基因表达载体的构建

Trp启动子
• 色氨酸启动子（ Trp）的阻遏蛋白在有色 氨酸时，二者结合，阻遏蛋白变构激活 而与启动子结合，阻止RNA聚合酶的转 录。无色氨酸时，阻遏解除，因β-吲哚 丙烯酸是色氨酸的竞争性抑制剂，常用 作诱导剂，诱发色氨酸启动子转录。 （如图6-5） 同时，衰减子对Trp转录也 有调节作用（如图6-6）
1. 启始密码子：表达效率 AUG>GUG>UUG
2. SD序列：较长的效率高，如 UAAGGAGG比AAGAA高三倍；SD序 列与AUG间距一般6-12bp，4-10bp较佳， 9bp最佳；SD序列的5’非翻译区，若有 5’-UGAUCU，则有增强作用。
mRNA的二级结构对翻译起始 的影响
• mRNA形成二级结构时，可产生茎环。 若SD序列、AUG位于茎环内或发夹内， 转译受抑制；在茎环外则有利于转译。 见表6-1
乳糖启动子（Lac）
• 无乳糖时，调节基因（I）产生阻遏蛋白 与操纵基因结合，阻止RNA聚合酶结合 进而阻止转录；有乳糖时，乳糖能与阻 遏蛋白结合，使其变构解离而行使转录 功能。如图6-2
• 而LacZ基因可由IPTG（异丙基硫代- β-D半乳糖）诱导转录。 Lac启动子改建 如 图6-3、6-4(a) (b)
• 一、启动子结构对表达效率的影响 • 二、表达载体的选择 • 三、外源基因（cDNA）中密码子的作用 • 四、mRNA的一级结构与基因表达 • 五、mRNA的二级结构对翻译起始的影响 • 六、mRNA稳定性的影响 • 七、转录终止区对外源基因表达效率的影响 • 八、转录后的若干因素与基因表达的关系 • 九、宿主选择对表达的影响 • 十、培养条件的控制对表达效率的影响
脂蛋白启动子（LPP）
• 脂蛋白为细胞外膜蛋白，细菌中含量高， 该启动子表达效率高，由信号肽可将基 因表达产物分泌到胞外，常用来构造分 泌型表达载体。
基因 D K U V
MU3 A C H L M J
起始密码子的结构特征
位于单链区域 位于碱基配对区域
是
否
是
否
是
否
是
否
是
否
否
是
否
是
是
否
否
是
否
是
是
否
蛋白产量的相对浓度 876 476 375 265 236 1 18 12 44 14 13
• 转录mRNA的AUG上游具有的，能与核 糖体发生有效结合和转译所需要的序列 （RBS），长度为3-9bp，距AUG3-11bp， 它与16srRNA3’末端（AUUCCUCCACDAG-5’）互补其互补程度、SD与AUG间 距等与转译效果有关。如图
表达载体类型
• 表达载体的类型主要有四种： 1. 非融合型表达载体，如PKK223-3 如图6-14 2. 分泌型表达载体，如PINⅢ-ompA1 如图6-15 3. 融合蛋白型表达载体，如PGEX 如图6-16 4. 包涵体型表达载体，如pBV220 如图6-17
二、基因表达的基本条件
• 1. 外源基因插入序列必须保持正确的方向和阅读框架。 其遗传密码不得缺失、遗漏、或错位及错码。否则会 导致编码错误的蛋白质分子，特别是目的基因序列内 部应不含两端酶切位点的识别序列。
• 2. 插入的外源基因必须放在原核的启动子控制之下， 也就是使原核的RNA聚合酶能够识别插入的基因。
第六章 外源基因在大肠杆 菌中的表达调控
• 第一节 基因表达的概述和基本条件 • 第二节 在大肠杆菌中影响外源基因
表达的因素
第一节 基因表达的概述和 基本条件
• 一、基因表达的基本概念 • 二、基因表达的基本条件 • 三、真核基因在原核细胞中表达及调控
第二节 在大肠杆菌中影响 外源基因表达的因素
mRNA稳定性的影响
• REP序列可阻止mRNA降解，偏爱密码子 也起保护作用。
真核基因在原核细胞中表达及调控的 特点
1. 只有一种RNA聚合酶 2. 以操纵子为单位来完成基因转录 3. 基因转录无RNA剪接功能 4. 因无核仁、核膜，核酸均为裸露的，转录与
翻译是连续进行的 5. 转录产物在多聚核糖体上合成，同时合成多
原核表达载体的构建的要求
