基因过表达载体流程图解
基因表达过程图解
5′
真核 mRNA 的 polyA 尾巴增强了 mRNA 的 稳 定 性 ， 并 在 mRNA 从 细胞核到细胞质的跨膜转运中发 挥重要作用
5′
polyA尾巴
富含GU 序列
α α
β 3′
ω
3′
-35序列 AACTGT
TTGACA
-10序列 ATATTA
TATAAT
5′ β′ 模板链 CCGGC
基因表达与蛋白质合成
转录与翻译
制作人：江田
转录
原核生物转录区域上游序列
操纵基因：原核生物 的表达调控依赖于操 纵基因，这是与启动 子连接的一段序列， 可控制基因的转录起 始。当抑制因子附着 在操纵子上时基因关 闭，脱离后，RNA聚合 酶便接触启动子，起 始转录 正调控因子 结合区
启动子是位于结构基因5
5′
3′
α
ω α 5′
-10序列 -35序列 AACTGT TTGACA
σ亚基
T T A A T A
T A T A A T
3′ β 5′ 模板链 转录区域 非模板链 3′
β′
转录第三阶段------转录延伸
σ 因子被释放后， RNA 聚合 酶核心酶能以正确的取向与 解链后的有关单链相互作用， 形成开链复合物。核心酶催 化 RNA链延伸，这种共价延 伸 发 生 在 DNA 的 局 部 解 链 区——转录泡内
+1
八聚体盒 3′
-140 -120 -100
GC盒
-80
CAAT盒
-60
GC盒
-40 -30
TATA盒
-20
模板链 5′ 转录区域 3′ 非模板链
5′
转录第一阶段------模板的识别 原核生物
基因工程操作文稿演示
（4）化学合成
要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产 物的氨基酸序列 应用：一般用于小分子肽类基因的合成
使用DNA合成仪合成的片段长度有限，较长 的链则须分段合成，然后用连接酶进行连接。
（四）载体的选择和制备和克隆一些
4.目的基因的获得：
从生物基因组中分离目的基因
原核生物基因组较小，基因容易定位，用限制性内 切酶将基因组切成若干段后，用带有标记的核酸探 针，从得目的基因
从基因的转录产物mRNA来反转录成R技术体外扩增有关DNA片段
用PCR技术可以在体外有效而且特异地扩 增目的基因片段。在已知序列的前提下，可 以采用RT-PCR方法直接从mRNA获得特定 基因的cDNA。也可从已有的cDNA克隆中扩 增出编码区的DNA片段，用于构建表达载体。 因为PCR有一定错配率，必须用测序予以确 认。
二、酶切
获得目的基因和载体DNA之后，为了进行 重组，必须对它们进行酶切或加上接头，在线 性状态下，为连接作好准备，应注意工具酶的 选择保证连接成功。
较小的DNA片段。 M13噬菌体则用于克隆一些待测序的DNA片段。
选择载体主要依据构建的目的，同时要考
虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建 的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合 适的表达载体。
无论选用何种载体，首先都要获得载体分 子，即分离纯化λ噬菌体DNA或制备粘性质粒 和其它有关质粒。获得载体后，采用适当的限 制酶将载体DNA进行切割，获得线性分子， 以便于A克隆。只有在细胞。
因mRNA有poly（A）尾巴，可用12～18寡聚 d（T）片段作为引物，加入4种dNTP， AMV （或MMLV）逆转录酶催化第一股链的合成。
（三）制备目的基因的方法1.从中提取 在已建立的基因组、cDNA文库中取
《载体构建流程》课件
案例三：物联网设备中的载体应用
要点一
总结词
要点二
详细描述
物联网设备中的载体构建主要关注设备的物理设计、通信 协议和数据传输等方面。
在物联网设备中，载体构建涉及设备的外观设计、内部结 构、通信协议选择和数据传输方案等。一个优秀的物理设 计能够确保设备的稳定性和耐用性；合理的通信协议选择 能够提高设备间的通信效率和稳定性；而高效的数据传输 方案则能够确保设备收集的数据能够及时准确地传输到中 心服务器进行处理。
使用调试技术定位和解决 载体构建过程中的错误和 异常，确保载体的稳定性 和可靠性。
04
载体构建的实际应用案例
案例一：网站建设中的载体应用
总结词
网站建设是载体构建的重要应用领域，通过合理的架构设计和内容规划，能够提高网站的可用性和用户体验。
详细描述
在网站建设中，载体构建主要涉及网站的页面设计、布局、导航、内容组织等方面。通过合理的页面设计，可以 提升网站的视觉效果和吸引力；合理的布局和导航设计，可以提高用户浏览和查找信息的效率；而合理的内容规 划，则能够确保网站提供的信息具有价值，满足用户需求。
载体制作
编程实现
根据设计稿，使用编程语言和工 具实现载体功能。
素材准备
准备所需的图片、音频、视频等 素材，确保内容质量。
测试与调试
在制作过程中，对载体进行测试 和调试，确保功能正常。
载体测试
功能测试
对载体的各项功能进行测试，确保其正常工作。
兼容性测试
测试载体在不同操作系统、浏览器等环境下的兼 容性。
案例四：游戏开发中的载体应用
总结词
游戏开发中的载体构建主要关注游戏画面的表现力、操 作体验和游戏机制等方面。
详细描述
基因表达载体的构建
02
转化后，目的基因需要在宿主 细胞中复制和表达，这一过程 需要适当的诱导剂和调控元件 。
03
表达产物可以是目的基因的蛋 白质产物，也可以是RNA产物 ，具体取决于目的基因的性质 和实验需求。
表达产物的检测
01 表达产物的检测可以通过免疫学方法、生物化学 方法、分子生物学方法等多种手段进行。
