发酵工程实验
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2014-09-24 浙江师范大学化学与生命科学学院
实验操作：1.斜面接种无菌操作技术
2014-09-24
浙江师范大学化学与生命科学学院
①
②
③ ④
2014-09-24
浙江师范大学化学与生命科学学院
⑤
⑥
⑦
2014-09-24
浙江师范大学化学与生命科学学院
2.倒平板：按无菌要求，在火焰旁操作，取融化并
2.滴定
准确吸取斐林甲、乙液各5 ml，置入250ml锥形瓶，加水10ml。吸取0.05ml大米淀粉水解葡萄糖液， 摇匀后加热沸腾，继续用0.1%的标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失。记录消耗的标准葡萄糖液的总体 积V。
3.计算
2014-09-24
还原糖(g/100ml)=（ V0 -V) ×0.1%×1/0.05×100
2014-09-24
浙江师范大学化学与生命科学学院
思考题
• 诱变育种过程要注意哪些关键步骤？
2014-09-24
浙江师范大学化学与生命科学学院
实验四 大米淀粉的液化
一.实验目的
•要求学生掌握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法。
二. 实验内容
淀粉的液化 • 配制 30 ％的淀粉乳（按 200ml 升配制），调节 pH 值至 6.5 ，加入氯化钙 ( 对固形物 0.2 ％ ) ，加入液化酶 (122 0 U / g 淀 粉 ) ， 在剧烈 搅 拌下 ， 先 加热至 7 2 ℃ ， 保 温 15min，再加热至90℃，并维持30min ，以达到所需的 液 化 程 度， 碘 反 应呈 棕 红 色 。 液 化结束 后 ，再升 温 至 120℃，保持5-8min，以凝聚蛋白质，改进过滤。
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实验七 发酵罐结构与空气管道灭菌
一. 实验目的
1.掌握发酵罐的基本结构和操作方法 2.掌握空气管道灭菌的方法 3.掌握发酵罐灭菌方法
2014-09-24
浙江师范大学化学与生命科学学院
二.发酵罐结构和基本条件
2.1发酵罐的基本条件
1.结构上具有适宜的径高比。发酵罐的高度与径高比一般为1.7~4， 罐身越长，氧气的利用率越高。 2. 有一定的刚度与强度，由于发酵罐在灭菌过程和工作时，罐内有 一定的压力和温度。因此需要一定的强度。 3.搅拌通风装置使之气液充分混合，保证发酵液一定的溶解氧。 4.足够的冷却面积。 5.尽量减少死角。 6.轴封严密。 7.维修操作检测方便
2014-09-24 浙江师范大学化学与生命科学学院
葡萄糖聚合度与碘液的呈色表
葡萄糖聚合度பைடு நூலகம்葡萄糖 糊精16 21 与碘液呈色 无色 淡红色 红色 最高吸收波长（nm) 480 510
28
34 41 淀粉61 淀粉120 淀粉330
2014-09-24
红紫色
紫色 兰紫色 兰色 兰色
540
560 580 600 620
2014-09-24
浙江师范大学化学与生命科学学院
3、淀粉酶活力测定 用2 %可溶性淀粉溶液按3(2)操作，用稀释 后 的粗酶液1mL代替3(3)中的蒸馏水，测 吸光度A660,从标准曲线中查出相应的淀粉 浓度，求出被酶消耗的淀粉量(表1-3)。
2014-09-24
浙江师范大学化学与生命科学学院
表1-3 液化型淀粉酶活力测定
兰色
浙江师范大学化学与生命科学学院
630
淀粉 遇碘 液呈 蓝色
糊精 遇碘 液呈 紫色
2014-09-24 浙江师范大学化学与生命科学学院
思考题： 1.淀粉液化时加氯化钙的作用？
2014-09-24
浙江师范大学化学与生命科学学院
一. 实验目的
实验五 淀粉的糖化
•要求学生掌握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法。
冷却至不烫手的固化培养基（约50℃），倒入无菌培养皿 中，倒量以铺满皿底为限，不超过培养皿高度的1/3。
2014-09-24
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3.平板划线接种：
2014-09-24
浙江师范大学化学与生命科学学院
2014-09-24
浙江师范大学化学与生命科学学院
2014-09-24
浙江师范大学化学与生命科学学院
1.斐林试剂的标定
准确吸取斐林甲、乙液各5 ml，置入250ml锥形瓶，加水10ml，从滴定管中预先加入约20ml0.1% 的标准葡萄糖溶液，摇匀，于电炉上加热至沸腾，在沸腾状态下(同时关掉电炉，以便滴定终点时颜 色判断）继续滴加标准葡萄糖溶液，至蓝色刚好消失为终点。记录前后总共消耗的标准葡萄糖溶液 的总体积。同法平行操作三份，取接近的两次体积的平均值V0。
2014-09-24
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二.实验内容
1.取试管斜面一接种环，放入装有45 mL无菌水的三角瓶中，
震荡10min，即为10-1的稀释液； 2.取4.5mL无菌水4枝，用记号笔编上10-2、10-3、10-4、105. 3.取10-1的稀释液，震荡后静止2min，用无菌移液管吸取 0.5mL上层细胞加至一根4.5mL无菌水的试管中，即成102的稀释液；同理，振荡2min，用无菌移液管吸取10-2的稀 释液0.5mL加至另一根4.5mL无菌水的试管中，即成10-3 的稀释液；依次类推，得到10-4，10-5的稀释液。 4.在超净台上，吸取10-5 、10-4、 10-3的稀释液0.1mL，加 至琼脂培养皿平板上，用无菌涂布棒涂布均匀。 5.将涂布的培养皿倒置培养于恒温培养箱中，32℃培养2天后 观察。
发酵工程试验
2014-09-24
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试验一 发酵培养基配制
一.试验目的
1. 熟悉发酵培养基配制的要求 2. 熟悉玻璃器皿的包扎 3. 掌握灭菌方法
2014-09-24
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二.试验内容
