生化检测方法汇总

一、血清谷丙转氨酶（SGPT）赖氏改良法

器材：试管及试管架、移液器或吸量管、恒温水浴锅、721型分光光度计、温度计、动物血清

试剂：

（1）O.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液：

①O.1mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取Na2HPO414.22或Na2HPO4 2H2O17.8g溶解于蒸馏水

中，并稀释至1 000ml,4 C保存。

②O.1mol/L磷酸二氢钾溶液：称KH2PO413.61g§解dH2O中，稀释至1000ml,

4 C保存。

③将0.1mol/L磷酸氢二钠溶液420ml和0.1mol/L磷酸二氢钾溶液80ml混和即

为0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴，4C保存。

（2）标准丙酮酸（含丙酮酸2.0卩mol/mL）:

取标准丙酮酸钠10mg用上述缓冲液准确定容为50mL此液须当日用当日配。

（3）SGPT底物液（含a -酮戊二酸2卩mol/ml及DL-丙氨酸200卩mol/ml）: 取a -酮戊二酸29.2mg, DL-丙氨酸7g ,用试剂1溶成100ml,在稀释到刻度前，以1mol /L NaOH调pH 7.4 （因为转氨酶在pH7.3以下或7.6以上的环境中酶活性下降），加数滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用4天。

（4）GOT底物液（DL -天冬氨酸200mmol/L , a -酮戊二酸2mmol/L）:称取a -酮戊二酸29.2mg 和DL-门冬氨酸2.66g置于一小烧杯中，加入1mol/L氢氧化钠20.5ml使溶解,并校正pH 至

7.4,然后将溶液移入100ml容量瓶内，用0.1mol/L磷酸盐缓冲液定容至刻度。放置冰箱内保

存。

（5） 2.4-二硝基苯肼溶液：

取分析纯2,4-二硝基苯肼19.8mg,用1mol/L HCl溶于100ml，置棕色瓶中保存。

（6）0.4mol/L NaOH 溶液：

称取16g固体NaOH用蒸馏水溶解，冷却至室温，定容至1000mL备用。

操作步骤：

0.1M磷酸盐缓冲液PH7.4( ).10.10.10.

10.10.1

相当于谷丙转氨酶单位028*********

0相当于谷草转氨酶单位0246111

4

U190——每个样做3个平行，置37水浴30分钟，各管加2, 4-二硝基苯肼液0.5mL,混匀，再在37C 水浴中放置20mL各管加0.4mol/L氢氧化钠溶液5mL混匀，10分钟后，从水浴箱中取出，以蒸馏水调“零”点，用520nm波长比色，读取各管之吸光值，各管之吸光值均减去空白的吸光值，然后以吸光值为纵坐标，各管相应的转氨酶单位为横坐标。绘制成标准曲线。为了方便，可列出各光度相当于转氨酶单位表。

2、酶活性测定：取试管两支，注明测定管及对照管。

试剂样品测定（每个

样今3个平行）|对照（每个样3个平行）

血清（mL0.10.1

SGPT或SGOT底物(mL0.5——1

置37r水浴30分钟（SGO■为37C, 60分钟后再加枸橼酸苯胺1滴）

2.4-二硝基苯肼（mL0.50.5

置37 r水浴20分钟

SGPT或SGOT底物(mL——0.5 NaOH溶液（mL 5.0 5.0

对照及样品各做3个平行，充分摇匀，静置10分钟后，用520nm波长比色，以蒸馏水调节零点，读取吸光值，用样品减去对照吸光值，求得样品的谷丙转氨酶活力

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谷丙转氨酶活性单位:

37 C, pH7.4，每小时每毫升血清催化生成1卩mol丙酮酸为1个单位。例：0.1ml 血清每小时催化生成0.1卩mol丙酮酸,即相当于GPT 100U / 100ml血清。

注意:

1. 在测定SGPT寸，应事先将底物、血清在37C水浴中保温，然后在血清管中加入底物，准确记

时。

2. 标准曲线上数值在20~500U是准确可靠的，超过

500U时，需将样品稀释。

3. 转氨酶只能作用于a- L-氨基酸，对》氨基酸无作用。实验室多用a—DL—氨基酸（较L —氨基

酸价廉），若用L —氨基酸，则用量减半。

4. 溶血标本不宜使用，因血细胞中转氨酶活力较高，会影响测定效果。

5. 血清样品的测定需在显色后30分钟内完成。

6. 丙酮酸标准液的浓度要求十分精确。由于丙酮酸开封后易变质为多聚丙酮酸，而影响丙酮酸标准液的有效浓度而不易察觉。建议使用质量可靠的市售丙酮酸标准液。

7. 每批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过0.015A，若有超出，应仔细检查试剂与仪器方面的问题。

8. 严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本

可增加测定的吸光度，测定这类标本应做血清标本对照管

优点：尽管基质液中余下的a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝醌化合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对505nm的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用标准曲线作测定时,所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，结果比其他比色法准确.故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续监测法的单位使用赖氏法.1981年全国常规生化检验方法学术讨论会认为赖氏法测定ALT活性较为合理，缺点：由

于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足，反应速度只能达到最大速度的65%;显色剂2,4- 二硝基苯肼的用量只及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后,新生成的丙酮酸

和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控制的竞争显色的几率问题，如此等等,使赖氏法的重

现性较差,在测量精度上仍与连续监测法相差甚大.

* 1个卡门氏单位的定义是：在温度25C，pH7.4,波长340nm光径1cm 的条件下，1ml血清使NADH勺吸光度下降0.001的转氨酶活性。

*国际单位：在最适温度（25C）下，1分钟产生1卩mol丙酮酸的酶量为1 个活性单位，即

1IU=1umol/min。

King法单位定义是：每1ml血清在37 C条件下与底物作用60 min，生成1卩mol丙酮酸称为一个单位。

Mohun法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4, 37C条件下与底物作用30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。

尿素氮（BUN ）（二乙酰一肟法尿素测定）

（一）仪器设备：水浴锅、紫外分光光度计、10mL试管

（二）试剂：

1、尿素氮试剂：蒸馏水100mL，浓硫酸44mL85%磷酸66mL，冷却至室温后，加氨基硫脲50mg