临床生化实验方法的选择和评价

注意事项 被试验的物质：胆红素、溶血、防腐剂、抗凝剂、药物等

可疑干扰物的浓度：干扰物浓度有可能达到病理标本最高 浓度值。 本试验检测的误差包括方法特异度不高和干扰物作用引起 的误差。
消除干扰常用方法 空白对照：试剂空白：常见
标本空白：



物理、化学方法分离干扰物 双波长或多波长法检测排除干扰 误差较大又无法消除，则改进或更换方法。
④应用安全可靠。
（2）可靠性
一般具有较高的精密度和准确度， 以及较大的检测能力。
2、方法选择的步骤
1）广泛查阅资料
根据方法选择的要求对已发表的各种方法进行 比较与检验，确定哪些方法有充分的科学根据 及真实的使用价值。必须仔细分析各种方法的 特点，选择适合于本实验室具体条件的方法， 并且要判断所选方法能否满足本室工作的需要。
2）选定侯选方法
经初步选定的方法称为候选方法。候选方法
确定后，应该写出该法的原理与参考文献， 所用仪器、试剂的来源、牌号、纯度（或配 套试剂盒），标本收集要求，详细的操作步 骤，标准曲线和结果计算，文献中列出的性 能指标，参考值与参考范围，以及其它应注 意的事项与安全防护措施等。
3）进行初步试验 为了实用的目的，初试应该包括 ①标准曲线及其重复性； ②质控血清或新鲜标本的重复试验；
２）参考方法（reference method ）：
已知其准确度和精主工，干扰因素少，系统误差很 小。有适当的灵敏度、特异性及较宽的分析范围。在 条件许可的实验室中经常使用。 用途：主要用于鉴定常规方法和试剂盒、鉴定二级标 准品，为质控血清定值等 缺点：技术性要求高，费用贵，设备要求较高，测定 时间较长
③分析待测物浓度不同的标本，与公认的参考
方法的测定值作对比； ④要有足够的试验证明仪器与试剂能符合要求。
二、实验方法的评价 （一）评价实验与分析误差类型的关系 1、方法学评价：通过实验途径测定并评价方法 的精确度和准确度，在实验中测定的是不精确 度和不准确度，强调的是误差，评价实验的过 程就是对误差的测定。
参考值在临床应用中应注意的问题
①参考值的使用有一定的范围，仅适合于符
合参考个体要求的参考人群。 ②参考值范围通常定为 ±2S，有时称为95% 可信区间，即此范围仅覆盖研究人群的95%， 因此，参考值范围不能盲目地作为正常与疾 病的分界点。 ③综合评价，参考值在作为诊断和监测目的 使用时，应注意年龄、性别、饮食、药物、 个人习惯和体力锻炼等因素的影响。
2、实验误差
实验误差：测定值与真值之差
1）系统误差（systematic error， SE） ：一系列分析测定的 结果对真值或靶值存在有同一倾向的偏差。一般由恒 定因素引起，重复测定，重复出现，消除系统误差可 提高测定的准确度。 分为： 恒定误差：由干扰物引起的使测定值与真值存在的误 差，与干扰物浓度相关，与被测物浓度无关。 比例误差：相对于被测物浓度有相同的百分比误差， 误差的绝对值与被测物浓度成正比。
2、回收试验
回收是指候选方法准确测定加入常规分析标本 的纯分析物的能力，用回收率表示。 本试验的目的是检测候选方法的比例系统误差。
1）方法 将被测物标准液加入病人标本中，成为分析标 本；原病人标本中加入等量的无被测物的溶剂作基础标本； 然后用候选础标本测得浓度。 X 标准液浓度 病人样品量（ml） +标准液量（ml） 回收浓度 X 100% 加入浓度 标准液量（ml）
方法基本与回收试验一样，但在病人标本中加入的是疑有干 扰或非特异性反应的物质。将可能引起干扰的物质配成一定 浓度的溶液，加到病人标本中成为干扰分析样本，原病人标 本加入相同量的无干扰物质的溶剂作为基础样本，然后用候 选方法对此两种样本同时测定，两者之差即表示该干扰物质 产生的干扰所引起的误差，即干扰值。 干扰值=分析标本测得值-基础标本测得值
