细胞原代培养与传代

有限细胞系，无限细胞系 细胞系 cell line 细胞株 cell strain
培养细胞的特性
培养细胞的生长方式
贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞 悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见 于各种造血系统肿瘤细胞
每代贴附生长细胞的生长过程
游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）
清洁液的配制
细胞培养基
干粉培养基和液体培养基
干粉培养基需使用者自己配制并灭 其优点是价格便宜。 菌，其优点是价格便宜。缺点是配 制过程繁琐， 制过程繁琐，质量不易控制 液体培养基是由专业厂家按标准规 模化生产，不仅质量得到保证， 模化生产，不仅质量得到保证，而 且使用十分方便
常用的培养基种类
RPMI-1640（标准型）、DMEMRPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖 ）、DMEM 标准型）、DMEM-低糖（标准型）、 ）、DMEM （标准型）、DMEM-低糖（标准型）、 5A、M199、F12等 McCoys 5A、M199、F12等
培养细胞生长的条件
1 细胞的营养需要 2 细胞的生存环境 温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3pH: 7.2-7.4 渗透压 3 无污染 4 无毒
常用仪器设备
超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管
如何避免沉淀物的产生? 如何避免沉淀物的产生
解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至 4℃至室温 ， 若血清 解冻血清时 ， 请按照所建议的逐步解冻法 ℃ ℃ 至室温)， 解冻时改变的温度太大(如 ℃ 解冻时改变的温度太大 如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。 ℃ ，实验显示非常容易产生沉淀物。 解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一， 解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发 生。 请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊， 请勿将血清置于 ℃太久。若在 ℃放置太久，血清会变得混浊，同时 血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。 血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。
目录
一． 二． 三．
细胞培养基本概念 细胞培养基本要求 细胞培养基本技术
细胞培养定义
定义： 定义：
模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其 生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程 等问题的研究。
优点： 优点：
1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性； 2．可控制： 各种物理、化学、生物等因素可调控； 3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、 免疫组织化学、原位杂交、同位素标记； 4．应用广： 不同物种、不同年龄、不同组织、正常或异常（肿瘤）；
培养基的选择
没有一定的标准，有几点建议可供参考：
1.
建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的 培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合 多种细胞。 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生 长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳 培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。
潜伏期
此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期 一般为6～24小时。
对数生长期：
细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
停止期（平台期）：
细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性
二、细胞培养基本要求
常用仪器设备 培养器皿 培养基 血清 其他细胞培养试剂
缺点： 缺点：
人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同； 当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中，百度文库间久了， 必然发生变化。
细胞培养的基本概念
传代： 传代： 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到 新的培养器皿中。 原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在 传代之前称为原代培养。
自动双重纯水蒸馏器
纯水仪
酶标仪
微孔板震荡器
培养器皿
Culture flask
Culture Plate
常用玻璃器皿清洗
浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（ 小时 小时）、 浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、 ）、刷洗 ）、酸泡 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、 ℃ 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干
压力蒸汽消毒器： 压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广 电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用干玻璃 电热干燥箱：
器皿消毒
滤器： 滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、
酶液等均采用滤过法除菌
超净工作台： 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境 紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料
接触抑制（ 接触抑制（Contact inhibition） ）
细胞相互接触时，将停 止增长； 细胞停留在细胞周期的 G0期； 转化的细胞却可以继续 生长导致细胞重叠堆积 生长。
细胞传代次数（ 细胞传代次数（Passage Number） ）
• 体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一 定的界限，称为“ Hayflick极限”。 • 传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次； 龟寿命200年，传代140次。 • 传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代； 幼 年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。
游离期： 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮期。此 时细胞质回缩，胞体呈圆球形。
10分钟一4小时
贴壁期：
细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时 贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白 （生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底 物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）
2.
3.
血清使用注意事项
1.
血清必须贮存于–20 ～ -70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用 完一瓶，可将40～45 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加 约10 %， 必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后 再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减 少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白 质凝结而发生沉淀。 热灭活（heat-inactivation）是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻之血清。此热处 理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般不建议作 此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。 勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较 不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质
原代培养与细胞系
原代培养 （primary culture） ） 从动物机体取出的进 行培养的细胞群。生 长缓慢，繁殖一定的 代数后（一般10代以 内）停止生长。 细胞株 （cell strain） ） 从原代培养细 胞群中筛选出 的具有特定性 质或标志的细 胞群，能够繁 殖50代左右， 在培养过程中 其特征始终保 持。 细胞系 （cell line） ） 从肿瘤组织 培养建立的 细胞群或培 养过程中发 生突变或转 化的细胞， 在培养条件 下可无限繁 殖 克隆 （clone）亦称无 ） 性繁殖系或无性 系。对细胞来说， 克隆是指由同一 个祖先细胞通过 有丝分裂产生的 遗传性状一致的 细胞群。
培养皿和培养板等表面消毒
超净台
超净工作台的工作 原理是利用鼓风机 驱动空气遁过高效 滤器除去空气中的 尘埃颗粒，使空气 得到净化。净化空 气徐徐通过工作台 面，使工作台内构 成无菌环境。
滤 器
CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37 ℃ ，5％CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： ①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖 微松，以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净。定期消毒 （90 ℃ ，14 h)。 ③箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中 以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。
谷氨酰胺
谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用， 谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添 由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4℃下放置 下放置7 加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4℃下放置7天 即可分解约50% 50%， 即可分解约50%，所以都是在使用前添加 配制好的培养液（含谷氨酰胺） 4℃放置 周以上时， 放置2 配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上时，要重新 加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺， 加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加 入培养液内 使用终浓度为1 使用终浓度为1-4mM 一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200mM 29.22g/L） 100倍浓缩液 200mM（ 一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200mM（29.22g/L） 谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml 2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成 配制方法为 ：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成 200mM的溶液 充分搅拌溶解后（应加温30℃），过滤除菌 的溶液， 30℃），过滤除菌， 200mM的溶液，充分搅拌溶解后（应加温30℃），过滤除菌，分 装小瓶， 20℃保存 使用时可向100ml培养液中加入0.5 2ml谷 保存， 100ml培养液中加入0.5装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入0.5-2ml谷 氨酰胺浓缩液，终浓度为1 氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4mM
血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。 血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。
若必须做血清的热灭活，请遵守 ℃ 分钟的原则， 若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均 分钟的原则 温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。 匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。
原代培养细胞的生命归宿
原代培养期 传代期 衰退期
细胞系资源
• The American Type Culture Collection (ATCC) • The European Collection of Animal Cell Culture (ECACC) • National Institute of Health (NIH), USA • National Cancer Institute (NCI), USA
2.
3.
4.
血清沉淀物
凝絮物：发生之原因有许多种， 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白 (lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成， 造成， 这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。 这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀 可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上清液可以加入培 去除， 物，可用离心 养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物， 养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会 阻塞过滤膜。 阻塞过滤膜。 显微镜下观察之“小黑点” 通常经过热处理之血清， 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形 成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点” 成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常 会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“ 会误认为血清遭受污染，而将血清放在 ℃中欲培养此“微生物“， 但在37℃环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖， 但在 ℃环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖， 但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言， 但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应 不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用， 不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换 另一批号的血清。 另一批号的血清。