造血干细胞的提取

造血细胞分离、集落培养及表型分析所谓造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSC，）是指具有自我更新和多向分化能力的一类细胞。它的基本特性是具有自我更新能力，即经过一个细胞周期活动之后，可以产生两个与分裂前性质相同的造血干细胞,同时又具有多向分化能力，即在一定的环境条件下，造血干细胞具有向各系血细胞分化的能力。

图1 造血系统和造血干细胞分化图

Fig。1 hematopoietic system and hematopoietic stem cell differentiation.

造血干细胞主要存在于骨髓、动员的外周血、脐血中，与骨髓和动员的外周血相比，脐血来源丰富、受病毒污染的几率小、富含造血干细胞且所含的造血干细胞具有更高的增殖潜能，同时脐血中的淋巴细胞幼稚，具有较低的免疫排斥活性，是优良的造血干细胞来源。

造血干/祖细胞鉴别的传统方法还是应用集落分析方法，它可检测粒-巨嗜细胞集落形成单位（colony - forming unit-granulocyte/ macrophage，CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（burst-forming unit-erythroid，BFU-E）、巨核细胞集落形成单位（

colony-forming unit-megakaryocyte，CFU-MK）、红系-粒系-巨嗜系-单核系集落形成单位（multipotent colony-forming units，CFU-GEMM或mixed colony-forming unit，CFU-Mix），等等，它是在半固体培养基上培养14天，然后在显微镜下计数集落。

造血干细胞的表面标志随着个体发育的不同时期不同，CD34+、CD38-、HLA-DR-、Thy-1+、c-kit+、LFA-1-、CD45RA-、CD71-、lin-已经普遍被认为是造血干细胞的标志。此外，1997年发现一个新的造血干细胞标志是AC133，但具CD34抗原是目前公认的造血干细胞和祖细胞的共同标志。

一、实验原理

1、用流式细胞仪分析细胞表型

待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光染

料染色后加入样品管中，在气体压力推动下进入

流动室，流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，

细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被鞘液包绕形成细胞液柱。这种同轴流动的设计，使得样品流和鞘液流形成的流束始终保持着一种分层鞘流的状态。鞘液和样品流组成一个圆形的流束，一起自喷嘴的圆形宝石孔喷射出来，进入流动室，与水平方向的激光光束垂直相交。该区称为测量区。利用样品流和鞘流的气压差的层流原理，使细胞依次排列成单行，每个细胞以均等的时间依次通过测量区，被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后发出荧光，同时产生散射光。细胞发出的荧光信号和散射光信号，同时被荧光光电倍增管接收，被积分放大反转换为电子信号输入电子信息接收器、

通过计算机快速而精确地将所测数据计算出来，结合多参数分析，从而实现了细胞的定量分析。

2、单个核细胞的分离

采用密度梯度原理，利用血液中各类细胞的密度不同进行分离。

3、CD34+细胞分选

利用抗原抗体反应的原理，样品中的CD34+细胞可与偶联有CD34抗原的磁珠反应，将MiniMACS 免疫磁性吸附柱置于磁场中，未与磁珠结合的CD34-细胞随缓冲液流出，与磁珠结合的CD34＋细胞保留在吸附柱中，将吸附柱移出磁场后用MACS缓冲液冲洗吸附柱即获得纯化的CD34＋细胞。

4、集落检测

利用造血干细胞的特性，在特定的条件下，造血干细胞可向某一系的细胞分化，从而在半固体培养基上形成一个个的克隆，即集落，一个集落代表一个造血干/祖细胞。

二、实验材料

脐血

脐血由上海国际和平妇婴保健院提供。供者要求身体健康，发育良好的非高龄产妇。无遗传病史，无病毒病史，无血液系统疾病，无寄生虫病及地方病。HIV、肝炎、梅毒等检测均为阴性。健康产妇分娩以后，立即用血袋无菌采取新生儿脐带血，血袋内装有无菌ACD－B25mL抗凝剂(每100mLACD－B 含有：一水合枸橼酸0.48g，二水合枸橼酸钠1.32g，一水合葡萄糖1.47g)，相当于100mL的血液抗凝剂，每次实际采集脐带血50-100mL。采集后脐带血置于4℃冰箱内保存，一般在6小时内取回分离。

培养基与细胞因子

培养基为IMDM培养基，添加20%的胎牛血清。细胞因子均为人重组蛋白，干细胞因子（SCF）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-3（IL-3）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、红细胞生成素（EPO）、

三、实验方法

单个核细胞的Ficoll密度梯度离心分离

将脐血用IMDM培养基以1：2稀释，在50mL离心管中加入15mL Ficoll，之后小心加入30mL稀释的脐血平铺在Ficoll上，之后置于吊篮式离心机中在400g下密度梯度离心30min，吸取中间的白层，用IMDM培养基洗涤细胞，除去淋巴细胞分离液和血小板。

集落分析方法

CFU－GM的检测体系为IMDM培养基，添加20％胎牛血清，4mmol/mL 谷氨酰胺，含0.9％甲基纤维素，以及人重组造血生长因子SCF、IL-3、IL-6，GM－CSF、G－CSF,其浓度分别为50 ng/mL、20 ng/mL、20 ng/mL、20 ng/mL 和20ng/mL。半固体培养在24孔板中进行，每孔加半固体培养基500L，加入2.5×104个单个核细胞。在37℃、5％CO2、湿度饱和的二氧化碳培养箱中培养14天后在显微镜下进行集落计数，超过50个细胞的细胞簇为一个集落。流式细胞分析

取1.0×106细胞用PBS洗两遍，重悬后分配到1.5mL管中离心，加PE偶联的小鼠抗人CD34单抗和FITC偶联的小鼠抗人CD45单抗各10L，4℃孵育30分钟。PBS洗两遍，离心后，每管加1mL FACS保存液。同型对照以PE 偶联的小鼠抗真菌毒素标记。标记细胞用流式细胞仪（BD公司）分析，结果用Lysis II软件处理，以CD45设门进行分析。

脐血CD34＋细胞的分离纯化

将1.0×108细胞悬浮于0.3mlMACS缓冲液中，加50μl偶联于磁珠的小鼠抗人CD34+抗体，4℃孵育30分钟，采用MiniMACS 免疫磁性吸附柱分离装置洗涤吸附柱中进行分离，未与磁珠结合的CD34-细胞随缓冲液流出，与磁珠结合的CD34＋细胞保留在吸附柱中，将吸附柱移出磁场后用MACS缓冲液冲洗吸附柱即获得纯化的CD34＋细胞。