诊断特异度=
实际检查结果为阴性数 全部受检的未患病者总数 X100%
理想试验的诊断特异性为100%。
（二） 参考值与医学决定水平的确定
1．参考值
1）概念 参考范围：以95%的可信性为界，以X±2S表示
是指从某一参考个体或参考人群中获得的测定数值。
在临床检验中，将获得的观察值即某项检验结果与某个 标准的数据进行比较，借以对资料作出合理解释。
3）控制物：用标准品及参考方法定值。用于质控。
（二） 实验方法选择的要求和步骤
1. 实验方法选择的要求
国际临床化学协会（IFCC）提出：常规方法应具 有实用性和可靠性两方面的性能指标 。 （1）实用性
①微量快速能便于急诊，适合成套项目分析。
②费用低廉，包括劳动力与试剂、设备及一般管 理费用等。 ③方法简便。
标本来源： • 个体基础参考值 • 群体基础参考值
2）制订 （１）参考个体的选择
（２）测定方法的选择与标准化
（３）参考值及其范围的确定 • 单值估计：过高为异常，以单值上限为参考 值界限
• 区间估计：过高和过低均为异常，制定参考 值上、下限
注意事项：
①正确选择受检对象，以受检对象的确对所反映的总体具 有代表性和不存在对指标具有影响的因素为原则； ②合理规定参考人群的条件，如年龄、性别、民族、职业、 女性的月经期、妊娠和哺乳，以及标本采集的时间和地 区因素等； ③保证一定数量的受检人数，一般应有100例以上，若指 标分布呈偏态时应在120例以上，特殊情况至少也应30 例以上； ④测定方法应标准化，保证测定结果的可靠性和可比性。 ⑤根据专业知识确定单、双侧位界，严格按照统计要求进 行测定结果的处理。
3）常规方法（routine method ） ：

性能指标符合临床或其他目的的需要，有 足够的灵敏度、准确度和特异性，有适当的分 析范围，经济适用。这类方法经有关学术组织 认可后可称为推荐方法（recommended method ）。
项目 钙 氯 镁 磷 钾 钠 白蛋白 总蛋白 肌酐 尿素 尿酸 胆红素 葡萄糖 胆固醇 甘油三酯 AST（GOT ） ALT（GPT） 转肽酶（r-GT） 肌酸激酶
决定性方法 ID-MS
电量滴定法、中子活化法
ID-MS ID-MS ID-MS、中子活化法
重量分析法、中子活化法
参考方法 原子吸收分光光度法 电流滴定法 原子吸收分光光度法
ID-MS、离子交换层析法
ID-MS ID-MS —— ID-MS ID-MS ID-MS —— —— —— ——
火焰光度法 火焰光度法 免疫化学法 双缩脲法 离子交换层析法 尿素酶法 尿酸酶法（紫外法） 重氮反应法 己糖激酶法
(四)方法比较试验（对比试验）
用于检测候选方法的系统分析误差。对所得数据
进行分析，可提供系统误差的性质（恒定或／和 比例误差） 对一组病人的标本用候选方法和比较方法同时 进行分析测定，观察二者之间的差异。这是考验 候选方法是否可采用的重要措施。
①在进行临床化学常规方法的评价时，最好选
择参考方法作为比较方法 ②若采用已知偏差法，则有部分误差来自比较 方法（与已知偏差 一致的那部分误差），剩余 的则属于侯选方法。 ③若采用未知偏差法，分析误差可能来源于二 者之一或两者都有，难以分析。
小结：
实验方法的选择、分级、标准试剂的分级
实验方法的评价：实验误差、评价指标
参考值：概念、制定、应用
医学决定水平
作业：
如何选择生化实验方法，怎样对其进 行评价？
加入浓度＝
回收率（%）=