02 检测的目的包括确定目的基因是否成功表达、表 达产物的性质和含量等。
基因表达载体的构建
• 基因表达载体概述 • 基因表达载体构建流程 • 克隆基因的表达 • 基因表达载体的应用与展望
01
基因表达载体概述
基因表达载体的定义
基因表达载体是用于将目的基因导入 细胞并使其表达的载体，通常由质粒 或病毒等构成。
它能够将目的基因带到细胞内，并在 细胞内复制和扩增，从而使目的基因 在细胞内得到表达。
THANKS
感谢观看
01
宿主细胞应具备繁殖快速、容易培养、容易转染等 特性，以便于基因表达产物的生产。
02
宿主细胞应具备低免疫原性，以减少免疫反应对基 因表达产物的影响。
03
宿主细胞应具备对表达产物的加工和分泌能力，以 便于表达产物的纯化和收集。
转化与表达
01
转化是将目的基因导入宿主细 胞中的过程，常用的方法有电 穿孔法、显微注射法、脂质体 法等。
02
基因表达载体构建流程
选择克隆位点
确定目的基因的长度和结构
01
根据基因序列，选择合适的克隆位点，确保目的基因的完整性
和功能性。
考虑载体的大小和性质
02
根据实验需求，选择适合的载体，确保载体能够容纳目的基因
并具有所需的特性。
确定克隆位点的位置
基因工程主要操作流程及图解
基因功能研究
通过动物模型研究基因在生物体内的功能及 其调控机制，揭示生命活动的本质。
动物模型构建方法和注意事项
构建方法：包括自然 突变筛选、化学诱变、 物理诱变和基因编辑 技术等。其中，基因 编辑技术如CRISPRCas9等已成为主流方 法。
注意事项
选择合适的动物种类 和品系，确保实验结 果的准确性和可重复 性。
基因工程主要操作流程及图解
$number {01}
目 录
• 基因工程概述 • 基因工程基本操作流程 • 基因表达调控技术 • 蛋白质纯化与功能分析技术 • 细胞培养、转染和稳定株构建技
术 • 动物模型在基因工程中应用 • 总结与展望
01
基因工程概述
定义与发展历程
定义
基因工程是通过改变生物体的遗传物 质，来实现对生物性状和功能的定向 改造的一门技术。
通过基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）或基因重组技术将目的基因整合到细胞基因组中，实现稳定表达。
筛选方法
利用抗生素抗性基因或荧光标记基因进行初步筛选，再通过qPCR、Western blot等方法对稳定株进 行鉴定和验证。
06
动物模型在基因工程中应用
常见动物模型类型及其特点
小鼠模型
繁殖周期短，基因型确定，适合大规模遗传研 究。
转化细胞筛选与鉴定
01
02
03
抗性筛选
报告基因检测
PCR或测序鉴定
利用选择性培养基筛选转化细胞， 如抗生素或营养缺陷型培养基。
通过检测报告基因的表达情况， 间接判断目标基因是否整合到受 体细胞基因组中。
利用PCR或测序技术直接检测目 标基因在转化细胞中的存在和表 达情况。
03
基因表达调控技术
基因工程的操作过程课件PPT(ppt64张)
1.转化的原理与技术
（3）l噬菌体DNA的转染
感受态细胞的培养： 将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基 中培养至OD600
吸附： 加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保温10分钟
5'
GCATGCCCCCC G
C GGGGGGACGTC
Klenow
Pst I
5'
GCATGCCCCCCTGCAG
CGTACGGGGGGACGTC
5'
GCATGCCCCCCTGCAG
CGTACGGGGGGACGTC
G 3' GGGGGGACGTC
CTGCAGGGGGG 3' G
CTGCAGGGGGG C
5' 5'
5' 5'
3. 不同粘性末端的连接
5'
CTGCAG
GACGTC
PstI
5' 5'
5'
CTGCA 3'
G
G
3' ACGTC
5'
T4-DNA pol
切平
GGATCC CCTAGG
BamHI
5' GATCC G
Klenow
GGATCC
CCTAGG
5'
G CCTAG 5'
补平
5'
C
G
G
C
5'
T4-DNA ligase
80℃烘干固定影印薄膜 不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：
基因工程的基本操作步骤
鉴定: 鉴定
功能活性鉴定 抗性鉴定
分别提取什么进行检测
归纳步骤
归纳: 基因工程的基本操作程序 1. 获取目的基因
从生物体中直接获取 化学方法人工合成
2. 构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因 目的基因、启动子、终止子、
3. 将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法、 农杆菌转化法、显微注射法
4. 目的基因的检测与鉴定
检测：是否插入、转录、 检测：是否插入、转录、翻译
基因操作的基本步骤
基因操作的基本步骤
基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作流程
利用PCR技术扩增目的基因
原理: 原理 DNA双链复制 双链复制 前提: 前提 要有一段已知 目的基因的脱 氧核苷酸序列， 氧核苷酸序列， 以便合成引物。 以便合成引物。
获取目的基因
从生物体中直接获取 利用化学方法人工合成
构建表达载体
表达载体的组成
1. 2. 3. 4.
