发酵工程实验讲义(含生技生工)
2016 发酵工程实验讲义
实验目的：1、学习并掌握酸奶制作的基本原理与方法。
2、了解市售酸奶的生产工艺。
3、掌握乳酸菌活菌计数方法与操作。
实验原理：乳酸菌在乳中生长繁殖，发酵分解乳糖产生乳酸等有机酸，导致乳的pH值下降，使乳酪蛋白在其等电点附近发生凝集。
乳酸菌属于兼性厌氧微生物，其在无氧条件下生长繁殖较好，实验室条件下利用混菌培养的方法，尽可能让乳酸菌在无氧条件下生长，每个单菌落代表一个微生物细胞。
实验器材及试剂：菌种：市售酸奶试剂：白糖奶粉培养基各成分器材：培养箱、电炉、铝锅5L，培养皿酸奶发酵瓶：自带实验内容：（一）酸奶制作1、10%脱脂奶粉溶解于热水（80℃左右）中(每100ml的蛋白质浓度)，充分搅拌均匀，配成调制乳；2、添加蔗糖：为了缓和酸奶的酸味，改善酸奶的口味，在调制乳中加人4-8％的蔗糖。
3、灭菌：方法有两种：将乳加热至90℃，保温15-20min；4、接种：往冷却到43-45℃灭过菌的乳中加入乳酸菌，接种量为2%-5%。
5、发酵：发酵的温度保持在40-43 ℃，一般发酵时间为3-6h。
发酵终点的确定有两种方法：1）检测发酵奶的酸度，达到65-70 T°。
2）倾斜观察，瓶内酸奶流动性差，而且瓶中部有细微颗粒出现。
6、冷却：发酵结束，将酸奶从发酵室取出，用冷风迅速将其冷印到10℃以下，一般2 h，使酸奶中的乳酸菌停止生长，防止酸奶酸度过高而影响口感。
7、冷藏和后熟：经冷却处理的酸奶，贮藏在2-5℃的冷藏室中保存。
8、感官指标1）色泽：色泽均匀一致，呈乳白色，或稍带微黄色。
2）组织状态：凝块稠密结实均匀细腻，无气泡，允许少量乳清析出。
3）气味、味道：具有清香纯净的乳酸味，无酒精发酵味，无霉味和其他外来不良气味。
（二）乳酸菌活菌检测①、检测培养基：蛋白胨15g，牛肉膏5g，葡萄糖20g，氯化钠5g，碳酸钙10g，琼脂粉20g，水1000ml，115～121℃灭菌20min，灭菌后放置水浴52℃保温备用。
发酵工程实验讲解
发酵工程实验目录实验一发酵罐的结构系统及使用方法实验二微生物的诱变育种实验三乳酸菌的分离及乳酸饮料制作实验四大肠杆菌生长曲线的测定实验五摇床培养枯草芽孢杆菌发酵条件的优化实验一发酵罐的结构系统及使用方法一、实验目的：1．了解发酵罐（气升式、搅拌式）的几大系统组成，即空气系统、蒸汽系统、补料系统、进出料系统、温度系统、在线控制系统。
2．掌握发酵罐空消的具体方法及步骤3．掌握发酵罐进料及实消的具体方法及步骤4．掌握发酵罐各系统的控制操作方法二、实验原理：1．蒸汽系统：三路进汽——空气管路、补料管路、罐体2．温度系统：(1) 夹套升温：蒸汽通入夹套。
(2) 夹套降温：冷水通入夹套，下进水，上出水。
3．空气系统：取气口→空压机：往复式油泵获得高脉冲的压缩空气粗过滤器：由沙布包裹棉花压实成块状叠加制得，作用是去除部分细菌及大部分灰尘（贮气罐）：空压机压缩使气体温度升高，经贮气使气体保温杀菌；压缩空气中有油污、水滴，且压力不稳，有一定的脉冲作用，会冲翻后面的过滤介质，贮气后可使油滴重力沉降，减小脉冲。
（冷却塔）：有降温并稳定作用，同时经旋风分离器进行气液分离(丝网分离器)：通过附着作用，逐步累积沉降而分离5微米以上的微粒其作用介质为铜丝网(加温器)：对压缩空气升温，除湿，使湿度达50%-60%总过滤器：纱布包裹棉花加活性炭颗粒，逐层压紧而成。
分过滤器：平板式纤维，中间为玻璃纤维或丝棉，下面放水阀应适时打开放出油、水，再用压缩空气控干。
种子罐或发酵罐4．补料系统：补培养基、消泡剂、酸碱等。
5．在线控制系统：热电偶（温度探关）、溶氧探头、pH探头（后二者实消时才安装，为不可再生探头，有限定使用次数，pH探头使用前要先校准）、控制柜、数据采集系统。
6、进出料系统：进料口(接种口)、出料口(取样口)。
7．蒸汽过滤器：在蒸汽进入空气系统时应用，以免蒸汽中携带的杂质颗粒堵塞分过滤器微孔。
三、方法与步骤：(一)原则：1．通蒸汽前先关闭所有阀门。
发酵、酿造工艺实验讲义
第六部分发酵、酿造工艺实验第一篇发酵工程设备发酵工程设备实验项目及其各专业必修、选修表第二篇酿造工艺学实验酿造工艺学实验项目及其各专业必修、选修表第一篇发酵工程设备实验一小型生物反应器的安装与拆卸机械搅拌式生物反应器，又称发酵罐，是生物工程设备的重要组成部分，在微生物工程、酶工程、细胞工程（细胞培养）、基因工程（基因工程菌）等科学研究领域，生物反应器均为生物技术转化为产品必要的设备。
由于小型生物反应器进料、出料、清洗、电极校正等过程都不同于大型发酵罐，需要拆卸之后进行，因此熟悉生物反应器结构及安装与拆卸操作是正确使用反应器的前提。
一、实验目的掌握生物反应器安装和拆卸的操作规程，认识和了解生物反应器的结构与功能。
二、基本原理生物反应器装置分两大部分：1.罐体及内部的各传感器、检测电极；2.罐外检测控制装置，蒸汽及无菌空气系统。
反应器罐体具有可卸上盖，与罐体是通过橡皮垫圈和螺栓密封。
盖上设有接种口、空气进口、尾气出口、各种检测仪表的插孔、温度传感器及溶氧电极和pH电极插口、消泡剂和酸碱液注入口、取样口、备用口、压力表、安全阀等；罐底部设有夹套层，用以热交换，罐内有搅拌桨叶、档板、空气分布器；罐外：连接各种传感器及电极相应的控制器，可以自动地调控试验所需的培养条件；连接无菌空气系统，并配备一台自动调控装置；连接蒸汽发生器，供灭菌使用。
三、实验装置3 L园柱形机械搅拌式生物反应器图1 机械通风式搅拌生物反应器四、实验步骤1. 首先断开所有电源。
2. 卸下可移动的所有检测电极和探头。
3. 拧下螺栓，打开上盖，检查培养罐内部是否清洗干净。
4. 插入校正完毕的pH电极和氧电极于罐侧面相关位置，并与放大器连接。