• 完整的表达载体（质粒）应有强启动子 （P）、终止子（T）、多个酶切位点、 有抗性标记、复制子和RBS的SD序列。 （如图6-13）还应结合考虑：质粒的拷 贝能力和稳定性，转译蛋白的表达形式 和存放地点（分泌型/包涵体/融合蛋白）， 蛋白质的分子量、性质和稳定性以及选 择合适宿主细胞。
表达载体的选择
• 载体分子量不宜过大，以2.5-5.6kb为佳， 高拷贝，不同产物选用不同类型表达载 体。
外源基因（cDNA）中密码子 的作用
• 细菌中基因表达对密码子有偏爱性，不 偏爱的稀有密码子（AGA、AGG）表达 效果差，特别当有AGA-AGG连续序列存 在时表达效率低
mRNA的一级结构与基因表达
㈠ 有效转录及其调控元件
• 1. RNA聚合酶 • 2. 启动子及其转录作用的启动（启动子
的概念、分类） • 3.转录作用的终止 • 4. 转录的弱化作用
㈡ 正确转译
• 1.起始密码子（intiqtion codon,initiator） • 2.核糖体结合位点（RBS，又称SD序列）
㈢ 原核表达载体的构建
一、基因表达的基本概念
生物体的遗传信息都是以核苷酸序列 编码的形式储存在遗传物质DNA上, 基因 表达是目的基因DNA在导入的细胞内转 录成mRNA, 再以mRNA指导翻译成蛋白 质。基因的表达依赖于有效的转录和 mRNA的正确翻译以及翻译后的加工处 理等各个环节的调节作用，其中转录最 为关键，原核的基因表达过程和方式与 真核细胞有显著不同凡能使转录终 止的有关的DNA的序列称终止子。
• 强终止子：不依赖ρ因子发挥终止作用， 回文序列中G/C配对多，有四个以上U， 致使RNA聚合酶构象改变而终止转录。 如图6-9,如图6-10
• 弱终止子：依赖ρ因子发挥终止作用。如 图6-11
转录的弱化作用
• 原核表达载体的构建的要求 • 1.表达载体类型 • 2.表达载体的举例 • 3.包涵体表达载体
启动子
• ⑴ 乳糖启动子（Lac） • ⑵ Trp启动子 • ⑶ Tac启动子 • ⑷ 噬菌体的PL和PR启动子 • ⑸ 脂蛋白启动子（LPP）
启动子结构对表达效率的影响
• 启动子-35区和-10区序列与通用转录序列 一致，间距为17 bp，大于17bp效果差， 不同产物选用不同启动子，如尿激酶用 ptac，IL2/2FU-V用PRPL启动子效果好。
条肽链 6. 有特有SD序列，调控mRNA与核糖体有效结
合和翻译的起始 7. 无糖基化功能
RNA聚合酶
• 原核细胞只有一种RNA聚合酶，当其核 心酶与σ因子结合，形成全酶后，才能识 别DNA上的启动子进行转录。
启动子的概念
• 启动子是位于结构基因上游，转录起始 调控所必需的一段DNA序列，内含-35区 （与σ因子结合）和-10区（和核心酶结 合）的保守序列。当启动子与全酶结合 后可在+1转录起始点开始转录，如图6-1。
• 3. 外源基因必须能在大肠杆菌中进行有效转录（如无 内含子），转录后的mRNA在菌体必须相当稳定，并 且能有效地进行翻译，转译的蛋白分子在菌体内不致 于受菌体蛋白酶的降解。
三、真核基因在原核细胞中表达及调控
• 真核基因在原核细胞中表达及调控的特 点
• ㈠ 有效转录及其调控元件 • ㈡ 正确转译 • ㈢ 原核表达载体的构建
Tac启动子
• Tac启动子是由Trp启动子和Lac启动子构 建而成的杂合启动子，-35区为Trp启动子 顺序，-10为LacUV5启动子顺序，二者之 间距离为16bp者为pTrc，17bp者为pTac。 该启动子只需用IPTG诱导转录即可。如 图6-7
噬菌体的PL和PR启动子
• PL为λφ左向启动区，PR为右向转录启动 区，与CI阻遏蛋白结合，可抑制OL或OR 转录，但CI在42℃诱导转录（如图6-8）。
• 转录的弱化作用使转录没有到达终止信 号处而中途停止转录，使mRNA转录发 生部分停止，而不是发生全部停止。
起始密码子
• 起始密码子是编码多肽链第一位氨基酸 的密码子AUG（或ATG），编码甲硫氨 酸（蛋氨酸）。在细菌中也有罕见的起 始密码子GUG，编码缬氨酸。其起始表 达作用AUG＞GUG。
核糖体结合位点