目的基因 启动子 终止子 标记基因
将目的基因导入受体细胞（植物细胞）
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
将目的基因导入受体细胞（动物细胞） 显微注射法
将目的基因导入受体细胞（微生物细胞） Ca2+处理
录 是否翻译
基因工程、细胞工程、胚胎工程流程图
基限制酶1.从基因组中提 取目的基因因 多个DNA片段
的
载体 （同种限制酶切割）
制
DNA连接酶
备： 多个重组DNA
分别导入
受体菌的不同个体（不同个体含不同D利用PCR技术扩增目的基因
过程
相同 点
原则 条件
O2是细胞代谢的需要， CO2是维持培养液的PH值
第十二页，共21页。
2.克隆动物产生的过程：
MⅡ期的 卵母细胞
细胞质
重组细胞
某种生物 （供体）
体细胞核移植
体细胞
细胞核
卵裂
细胞培养
早期胚胎
胚胎移植
受体（代孕）母体子宫
妊娠 分娩
与供体生物遗传物质相同的个体
第十三页，共21页。
3.动物细胞融合
不同DNA 的两个细 胞A和B
动物胚胎或幼龄动
物的组织、器官
胰蛋白
酶处理 单个细胞
剪刀 剪碎 作用：去
加培
养液 细胞 制成 悬浮
液
原理：细胞增值
掉组织间
蛋白质
原代培养 随细胞数增多，细胞分裂贴壁生长
思考:动物细胞培 养最终能培养成 生物体?
到表面相互接触时就会停止分裂增 殖——细胞接触抑制
无限传代
不死细胞
部分细胞遗 传物质改变
传代培养
可通过DNA合成仪用化学方法直接人
反转录酶
工合成。
(1)反转录法：
杂交双链 (单链RNA/单链DNA)
以目的基因转录成的信
使RNA为模板，反转录成互 补的单链DNA，然后在酶的
单链DNA
作用下合成双链DNA，从而 获得所需的基因。
DNA聚合酶
双链DNA
基因过表达载体流程图解
基因过表达载体
将目的基因编码区序列（CDS）克隆到相应的质粒或病毒载体上，利用骨架上构建的启动子驱动目的基因表达，此外，可选择报告基因进行示踪或抗性基因进行筛选。
源井生物针对基因过表达研发了一系列YOE过表达载体，可分为慢病毒载体、普通载体、腺相关病毒载体等，广泛应用于体外和体内研究。
注：源井生物根据客户的实际需求，以丰富的实战经验为客户提供定制化载体方案，方案除了上述载体骨架的选择，还涉及启动子可选：广泛性/特异性/诱导型，多个目的基因间连接方式的选择等。
质量控制标准
提供载体酶切和测序验证报告。
基因编辑载体应用
针对不同基因编辑对象：不同类型细胞系，斑马鱼及大小鼠等。
针对不同基因编辑目的：移码敲除，片段敲除，精确敲除，定点突变，片段敲入等，提供对应的gRNA载体和打靶载体供客户选择。
注明| 文章是源井生物原创，转载请注明。
基因工程的操作流程及技术要点
差分吸收光谱法烟气在线监测技术的开题报告一、研究背景及意义烟气污染对环境和人类健康造成了严重的危害，因此对烟气排放的监测和控制变得越来越重要。
差分吸收光谱法（DOAS）是一种基于光学原理的烟气在线监测技术，可对烟气中的污染物进行快速、准确、非侵入式的测量，并具有不受气体基质影响、适应复杂气体混合物、运行成本低等优点。
该技术已广泛应用于烟气排放、环境空气质量、地表大气污染等领域，成为烟气在线监测的重要手段之一。
二、研究内容本次研究将基于DOAS技术，设计并实现一套烟气在线监测系统。
具体研究内容包括：1.梳形光谱仪的选择及优化：DOAS技术的核心是梳形光谱仪，因此需要对不同类型的梳形光谱仪进行比较和优化，以得到最佳的光谱分辨率和信噪比。
2.反演算法的研究：针对不同污染物的特征吸收线，设计并优化反演算法，实现对多种污染物的定量检测。
3.系统硬件及软件设计：设计系统硬件电路及选材等方案，并编写控制软件与反演算法进行集成。
三、研究方法1.文献调研：对DOAS技术相关文献及国内外已有的研究进行调研。
2.光谱仪优化：选择不同类型的梳形光谱仪进行比较，优化最佳光谱分辨率和信噪比并验证。
3.污染物特征线提取：在已有文献基础上，提取不同污染物的特征吸收线。
4.反演算法优化：根据特征吸收线设计反演算法，并进行优化验证。
5.系统硬件及软件设计：按照硬件选材方案和反演算法编写相应的控制软件，实现系统调试和完善。