5. 加入配置好的培养液，加盖（由于盖上的零件较多，必须对准位置后再盖上去），并对称拧紧螺母，直至上盖被密封固定。
6. 将事先清洗干净并开启的尾气过滤器装于盖上，安装安全阀、泡沫传感器、观察灯、压力计、取样管，以及灭过菌的无菌空气过滤器进气管等，剩余的孔洞须用硅胶塞和瞎塞拧紧备用。
发酵工程实验讲义
发酵⼯程实验讲义发酵⼯程实验（适合发酵⼯程原理与技术）张建国⽤前沿发酵⼯程（Fermentation Engineering）属于⽣物技术的范畴，⽣物技术⼜称⽣物⼯艺学现代⽣物技术作为⼀门新兴的⾼科技术产业，它的⽣命⼒在于他对社会经济和发展的各个⽅⾯都带来了极⼤冲击和影响。
发酵⼯程是指在最适发酵条件下，发酵罐中⼤量培养细胞和⽣产代谢产物的技术。
发酵⼯程由于涉及到⽣物催化剂，因⽽与化学反应有关。
由于⽣物技术的最终⽬标是建⽴⼯业⽣产过程为社会服务，因⽽该⽣产过程可称为⽣物反应过程（亦称为⽣化反应过程）。
在发酵技术中⼀般包括微⽣物细胞或动植物细胞的悬浮培养，或利⽤固定化酶，固定化细胞所做的反应器加⼯底物（即有⽣化催化剂参加），以及培养加⼯后产物⼤规模的分离提取等⼯艺。
主要是在⽣物反应过程中提供各种所需的最适环境条件。
如酸碱度、湿度、底物浓度、通⽓量以及保证⽆菌状态等研究内容。
⽣物技术产品具有多样性，各个学校的教学资源和课时不同，所进⾏的实验种类不同。
本实验内容根据本校的具体条件进⾏安排。
安排的思路是以最简洁有效的⽅式针对发酵过程的重要要素进⾏实验，便于学⽣对教学内容有个较好的认识，理顺学习思路，为进⾏社会科学实践打下良好基础。
第⼀篇野⽣型菌株的筛选经典的发酵产物来⾃微⽣物，⼟壤是微⽣物的⼤本营。
⽣产菌株的选育源头都来⾃于⾃然界。
如何从⾃然界中筛选⽬的微⽣物，可以根据⽬的微⽣物和产物的特性作为筛选条件，进⾏筛选提⾼筛选效率，从⽽有效的解决菌株从⽆到有的问题。
实验⼀产淀粉酶菌株的筛选（4学时）⼀．实验⽬的筛选⼀株能够合成分解淀粉的微⽣物。
⼆．原理⾃然界微⽣物种类繁多，有些微⽣物能够以淀粉作为碳源进⾏⽣长繁殖是因为它们能够合成分泌淀粉酶，因此我们能够从⾃然界中定向分离出合成淀粉酶的微⽣物。
当能合成淀粉酶的微⽣物在固体培养基中⽣长时，会将淀粉酶分泌到菌体周围，将菌落周围的淀粉⽔解成为⼩分量的糊精、聚糖和单糖。
孙中贯--发酵工程实验教案 - 2012级
葡萄糖（6.5g）、酵母膏（10g）、尿素8（分消）、 K2HPO4（0.35g）、MgSO4（0.2g）、pH 7.0-7.2、32℃ 2.4.3 发酵培养基
葡萄糖10%，蛋白胨5%，酵母膏2% 3器材 高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、分光光度计、恒温培养箱、酒精计 四实验步骤 1生长曲线的测定
（1） 配制培养基，250mL三角瓶装100mL培养基，一共28瓶， 0.1MPa灭菌20min，备用；
（2） 菌种活化：活性干酵母1g，100mL2%的蔗糖溶液中 (35~38℃),摇匀，置于30~32 ℃恒温箱中活化1~2h，即得1% 的ADY活化液。
测定微生物的数量有多种方法，如血球计数法、平板活菌计数法、 称重法、比浊法等，本实验采用比浊法来测定。由于菌悬液的浓度与吸 光度(A) 成正比也称光密度比浊法，只要用分光光度计测得菌液的A后 与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌株的生长曲线，此法快捷、简 便。
产物形成曲线就是产物产量对培养时间的曲线。工业发酵的目的是 为了收获产物，因此必须搞清产物积累最高时所需的发酵时间。如果提 前终止发酵，营养物质还没有完全被利用，发酵液中的产物量偏低；如 果发酵时间过长，一方面产物可能会分解，另一方面也降低了设备利用 率。因此，学会生长曲线和产物形成曲线的测定对工业发酵具有非常重 要的指导意义。 三实验器材 1菌种 酿酒酵母 2培养基
1 前言 近几年来，采用谷氨酸生物素缺陷型菌种来生产谷氨酸已经不能达
到人需要的那种效果，所以很多味精公司、生物研究所等都在致力于开 发新的耗糖少，产酸多，产酸稳定的菌种。为此，很多研究者做了很多 实验，有些是有些成就的。发酵新工艺采用的是温度敏感型菌种，温度 敏感型谷氨酸菌多为基因突变型菌株，突变位置是发生在决定与谷氨酸 分泌有关系的细胞膜结构的基因上。由于高温使突变菌种的酶失去活性 从而导致细胞膜结构的变化，使细胞膜转变成有利于谷氨酸渗透的样 式。从而使得终产物谷氨酸能够不断排除细胞体外。这样就使细胞内谷 氨酸产物不能积累到引起反馈调节的浓度，使得谷氨酸在细胞内不断合 成，在培养基中大量积累谷氨酸。从生物素用量的演变历程来看，许多 工厂已经由传统的生物素“亚适量”工艺发展为新型的生物素“超亚皿适 量”工艺，生物素“亚适量”工艺中的生物素浓度仅为5μg /L以下，而生物 素“超亚适量”工艺中的生物素浓度为5～10μg/ L ，其生物素用量明显增 大。理论上，对于生物索缺陷型菌株，增大用量可提高菌体浓度，在适 当的发酵控制下，当菌体内生物素被消耗至“贫乏”水平，菌体可大量合 成谷氨酸，从而达到提高代谢产物浓度的目的。还有一些学者在培养基 中做文章，改变培养基中的磷酸盐含量，来观察谷氨酸的生产情况，都 得到了不错的效果。谷氨酸发酵的前景很广阔，需要我们更用心的探讨 研究。 2 材料和方法 2.1 实验菌种和试剂
微生物与发酵工程实验讲义
微生物与发酵工程实验济南大学化学与化工学院生物技术系2007年6月实验一细菌生长曲线的测定一、目的要求1．了解比光电比浊计数法原理2．学习掌握光电比浊计数法的操作方法3．通过细菌光密度的测量，了解细菌生长特征和规律，绘制生长曲线二、基本原理当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的通过量降低。
