于 G+ 细菌，特别是芽胞杆菌、酶母。 过程： （1）等渗环境下，脱细胞壁（Lysozyme） （2）细胞壁再生 （三）电转化法（electroporation） 缓冲液：10% 甘油或蔗糖，含（或不含） Mg2+ 离子。 转化条件：2.5 KV/0.2cm 25F 200-400 。1.Biblioteka 1.2.3.
未加IPTG/X-Gal或 其失效 抗生素失活，敏感 菌亦能生长 用于制备感受态的 菌株退化，丢失了 某些重要因子
对 策
2. 3.
检查平板是否含有IPTG/XGal 以及是否新鲜,如平板有 问题，重新制备新鲜平板 复查抗生素的抗性 用于制备感受态的菌株，传 代次数不能太多（20代以内 为佳）
二、 转化 1、取200μl感受态细胞悬液置冰上。 2、加入1-10ulDNA,轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。 3、42℃水浴中热击2min，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。 4、向管中加入1ml LB液体培养基,混匀后37℃振荡培养 45min-1小时。 5、将上述菌液摇匀后取200μl 涂布于含Amp的筛选平板上, 待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。 对照： 另取未转化感受态细胞分别涂布筛选平板（Amp终浓度 50ug/ml）和空白平板
六、问题与讨论
1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质量？
2.如阴性对照中长出菌，原因？
3.还有哪些方法可以将外源基因导入受体细胞？各有什么 优缺点？
图1
图2
如果转化成功，由于质粒DNA上带有Amp抗性基因 导致本来Amp敏感的菌株也可以在含有Amp的LB固 体培养基上生长，如图1。如转化不成功则Amp敏感 的菌株和阴性对照不会在含有Amp的LB固体培养基 上生长，如图2。
问题一：转化后无克隆产生
原 因
1. 2.
3.
感受态细胞低效 抗生素使用错误 转化后立即涂板忘 记温浴
1. 2. 3.
对 策
使用高效率的感受态细胞 （106以上） 复查质粒抗性，使用正确 的抗生素 转化后温浴45min左右， 让抗性基因得以表达。
问题二：实验组只有白色菌落（没有蓝色菌落）
原 因
二、材料、设备及试剂
菌种 ：E. coli DH5a（空）、 E. coli K12（空） 设备 ：eppendorf管、微量取液器 (20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机， 涡旋振荡 器 试剂：LB液体培养基 、 0.1mol/L CaCl2 、 Amp
一、感受态细胞的制备 （一）、受体菌的培养 （二）、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) 1、将1.5ml（每人）培养液转入离心管中, 于4℃下3000g离心 10分钟。 2、弃去上清,用预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液1ml轻轻悬浮细胞, 冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。 3、弃去上清,加入200μl预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮 细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。 4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。
１．抗生素筛选法
菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基 因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等）这样只有转化子 才能在含该抗生素的培养基上长出。 本实验利用抗生筛选转化子。
２、互补法
现在使用的许多载体（如ＰＵＣ系列）有含有一个大 肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酸基 因（lacZ）的调控序列和头１４６个氨基酸偏码区。这 个偏码区中插入一个多克隆位点。 受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。当 外源基因插入时，二者溶为一体后，有β－半乳糖苷 酶表达， 在生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β －Ｄ－半乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色菌落。 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失 活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。 通过颜色 不同而区分重组子和非重组子。
3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是 最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好 分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程 均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的 试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或 杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必 要的麻烦。
感受态细胞的制备 与质粒DNA的转化
一、原理
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞, 使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分 子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl) 等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性 的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞 (Competent cells)。将经过转化后的细胞在筛选培养基 中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源 DNA分子的受体细胞)。
1、感受态细胞的制备
所谓感受态， 就是细菌吸收转化因子的生理状态。 关于感受态的本质与存在，说法很多， 目前主要有两 种假说： １．局部原生质体化假说－－感受态细胞的 表面形成一种能接受ＤＮＡ的酶位点， 使ＤＮＡ分子 能进入细胞。
CaCl2法是以Mendel和Higa（1970）的发现为基础， 其基本原理是：细胞处于 0 ～ 4 ℃， CaCl2 低渗溶液 中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表 面，经 42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 混 合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间， 促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐 药（ Amp r ）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细 菌菌落。
2.转化
ＤＮＡ分子转化分以下几步: １．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面； ２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入 受体菌，另一条降解； ３． 自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制 成双链； ４．表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。
3.重组子的筛选
这和受体菌：质粒ＤＮＡ的选择相关， 原则上要注意： １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌株； ２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原则而定。 重组子的筛选方法常用的有两种方法： 抗生素筛选法 互补法
2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是 超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度 在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或 体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使 50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液 的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
实验结果：下次实验观察并分析筛选结果
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因 素： 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接 或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油 保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌 液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好， 可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌 株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左 右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密 度过高或不足均会影响转化效率。