四、预期成果本研究预期可以设计出一套基于DOAS技术的烟气在线监测系统，重点达到以下预期成果：1. 实现对多种污染物的在线监测，如二氧化硫、氮氧化物等。
2. 搭建一套稳定、可靠的烟气在线监测系统，具有高稳定性和高检测灵敏度。
3. 对算法进行优化和验证，进一步提高系统的准确性和可靠性。
4. 技术推广，为烟气在线监测及其它领域的应用提供新思路和技术支持。
五、研究进度安排第一年：1. 文献综述、选型和实验准备（3个月）2. 梳形光谱仪选型及优化（3个月）3. 污染物特征线提取、反演算法设计及优化（6个月）第二年：1. 硬件选材方案设计（3个月）2. 调试硬件电路及控制软件编写（6个月）3. 系统完善及验证实验（3个月）第三年：1. 整理论文，准备答辩（6个月）六、研究经费预算本研究所需经费主要包括设备采购（梳形光谱仪、控制器等）、实验材料费、差旅费等，预算总额控制在80万元以内。
载体构建流程课件
酶切常见问题
纯化酶切产物
• 通常此步是必要的，可以对比未经纯化的酶切产 物进行连接后获得的阳性克隆大大低于胶回收酶 切产物连接所得阳性克隆。
• 此步的目的是去除多余的片段，得到单一纯化的 目的基因与载体骨架，使之连接不受其他序列干 扰。 • 另外酶切后纯化前，均需热灭活，以免残余的限 制性内切酶干扰后续连接反应，降低阳性率。
I 载体构建流程
提取mRNA
RT PCR
cDNA
得到目的基因
PCR产物纯化
菌落PCR
转化
连接
纯化酶切产物
酶切目的基因和载体
保菌
挑取阳性克隆去测序
测序正确的摇菌提质粒 导入表达宿主
测试表达情况
提取mRNA
• 如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心 机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保 持清洁，并定期进行消毒。.操作过程中应自始至 终佩戴口罩和手套，并经常更换，以避免将手、 臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带 入试管或污染用具。操作过程所用器材都要经过 特殊处理。一次性枪头、离心管等塑料制品 采用 连续灭菌两次来灭活RNA酶。研钵 180℃ ，4h。
菌落PCR
• 此步以适应现代分子生物学实验室批量工作 的高效性，通常只需挑半个菌落直接作为模 板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。 • 初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。
酶切检测阳性克隆
• 将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期 条带的即为阳性克隆。 • 要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入， 缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行 测序。 • 选用的酶通常为设计引物的两个酶，因为它能完整切 下ORF和载体骨架，可以通过条带大小以判断阳性克 隆。
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基因过表达载体
将目的基因编码区序列（CDS）克隆到相应的质粒或病毒载体上，利用骨架上构建的启动子驱动目的基因表达，此外，可选择报告基因进行示踪或抗性基因进行筛选。
源井生物针对基因过表达研发了一系列YOE过表达载体，可分为慢病毒载体、普通载体、腺相关病毒载体等，广泛应用于体外和体内研究。
注：源井生物根据客户的实际需求，以丰富的实战经验为客户提供定制化载体方案，方案除了上述载体骨架的选择，还涉及启动子可选：广泛性/特异性/诱导型，多个目的基因间连接方式的选择等。
质量控制标准
提供载体酶切和测序验证报告。
基因编辑载体应用
针对不同基因编辑对象：不同类型细胞系，斑马鱼及大小鼠等。
针对不同基因编辑目的：移码敲除，片段敲除，精确敲除，定点突变，片段敲入等，提供对应的gRNA载体和打靶载体供客户选择。
注明| 文章是源井生物原创，转载请注明。