在一定范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池准确测出。
测定细菌浊度，光波通常选择400~700nm。
光电比浊计数法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。
大多数细菌的繁殖速度很快。
将一定的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期，对数生长期、稳定期/衰亡期四个阶段。
以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。
不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同培养条件下所绘制的生长曲线也不同。
测定细菌的生长曲线，了解其生长规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。
三、试剂和仪器1．菌种：放射状土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)2．培养基：蔗糖 2%，酵母膏 0.05%, 尿素0.05%, NaCl 0.01%, K2HPO4 0.5%，(NH4)2SO4 0.02%，MgSO4•7H2O 0.02%, pH 7.03．仪器及其他用具755型分光光度计，振荡摇床，无菌吸管等。
四、实验步骤1．接种用接种环接种一环细菌到盛有6ml液体培养基的试管中，30℃120rpm摇床振荡过夜培养。
2．转接及取样将上述培养液接种到盛有54ml液体培养基的三角瓶内，30℃120rpm摇床振荡培养，每隔2小时用无菌吸管取样3ml测定比浊。
3．OD600测定用未接种的液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。
（注：这里以水为对照，测定空白培养基的OD值，最后把这个差减去即可。
江南大学发酵工程讲义
发酵工程（发酵工程第一章）发酵工程：主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。
(1) 有严格的无菌生长环境：包括发酵开始前采用高温高压对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术；在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术；(2)在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速度的计算机控制技术；(3)种子培养和生产培养的不同的工艺技术。
(4)在进行任何大规模工业发酵前，必须在实验室规模的小发酵罐进行大量的实验，得到产物形成的动力学模型，并根据这个模型设计中试的发酵要求，最后从中试数据再设计更大规模生产的动力学模型。
(5)由于生物反应的复杂性，在从实验室到中试，从中试到大规模生产过程中会出现许多问题，这就是发酵工程工艺放大问题。
微生物发酵技术1857年法国化学家、微生物家巴斯德提出了著名的发酵理论：“一切发酵过程都是微生物作用的结果。
”巴斯德认为，酿酒是发酵，是微生物在起作用；酒变质也是发酵，是另一类微生物在作祟；随着科学技术的发展，可以用加热处理等方法来杀死有害的微生物，防止酒发生质变。
同时，也可以把发酵的微生物分离出来，通过人工培养，根据不同的要求去诱发各种类型的发酵，获得所需的发酵产品。
利用微生物的特点Use of MicroorganismsPositive（益处）BiomassProductionConversionNegative（危害）PathogensSpoilage一、发酵的定义1、传统发酵2、生化和生理学意义的发酵3、工业上的发酵1、传统发酵最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。
2、生化和生理学意义的发酵指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。
如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。
3、工业上的发酵泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程包括：1. 厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。
发酵工程实验讲义2010129
----10升发酵罐的分批发酵［实验目的］通过本实验加深对发酵罐结构原理和分批发酵原理的认识，了解工业发酵的基本工艺和方法并掌据相关发酵参数的测定方法。
［实验原理］一、分批发酵原理分批发酵是一种准封闭式系统，种子接种到培养基后除了气体流通外发酵液始终留在生物反应器内，在此简单系统内所有液体的流量等于零。
它的一个显著特点是培养基一次性加入，产品一次性收获，分批发酵是目前广泛采用的一种发酵方式。
分批发酵过程一般可以粗分为四期：停滞期、对数生长期、稳定期和衰退期。
停滞期，即刚接种后的一段时间，细胞数目和菌量不变，因菌对新的生长环境又一适应过程，其长短主要取决于种子的活性、接种量和培养基的可利用性和浓度。
当细菌已经适应新的环境，养料充足而又无抑制生长的物质，便进入对数生长期，其比生长速率达到最大。
