三种细菌计数方法的比较

娄延会（1）吕明霞（2）

摘要：通过比较选择哪一种计数方法更适于产品中细菌总数的检测，以确定产品符合性。结果表明三种计数结果差异不显著，但三种结果可操作性及适用性不同。

关键词：活菌计数，混合平板法，悬滴法，涂抹法

活菌计数：选用适当的方法测得样品中的有效活菌量。其原理是通过将待检验样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液使样品中的微生物细胞充分分散，程单个细胞存在，再取一定量的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的选择性培养基内，经培养后根据在平板上长出的菌落计算出每克样品中的微生物数量。

1. 材料和方法

试验材料

菌种选用C83882 1565 血清型O2的大肠杆菌

宝来利来生产用枯草芽孢杆菌

试剂：营养肉汤固体及液体培养基高压灭菌

器皿：压力灭菌锅，9cm玻璃平皿，1ml,10ml刻度吸管若干支，玻璃棒，涂抹棒

2.方法步骤：大体包括含菌样品稀释液的制备，接种，适温培养，计数，确定样品含菌量计算

菌悬液的制备：取C83882 1565 血清型O2的大肠杆菌一环接种于100ml灭菌营养肉汤液体培养基中，37℃，150转/分钟培养20小时，制备成菌悬母液，用灭菌刻度吸管取1ml母液到盛有9ml灭菌生理盐水的试管中，振荡摇匀，即得10-1稀释液，再用1ml无菌吸管吸取10-1稀释液1ml到装有9ml灭菌生理盐水的试管中，充分振荡摇匀（或吹吸三次使之混匀），即得10-2稀释液，逐次类推，每次更换吸管连续稀释，则制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等一系列样品稀释液供接种用。

芽孢菌菌悬液取自宝来利来液体深层发酵罐

接种培养

混合平板计数法

确定采用稀释度（大肠杆菌选10-5、10-6、10-7芽孢杆菌选10-6、10-7、10-8）后，取无菌培养皿，分别注明样品名称、稀释度、操作日期等，每个稀释度设三个重复，然后，安无菌操作要求，分别用1ml灭菌吸管吸取1ml各稀释度下的稀释液放入标记为各稀释度的培养皿中，然后按无菌操作法在各皿中分别倾注已熔化并冷至45℃～50℃左右的具有选择性的培养基约15ml,轻轻转动平皿使稀释

液与培养基充分混合均匀，待凝固后，将培养皿倒置，适温培养，至长出菌落后即可计数。

涂抹平板计数法：

先在每一灭菌平皿中倾注15ml左右的固体培养基，制成平板，做好标记，每个稀释度三个平行，然后用无菌吸管吸取样品稀释液对号接种在不同稀释度的培养皿中的琼脂平板上，然后分别用无菌玻璃涂抹棒将稀释液涂布均匀，平放桌上约20～30分钟，使稀释液渗透于培养基中，然后将培养皿倒置，37℃培养，至长出菌落，即可计数。

悬滴法

平板倾注同涂抹法，之后将制备好的琼脂平板在37℃培养箱中预培养48小时使平板表面变得比较干燥，将制备好的平皿划为四个区，用无菌吸管吸取样品稀释液对号滴种在相应稀释度的培养皿中的琼脂平板上，平稳放置10～20分钟待液滴完全渗入培养基中，将平板倒置培养于37℃培养箱中培养至菌落长出可数。

3结果

方法与菌种稀释度混合平板计数法涂抹法悬滴法

大肠杆菌芽孢菌大肠杆菌芽孢菌大肠杆菌芽孢菌

10-5 ›300 ›300 ›300 \ \ \

10-6 233、211、211 ›300 42、45、45 \ 25、23、24 43、43、39

10-7 22、21、21 ›300 4、3、5 80、81、83 \ \

10-8 \ 43、40、41 \ \ \ \

结果亿/ml

4、讨论

通过此次对比试验，三种方法计数结果差异不显著，但就其可操作性而言，还是推荐大家使用混合平板计数法。

三种方法稀释步骤是相同的，操作起来各有优缺点。

涂抹法：

1）、有菌液涂不匀的现象，会使最终结果平行性不好，使最终结果偏低；

2）、涂抹棒在使用过程中消毒不好会使不同稀释度之间产生混淆，出现不同稀释度之间长出的菌数雷同，致使结果不准确。

悬滴法:

1)、平板制备比较费时间，若有紧急待测样品无法在最短的时间内出具结果。

2）、制备好的平板若不符合要求，一般水分过多，会使菌悬液不能很好的渗人培养基中，出现流淌现象，使平皿中的不同稀释度之间污染；同一平皿中若为统一稀释度，会出现长成片的现象。导致数据不准确。

这两种方法需要有一定操作基础的人员才有可能做的较好,比较而言,混合平板计数法能避免以上缺陷,时间也不需很很长,无需进行培养基预培。