注意事项： 吸量准确； 加入标准液后，其实验样品的被子测浓度最好 达到医学决定水平； 总浓度必须在方法分析范围内； 需加入高中低不同浓度回收试验，计算平均回 收率； 加入标准液的体积一般在10%内； 重复2-3次。
3、干扰试验 干扰试验是用来检测候选方法的恒定系统误 差。干扰物浓度不同，误差大小也不同。
临床生化实验方 法的选择和评价
对于现代化临床化学实验室来说， 不但要准确报告实验数据，还要 了解实验数据的处理、考核和评 价实验方法，正确解释和应用实 验数据。
一、实验方法的选择
(一)实验方法和标准品的分级
1、方法的分级
1）决定性方法（definitive method ）
准确度最高，系统误差最小，与真值最接近， 需要 精密仪器，高纯度的试剂 用途：用于发展及评价参考方法和一级标准品。 缺点：技术要求太高，费用昂贵，设备要求高，测 定时间长
Abell-Kendall法，胆固醇氧化酶法
酶法 MDH-NADH法 LDH-NADH法 连续监测产物生成法 NAD+偶联法
ID-MS：同位素稀释-质谱分析法
2、标准品的分级
标准品是一种物质，它的一种或几种物理或 化学性质已经充分确定，可被用来校正仪器或证 实某种实验方法。 1）一级标准品：已确定的稳定而均一的物质，可用 于校正决定性方法、评价或校正参考方法，为 “二级标准品”定值。一级标准品都有证书，在 美国由国家标准局（NBS）发给合格证书，并指明 它的性质和有关数据。 2）二级标准品：由参考方法定值有关物质的量，主 要用于常规方法的标化或为质控物定值。
三、临床生化实验诊断试验的性能评价 （一）诊断试验的选择原则
1、临床灵敏度：诊断试验检出阳性病人的百 分率。 临床灵敏度=
实际检出阳性数 理论阳性数 X100%
理想试验的诊断灵敏度为100%。
2、诊断特异度
用诊断试验检出的阴性结果的百分 率，表示非患病者中诊断试验正确确定非 患病者的能力，又称为真阴性率。
2、医学决定水平
是一限值，可用来排除或确定某一临 床情况或预后将会出现某一生理变化现 象
一个诊断试验一般确定三个决定水平：
①提示需要制定进一步检查计划的阈值，相
当于待诊值； ②提示需要采取治疗措施的界值，相当于确 诊值； ③提示预后或需要紧急处理的界值。
ALT (U/L) 5～30 20 60 300
3、方法学评价指标： 1）准确度：测定值与真值之间的符合程度。 2）精密度：对同一标本用同一方法在同样条件 下多次重复测定，所得各次结果之间的符合程 度。 3）灵敏度：化学反应中能检出的最小量。 4）特异性：分析测定中只对某一成分起反应， 其他物质对反应毫无影响或基本无影响。 5）线性范围：实验方法所能检测标本中某物质 的浓度范围。
（二）方法评价实验
1、重复性实验：实验的目的是检测候选方法的随机误 差。方法是对同一材料(标准液、质控液、标本等)分成 数份试验标本进行多次分析测定
试验形式与方法 (1)批内重复性试验：用同一份标本在短时间内用候选 方法作多次(一般20次)重复测定。 (2)日内重复性试验：在一天内对一个或数个标本作数 批重复测定。 ( 3)日间重复性试验：将同一标本分成数份，按方法每 天测一次，连续测定20天观察结果变异。
引起原因： •方法误差：最严重、最难避免的误差，是 方法的分析性能所固有的缺陷所致。可通 过方法的选择和评价来减少。
•仪器和试剂误差：常见仪器波长未校准， 量器不准，试剂质量差等。
2）随机误差（random error，RE）：
是指在实际工作中，多次重复测定某一物质时引 起的误差。 误差没有一定的大小和方向。步骤越多，出现的 机会越多，不可避免，可减少。 主要见于：操作习惯，实验条件改变等。