随着养料的减少，有害代谢产物的积累，生长不可能再无限制地继续。
此时比生长速率为养分、代谢产物和时间的函数，其细胞量仍在增加，但其比生长速率不断下降，细胞在代谢与形态方面逐渐退化，经短时间的减速后进入稳定期，此时净生长速率为零。
当养分耗竭，对生长有害代谢物在发酵液中大量积累便进入死亡期，此时生长呈负增长。
工业发酵一般不会等到菌体开始自溶时结束培养。
（图例）微生物四个时期的生长曲线其优点是：①对温度的要求低，工艺操作简单；②比较容易解决杂菌污染和菌种退化等问题；③对营养物的利用效率较高，产物浓度也比连续发酵要高。
缺点是：①人力、物力、动力消耗较大；②生产周期较长，由于分批发酵时菌体有一定的生长规律，都要经历延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期，而且每批发酵都要经菌种扩大发酵、设备冲洗、灭菌等阶段；③生产效率低，生产上常以体积生产率（以每小时每升发酵物中代谢产物的g 数来表示）来计算效率，在分批发酵过程中，必须计算全过程的生产率，即时间不仅包括发酵时间，而且也包括放料、洗罐、加料、灭菌等时间。
二、发酵罐结构原理（工作原理）发酵系统由发酵罐、空气处理系统、蒸汽净化系统、电气控制系统、恒温系统及管道、阀门等组成。
发酵工程原理与技术课件
•发酵工程原理与技术
•44
特殊变异菌的筛选方法
营养缺陷型突变株 抗阻遏和抗反馈突变型 组成型突变株 抗（敏感）性突变株
•发酵工程原理与技术
•47
高丝氨酸缺陷菌生产赖氨酸
必需氨基酸 食品、医药、畜牧业需要量很大 但在代谢过程中，一方面赖氨酸对天冬氨酸激酶有反馈抑制， 另一方面还同时生成苏氨酸和甲硫氨酸，使赖氨酸不能在细 胞内累积 高丝氨酸缺陷菌（不能合成高丝氨酸脱氢酶，补充适量高丝 氨酸）则合成大量赖氨酸
2
3
2
1
3 2
对照(HC0 =HC1+ HC2 + HC3) 诱变
3
•发酵工程原理与技术
( HC1＞ HC0 能力增强)
( HC2＜ HC0 能力减弱) ( HC3= HC0 能力不变)•42
•发酵工程原理与技术
•43
诱变后的突变株会继续变异，低单位菌株在传代过程 中往往占优势，因此复筛中常常出现产量高低不稳的状态， 必须进行自然分离—诱变育种和杂交育种必须环节。
•发酵工程原理与技术
•21
自然选育
自然选育：利用菌种自然突变(Spontaneous Mutation)进 行菌种筛选的过程。 自然突变：微生物在没有人工参与下所发生的突变。 引起自然突变两个原因：多因素低剂量的诱变效应和互变 异构效应。
•发酵工程原理与技术
前进
•22
自然突变
多因素低剂量诱变效应：自然突变实质上是由一些原 因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，如宇宙 空间各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱 变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物 质(如H2O2)的作用等。
发酵实验讲义
微生物发酵实验指导生命科学学院2010年8月目录第一部分生产菌种的选育及发酵条件优化实验一发酵菌株的初筛实验二发酵菌株的复筛实验三淀粉酶活力的测定实验四生产菌株发酵条件的优化第二部分生物反应器的使用实验五发酵罐的构造实验六发酵罐参数的设置及控制实验七发酵罐的操作方法第三部分补料分批发酵实验八种子的制备实验九发酵罐培养实验十菌株生长曲线的绘制实验十一发酵过程中还原糖的测定实验十二发酵过程中乙醇产量的测定第四部分传统产品的发酵实验十三酸乳的发酵微生物发酵实验本实验内容涉及到分析化学、有机化学、生物化学、微生物学、发酵工艺学及化学过程等学科的基本实验操作，对学生综合实验能力要求较高。
学生在上课之前，应对相应内容进行复习。
本实验上课期间，希望同学们注意以下几点要求。
1．实验时，每个授课班级学生将分为3个大组，每组7人左右。
各小组设组长一名，负责协调工作及实验工作分工。
在充分征求组员意见的基础上，分工一旦确定，组员必须服从工作安排，自觉、认真完成自己应负责工作。
2．该实验属开放性实验，所有实验内容必须由学生自己完成。
在同一时间内，每个大组内将进行不同的实验内容。
学生必须对实验内容非常熟悉，思路清晰，才能尽量减少失误。
因此学生要对实验内容进行预习。
3．本实验学生分组实验，学生要团结友爱，既要合理分工，也要互相合作，保证实验顺利完成。
每个大组实验数据共享，但数据处理过程不共享，否则将影响最后成绩。
4．实验需要使用仪器较多，共用小型仪器放于固定位置，不得随意搬动。
5．实验中要随时保持实验室及实验台面的清洁，以免发酵过程中污染。
6．实验过程中，蒸馏水用量较大，各组要轮流负责打水。
7．使用仪器必须按照教师指导进行，以免发生危险。
第一部分生产菌种的选育及发酵条件优化实验一发酵菌株的初筛一、实验目的学习淀粉酶产生菌的筛选方法。
二、实验原理淀粉酶在酿造、纺织、食品加工、医药等领域有广泛用途。
淀粉酶是一类淀粉水解酶的统称，它能将淀粉水解成糊精等小分子物质并进一步水解成麦芽糖或葡萄糖，淀粉被水解后，遇碘不再变蓝色，因此可根据淀粉培养基上透明圈的大小来判断所选菌株的淀粉酶活力。
1 第33讲 发酵工程
11.2
2.2
细菌Ⅱ
8.1
13.0
1.6
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第十单元 生物技术与工程
12
有关本实验的叙述，错误的是( ) A．培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质 B．筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布 C．以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外 D．H/C 值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异
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第十单元 生物技术与工程
15
(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能__________，在照射前， 适量喷洒________，可强化消毒效果。 (4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。 (5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度， 最可能的原因是________________________。
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第十单元 生物技术与工程
16
解析：(1)在实验室中，能耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属材质的实 验器具等都可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。(2)巴氏消毒法或高温瞬时消毒法与煮 沸消毒法相比，其优点表现为在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。(3)紫外线照 射能消毒的原因是其能够破坏微生物细胞中的 DNA 分子。在利用紫外线照射前，适量 喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可强化消毒效果。(4)自来水通常采用氯气消毒。(5) 采用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而温度未达到相应要求，最可能的原因 是没有排尽高压蒸汽灭菌锅内的冷空气。 答案：(1)可以 (2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少 (3)破坏 DNA 结构 消 毒液 (4)氯气 (5)未将锅内冷空气排尽
《发酵工程及其应用》 讲义
《发酵工程及其应用》讲义一、发酵工程的定义与发展历程发酵工程，简单来说，就是通过微生物的生长和代谢活动来生产有用物质的技术。
它是生物技术的重要组成部分，对人类的生产和生活产生了深远的影响。
发酵工程的历史可以追溯到几千年前，古代人类就已经学会利用发酵来制作食品和饮料，比如酿酒、制作酸奶和面包等。
然而，真正意义上的现代发酵工程始于 19 世纪中叶，当时法国科学家巴斯德揭示了发酵的本质是微生物的作用。
20 世纪初，随着微生物纯培养技术的建立，发酵工程开始进入工业化生产阶段。
在第一次世界大战期间，丙酮和丁醇的发酵生产为战争提供了重要的化工原料。
此后，抗生素的大规模发酵生产使得发酵工程在医药领域取得了巨大的成功。
20 世纪中叶以来，随着基因工程、细胞工程等生物技术的发展，发酵工程不断融合新的技术和理念，实现了从传统发酵到现代发酵的跨越。
如今，发酵工程已经广泛应用于医药、食品、农业、化工、环保等多个领域，成为推动经济发展和社会进步的重要力量。
二、发酵工程的基本原理发酵工程的基本原理是利用微生物的代谢能力，将原料转化为目标产物。
微生物在生长和代谢过程中，会产生一系列的酶，这些酶能够催化各种化学反应，从而实现物质的转化。
微生物的代谢类型多种多样，包括有氧呼吸、无氧呼吸和发酵等。
不同的微生物和代谢方式适用于不同的发酵过程。
例如，酵母菌在无氧条件下进行酒精发酵，而醋酸菌在有氧条件下将乙醇氧化为醋酸。
在发酵过程中，需要为微生物提供适宜的生长环境，包括营养物质、温度、pH 值、溶氧等。
通过控制这些条件，可以调节微生物的生长和代谢，提高发酵效率和产物质量。
此外，发酵过程还涉及到微生物的选育和改造。
通过基因工程等技术手段，可以获得具有优良性状的微生物菌株，提高发酵性能和产物产量。
三、发酵工程的基本流程发酵工程通常包括以下几个基本流程：1、菌种选育这是发酵工程的起点，需要从自然界中筛选或通过基因工程等手段构建具有特定性能的微生物菌种。
发酵工程实验讲义1
实验一产淀粉酶菌株的复筛一．实验目的从琼脂平板上划线分离的单菌落中进行筛选定量确定一株为高产淀粉酶生产菌。
二．原理自然界有些微生物能够利用淀粉作为碳源，是因为它们能够合成分泌淀粉酶，因此我们能够从自然界中定向分离出合成淀粉酶的微生物。
琼脂平板活性测定方法，可以简便、快速地进行初筛，但是难以得到确切的产量水平，要进一步确定生产优良性状的菌株就有必要对其进行摇瓶复筛，定量确定其生产水平，更准确的确定优良性状的菌株。
三．材料与仪器1. 材料（出发菌株每组选取3个单菌落）蛋白胨，酵母抽提物，NaCl，可溶性淀粉，葡萄糖（分析纯），甘油，蒸馏水和DNS 试剂。
2. 仪器三角瓶、容量瓶、吸管、烘箱、试管架、吸耳球、称量纸、分光光度计、烧杯、恒温水浴锅、离心机、电磁炉、接种环、酒精灯、无菌操作台、灭菌锅和恒温振荡培养箱。
四．方法与步骤1. 摇瓶培养基的配制种子培养基：蛋白胨5 g，酵母膏1 g，NaCl 5 g，加蒸馏水至1L，调节pH=7.0，每瓶分装20 mL，121 ℃灭菌20 min备用。
发酵培养基：可溶性淀粉10 g，蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，加蒸馏水定容至1000 mL，调节pH=7.0，每瓶分装50 mL，121 ℃灭菌20 min备用。
2. 接种从琼脂平板上选取若干单菌落，以接种环挑入装有种子培养基的三角瓶中进行培养24小时，培养温度37 ℃，摇床转速200 rpm。
24小时后以4%接种量，转接至装有发酵培养基的三角瓶中进行扩大培养48 h，培养温度37 ℃，摇床转速200 rpm，另外保存种子液于甘油管并做好标记。
3. 离心取发酵液12500 rpm离心10 min，取上清。
4. 淀粉酶活力的测定比色法测定淀粉酶的活力。
五．结果本组数据确定最优生长性状的淀粉酶菌株为________实验二DNS法测定发酵液中淀粉酶活力一．原理淀粉酶与可溶性淀粉在一定条件下反应，生成还原糖，在碱液中还原糖3,5-二硝基水杨酸反应后生成棕红色3-氨基-5-硝基水杨酸化合物，在一定的还原糖浓度范围内，还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法可测定样品中的含糖量，从而计算出酶活力的大小。
发酵工程实验指导课件
（通过产酸特性直接鉴定）
发酵工程实验指导
7
实验三 乳酸菌菌种的培养与保藏
分离得到的乳酸 菌菌株（编号）
斜面移接与 培养(每一株）
注意点： 注明菌种编号与日期；
如Lcd131,Lcd132；
（例：陈丹，第一组第3位同学）
第一阶段结束，总结
安排一周完成
发酵工程实验指导
1株保藏 1株待以下
实验用
8
发酵工程实验指导
2
实验内容设计
第一部分：乳酸菌的分离、筛选与保藏
第二部分：乳酸菌的培养与发酵测定
附上：实验原始记录 实验一：实验准备 实验二：乳酸菌的分离与筛选 实验三：菌种培养与保藏 实验四：乳酸菌的发酵培养 实验五：乳酸菌发酵测定与产物分析
实验报告撰写基本格式
一、实验目的与意义及原理等 二、材料与方法（或步骤） 三、结果与分析 问题回答
发酵工程实验指导
9
第二部分 实验四 乳酸菌培养与发酵测定
总实验流程
实验乳酸 菌菌株
斜面移接 活化
菌种移接至发酵 三角瓶，培养
细胞生长测定
（自选）
（细胞生物量g/L：离心测菌体重量； 混浊度描述）
产酸变化
（测定pH变化：酸度计）
发酵产物乳酸定 性分析（E3）
（薄层层析法）
注意点：
新保存的菌株可直接发接酵工种程实，验指导不必再活化。10Biblioteka 说明发酵培养基的配制
接种3环
培养瓶包扎方法
发酵工程实验指导
11
细胞生长的测定
细胞湿密度：单位体积(ml)发酵液菌体的重量g（湿重）; 方法：取一定量(ml)发酵液，经离心去除上清液，菌
体称重。
细胞浓度：单位体积(ml)活细胞数(cfu)，单位:cfu/ml 方法：取一定量(ml)发酵液，经适当稀释后。倒平板培养
发酵工程实验 讲义 2015
2. 再在各孔中加入25 µl 高碘酸钠溶液，迅速震荡混匀。
3. 混匀后，室温静置10 min，期间震荡混匀1-2次。 4. 10 min后，各孔加入L-鼠李糖50 μl，迅速震荡混匀。
5.混匀后各孔加入Nash试剂100 μl，放入自封袋中，53℃水浴15 min。
6. 15 min后，以未加稀释的甘油标准液的孔作为空白对照，在酶标仪上测各孔A412的平 均值。 7. 以各孔的A412平均值为纵坐标，对应的甘油浓度为横坐标，在坐标纸上或Microsoft Excel软件中绘制标准曲线。
粗滤
超滤 酒精沉淀
SDS-PAGE电泳
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3 2
4
1
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4. 四联罐介绍
3L 的发酵罐，由罐体、空压机、主机、水源组成。
本实验用的发酵罐
谷氨酰胺转胺酶(MTGase)的发酵
轮枝链霉菌接种量：5～10％（v：v） 培养条件：温度，30℃；搅拌转速为200rpm；通 气量，3vvm（通气量与发酵液体积比-VVM）；培 养时间：40h左右 。 监测发酵罐的T、通气量、搅拌转速等状态，按照 一定时间取样。 测定发酵液的pH、酶活、甘油含量和生物量。
《发酵工程及其应用》 讲义
注重发酵过程的绿色环保和可持续性，减少资源消耗和环境污染。
总之，发酵工程作为一门重要的生物技术，在各个领域的应用不断拓展和深化，为解决人类面临的资源、环境、健康等问题发挥着越来越重要的作用。相信在未来，随着技术的不断进步，发酵工程将会创造出更多的奇迹，为人类的美好生活做出更大的贡献。
（2）乳制品
酸奶、奶酪等乳制品的制作也离不开发酵。微生物在发酵过程中产生的乳酸和其他代谢产物赋予了乳制品独特的口感和营养价值。
（3）调味品
酱油、醋等调味品的生产也是发酵工程的应用成果。通过微生物的作用，使原料中的蛋白质、糖类等发生一系列的生化反应，产生丰富的风味成分。
2、医药工业
（1）抗生素生产
青霉素、链霉素等抗生素是通过微生物发酵生产的重要药物，它们在治疗细菌感染性疾病方面发挥了重要作用。
4、化工领域
（1）有机酸生产
如柠檬酸、乳酸、乙酸等有机酸的大规模生产都是通过发酵工程实现的。
（2）生物材料
利用微生物发酵生产可降解塑料、生物纤维等新型生物材料，有利于缓解环境压力。
5、环境保护
（1）废水处理
利用微生物的代谢作用对工业废水和生活污水进行处理，去除其中的有机物和有害物质。
（2）废气治理
通过微生物发酵将废气中的有害成分转化为无害物质，减少大气污染。
二、发酵工程的基本过程
发酵工程通常包括以下几个主要步骤：
1、菌种选育
这是发酵工程的源头。我们需要从自然界中筛选出具有特定性能的微生物，或者通过基因工程等手段对微生物进行改造，以获得能够高效生产目标产物的优良菌种。
2、培养基的制备
培养基为微生物的生长提供了必要的营养物质。它的成分需要根据微生物的需求和生产的目标产物来精心调配，包括碳源、氮源、无机盐、生长因子等。
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实验一酸奶的制作与乳酸菌的活菌计数（5学时）实验类型：综合性实验目的：1、学习并掌握酸奶制作的基本原理与方法。
2、了解市售酸奶的生产工艺。
3、掌握乳酸菌活菌计数方法与操作。
实验原理：乳酸菌在乳中生长繁殖，发酵分解乳糖产生乳酸等有机酸，导致乳的pH值下降，使乳酪蛋白在其等电点附近发生凝集。
乳酸菌属于兼性厌氧微生物，其在无氧条件下生长繁殖较好，实验室条件下利用混菌培养的方法，尽可能让乳酸菌在无氧条件下生长，每个单菌落代表一个微生物细胞。
实验内容：（一）酸奶制作1、10%脱脂奶粉溶解于热水（80℃左右）中，充分搅拌均匀，配成调制乳；2、添加蔗糖：为了缓和酸奶的酸味，改善酸奶的口味，在调制乳中加人4-8％的蔗糖。
3、灭菌：方法有两种：将乳加热至90℃，保温5min；4、接种：往冷却到43-45℃灭过菌的乳中加入乳酸菌，接种量为2%-5%。
5、分装：酸奶受到振动，乳凝状态易被破坏，因此，不能在发酵罐容器中先发酵然后再进行分装，须是将含有乳酸菌的牛乳培养基先分装到小容器中，加盖后送入恒温室培养，在小容器中发酵制成酸奶。
6、发酵：发酵的温度保持在40-43 ℃，一般发酵时间为3-6h。
发酵终点的确定有两种方法：1）检测发酵奶的酸度，达到65-70 T°。
2）倾斜观察，瓶内酸奶流动性差，而且瓶中部有细微颗粒出现。
7、冷却：发酵结束，将酸奶从发酵室取出，用冷风迅速将其冷印到10℃以下，一般2 h，使酸奶中的乳酸菌停止生长，防止酸奶酸度过高而影响口感。
8、冷藏和后熟：经冷却处理的酸奶，贮藏在2-5℃的冷藏室中保存。
9、感官指标1）色泽：色泽均匀一致，呈乳白色，或稍带微黄色。
2）组织状态：凝块稠密结实均匀细腻，无气泡，允许少量乳清析出。
3）气味、味道：具有清香纯净的乳酸味，无酒精发酵味，无霉味和其他外来不良气味。
（二）乳酸菌活菌检测①、检测培养基：蛋白胨15g，牛肉膏5g，葡萄糖20g，氯化钠5g，碳酸钙10g，琼脂粉10g，水1000ml，115～121℃灭菌20min，灭菌后放置水浴52℃保温备用。
②、稀释：取10克样品放入添加90ml无菌水的带玻璃珠的250ml三角瓶中，摇床180rpm震荡30min，即为10－1样品溶液；再从中取1ml至添加9.0ml无菌生理盐水的三角瓶中，稀释至10－2，……以此类推稀释至10－8，即稀释了1亿倍;③、倒制培养平板，从上述已稀释了1亿倍的乳酸菌悬液中取1ml，在无菌操作台上注入9.0cm培养皿中，再将已经灭了菌的保持在52℃水浴锅中的呈溶解状态的培养基，倒入15毫升左右于培养皿中，全部浸到培养皿，与菌悬液充分混合均匀（倒入培养基后，马上用手转动培养皿，转动几下，让其混合均匀），然后等其凝固再移入培养箱中培养，注意最后一步倒平皿必须在超净台无菌操作，以免杂菌污染。
每次稀释均要换灭好菌的移液管。
④、培养条件：37℃恒温培养箱培养48～72h⑤、培养完毕后，取出进行计数，因为是稀释了1亿倍，所以一个透明圈菌落代表1亿/克，如果有200个透明圈，则是200亿/克。
例：实验要求：1、要求学生在实验前做好预习，了解实验原理方法步骤，独立操作，及时提交实验报告。
2、要求对自己实验的酸奶作出评价与分析。
3、每人菌数实验做2-3个平行，结果测定值之间差异不悬殊。
4、要求有效单菌落数为30-300之间。
实验器材及试剂：菌种：市售酸奶试剂：白糖奶粉培养基各成分器材：培养箱、电炉、铝锅5L，培养皿酸奶发酵瓶：自带实验结果：1、详细描述自己制作的酸奶结果：2、测定酸奶PH:3、记录个人酸奶中各平行数据，计算最终平均值。
思考题：乳酸菌的保藏通常为低温条件，这给运输带来很大的成本，请问可采用什么方法使乳酸菌在常温条件下有很高的存活率以减少运输成本？实验二枯草芽孢杆菌固态发酵及活菌数测定（5学时）实验类型：综合性实验目的：1、学习了解固态发酵原理；2、以枯草芽孢杆菌为对象，了解固态发酵的控制技术；3、掌握枯草芽孢杆菌活菌计数方法与操作。
实验原理：作为抗生素的替代品，益生菌和酶制剂等的研究与开发近几年成为绿色饲料添加剂的热点，其中益生菌倍受关注。
作为益生菌的一种，芽孢杆菌制剂在动物生产中的研究和应用一直都是畜牧业科研和生产人员关注的焦点。
目前芽孢杆菌多采用液体深层发酵技术，再经喷雾干燥进行生产，对设备要求高，生产工艺复杂；而固体发酵采用的原料一般是廉价的农副产品(如草粉、麸皮等)，采用的设备也较液体发酵简单，生产成本大大低于液体发酵。
所以近年来各生产厂家都在积极探索芽孢杆菌的固体发酵技术，以求简化生产工艺，提高产量，降低生产成本。
固态发酵定义：指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水不溶性固态基质中，培养一种或多种微生物的生物反应过程，其是以气相为连续相的生物反应过程。
枯草芽孢杆菌属于好氧微生物，实验室条件下利用稀释涂布培养的方法，让菌在有氧条件下生长，每个单菌落代表一个微生物细胞。
实验内容：1、液体种子培养基配制：葡萄糖0.2%，NaCl 0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，pH 7.0。
2、液体种子培养：每300 mL三角瓶装量50 mL液体种子培养基，在115℃条件下灭菌30 min。
降温后从斜面接一环菌苔至种子培养基。
置37℃控温摇床培养。
转速200 r·min-1，至芽孢率达90%以上时停止，约需24 h。
3、固体发酵培养基：麸皮60%，稻壳10%，玉米粉5%，豆粕25%，硫酸镁0.05%，硫酸铵0.5%，料水比为1:1.1。
4、三角瓶固体发酵培养：每250 mL三角瓶装量20-30 g（湿重），固体发酵培养基原料试剂混合料，加水，料水比为1:1.1，搅拌均匀，培养基经121℃灭菌30 min，降温后接种量为2%(V/M：V—液体菌种体积数，M—固体发酵培养基的质量)，然后置37℃培养箱中静止培养，间时拍打，使其均匀生长。
至脱落芽孢率为80%以上时，停止发酵，约需48 h。
然后于60℃烘干、粉碎、计活菌数。
（二）枯草芽孢菌活菌检测①、检测培养基：葡萄糖0.2%，NaCl 0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，琼脂粉2%，pH 7.0。
115℃灭菌20min，灭菌后放置水浴52℃保温备用。
②、稀释：取10克样品放入添加90ml无菌水的带玻璃珠的250ml三角瓶中，摇床180rpm震荡30min，即为10－1样品溶液；再从中取1ml至添加9.0ml无菌生理盐水的三角瓶中，稀释至10－2，……以此类推稀释至10－8，即稀释了1亿倍;③、倒制培养平板，将已经灭了菌的保持在52℃水浴锅中的呈溶解状态的培养基，倒入15毫升左右于培养皿中，全部浸到培养皿，待培养基凝固；从上述已稀释了1亿倍的菌悬液中取0.2ml于已凝固的培养基表面，用玻璃刮铲涂布均匀，静止10min，然后再移入培养箱中培养。
④、培养条件：37℃恒温培养箱培养24～48h；⑤、培养完毕后，取出进行计数，因为是稀释了5亿倍，所以一个透明圈菌落代表5亿/克，如果有200个透明圈，则是1000亿/克。
（三）芽孢率测定:采用芽孢革兰氏染色后显微镜下观察实验要求：1、要求学生在实验前做好预习，了解实验原理方法步骤，独立操作，及时提交实验报告。
2、要求对芽孢杆菌固体培养产物有初步的判断。
3、每人菌数实验做2-3个平行，结果测定值之间差异不悬殊。
4、要求有效单菌落数为30-300之间。
实验器材及试剂：菌种：枯草芽孢杆菌试剂：培养基成分器材：培养箱、灭菌锅，培养皿实验结果：1、详细描述枯草芽孢杆菌固态培养物（外观、气味、培养物状态等）：2、记录个人活菌测定中各平行数据，计算最终平均值。
思考题：在枯草芽孢杆菌固态培养过程中，为了防止霉菌与酵母的污染，可采用什么方法？实验三、淀粉糖化与酒精发酵（5学时）实验类型：综合性实验目的：1．了解酒精发酵的主要类型、工艺原理及其控制条件2．熟悉酒精生产的工艺流程、掌握酒精发酵的操作方法3. 掌握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法4. 掌握在实验室中模拟酒精发酵的工艺流程实验原理玉米粉、大米粉中可供发酵的物质主要是淀粉，而酿酒酵母由于缺乏相应的酶，所以不能直接利用淀粉进行酒精发酵，因此必须对原料进行预处理，包括蒸煮（液化）、糖化等，蒸煮可使淀粉糊化，并破坏细胞，形成均一的醪液，能更好的接受糖化酶的作用，并转化为可发酵性糖，以便酵母进行酒精发酵。
在无氧条件下酵母菌利用可发酵性糖转化为酒精和二氧化碳的作用，称为酒精发酵，是生产酒精及各种酒类的基础，可通过测定发酵过程中产生CO2的量和最终产物酒精的量得知酵母的发酵能力。
实验内容1、原料的粉碎将玉米、大米用粉碎机粉碎到一定程度，玉米淀粉含量为70%，大米淀粉含量为75%。
2、蒸煮糊化称取一定量的粉碎后淀粉质原料，按照一定的料水比（100g：200ml），调制淀粉乳，90-100℃条件下恒温水浴加热，淀粉乳受热后，在一定温度范围内，淀粉粒开始破坏，晶体结构消失，体积膨大，粘度急剧上升，呈粘稠的糊状，即成为非结晶性的淀粉。
3、糖化经蒸煮糊化后的醪液，经过淀粉酶的糖化作用，将原料中的淀粉转化为可发酵性糖，供酵母利用。
为加快糖化速度，可以提高酶用量，缩短糖化时间，但酶用量太高，反而使复合反应严重，最终导致葡萄糖值降低，在实际生产中，应充分利用糖化罐的容量，尽量延长糖化时间，减少糖化酶用量。
酶参考用量：淀粉乳33%，60℃，ph4.5，酶240U/g绝干淀粉，糖化时间16h。
糊化醪液调整pH4.5，往其中加入一定量的淀粉酶（120U/g）、糖化酶（120U/g），60℃恒温下不断搅拌，直至粘度下降到一定程度，淀粉完全糖化（如何简易快速判断？）。
4、发酵（1）干酵母活化将干酵母按1:20的比例投放于37℃的温水中复水20min。
目的：恢复酵母细胞的正常功能。
（2）淀粉醪液糖化后，取400ml上清液于洁净的大可乐瓶中，加相同体积的水稀释，加入活化好的酵母种液5ml，混匀，28度培养箱中静止培养36h左右。
5、二氧化碳生成的检验（1）观察三角瓶中的发酵液有无气泡溢出；（2）滴入10%氢氧化钠1ml于发酵液试管中，观察，如气体逐渐消失，则说明有二氧化碳的存在；6、二氧化碳生产量的测定（1）接种完，擦干瓶外壁，于天平上称量，记为W1;（2）实验结束，取出瓶轻轻摇动，使二氧化碳尽量溢出，在同一天平上称量，记为W2；（3）二氧化碳生成量= W1-W27、酒精生成的检验（1）打开瓶塞，嗅闻有无酒精气味；（2）取发酵液5ml，加10%硫酸2ml；（3）再加入1% K2Cr2O7溶液10-20滴，如颜色由黄色变为黄绿色，则说明有酒精产生。
K2Cr2O7+H2SO4+CH3CH2OH——CH3COOH+K2SO4+Cr2（SO4）3实验要求：1、要求学生在实验前做好预习，了解实验原理方法步骤，独立操作，及时提交实验报告。