1.营养琼脂培养基 蛋白胨10g ，牛肉膏3g，NaCl 5g ，琼脂20g， 加水至1000mL，pH7.2-7.4。 通过称量、溶解和调节pH等步骤，配制上述培养 基；分装成200 ml/瓶，每人一瓶，进行灭菌。 2. 配制45mL无菌水（内装6颗玻璃珠）一三角瓶/ 人，4.5mL无菌水试管4枝/人，另外包扎好培养 皿6个/人，0.5mL和5mL移液管各1枝/人，涂 布棒1枝/人。 3. 将上述配好的培养基，无菌水，培养基，移液管 和涂布棒放入灭菌锅灭菌，备用。
2014-09-24
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2.诱变 取9cm直径无菌培养皿1只/人，加入制备好的菌 悬液5mL和磁力搅拌棒（预先灭菌），然后放于 磁力搅拌器上，打开皿盖，在距紫外线30cm处照 射90秒，而后，从中取出0.5mL诱变后菌液，加 入4.5mL（10-2）试管中，振荡摇匀2min，再稀 释至10-3，10-4，10-5，分别取0.1mL涂布平板。 3.培养观察 32℃培养箱倒置培养，2天后观察培养结果。
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淀粉液化和糖化的终点判断
淀粉 碘液 无水酒精 蓝色 白色浑浊 糊精 紫色 白色浑浊 麦芽糖 碘液原色 微溶 葡萄糖 碘液原色 澄清
思考题
• 糖化酶分解糊精的原理是什么？
2014-09-24
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实验六 发酵液中还原糖的测定
一.目的：
•掌握可发酵性还原糖的测定方法 •作出发酵过程的糖耗代谢曲线 二.实验步骤
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实验三 发酵菌种的诱变育种
一.实验目的
1. 了解诱变育种的基本原理 2. 掌握突变菌株的分离方法
二.紫外线诱变原理
2014-09-24
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三.实验内容
1.菌体悬浮液的制备
取单菌落一接种环，放入装有50mL的生理盐水的 三角瓶中，用玻璃珠振荡10分钟，制得菌体悬浮 液。 用显微镜直接计数法计数悬浮液中的细胞数，并通 过稀释将悬浮液调整至大约107个/mL。
管号 1 2 3 4 5 6 7(样品)
淀粉稀释 液/mL
2 (0%) 2 (0.2%) 2 (0.5%) 2(1.0%) 2 (1.5%) 2 (2.0%) 2( 2.0%)
缓冲液/mL 1
1
1
1
1
1
1
40 ℃水浴保温5min
蒸馏水/mL 1
粗酶液/mL 0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
0
1
40℃保温30min，然后加入0.5mol/L乙酸10ml，混匀吸取反应液1mL 稀碘液/mL 10 10 10 10 10 10 10
轴封 搅拌器 齿轮箱
视镜
人孔
夹套
切向高度
内冷却盘管
叶轮
液体高度
空气分布器
底部排污阀 2014-09-24
图4 发酵罐结构图及术语
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实验八 液化型淀粉酶活力的测定
一、实验目的
• 掌握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的 基本原理和方法
2014-09-24
浙江师范大学化学与生命科学学院
A6602014-09-24
浙江师范大学化学与生命科学学院
4、酶活力计算 酶活力以每毫升粗酶液在40 ℃,pH6.0的 条件下每小时所分解的淀粉毫克数来衡量。
四、思考题
1、是否可直接用蒸馏水作对照? 2、糊精与碘反应生成的颜色（如红色）是否 会对结果产生影响？用糊精溶液作一试验。
二、实验原理
淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷键的一 类酶，包括α-淀粉酶 ，淀粉1，4-麦芽糖苷酶（β淀粉酶），淀粉 1，4-葡萄糖苷酶（糖化酶）和淀 粉1，6-葡萄糖苷酶(异淀粉酶)。 α-淀粉酶 可从淀 粉分子内部切断淀粉的α-1，4糖苷键，形成麦芽糖、 含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，使 淀粉的黏度下降，因此又称为液化型淀粉酶。 淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm 处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶 的不断作用，淀粉长链被切断，生成小分子糊精， 使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定 时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶 的活 力。
2014-09-24
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下一次实验准备
• 50mL生理盐水（0.45gNaCl)/人，包扎灭菌； • 5.0mL,0.5mL移液管，涂布棒/人包扎灭菌； • 营养琼脂培养基每组1L,每人200mL分装后， 灭菌； • 4.5mL无菌水4枝/人,包扎后灭菌；
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2014-09-24
三.玻璃仪器的包扎
2014-09-24
浙江师范大学化学与生命科学学院
1.移液管的包扎
2014-09-24
浙江师范大学化学与生命科学学院
2014-09-24
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2.试管的包扎
2014-09-24
浙江师范大学化学与生命科学学院
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2.2 发酵罐的结构组成
• 好气性机械搅拌发酵罐是密闭式受压设备，主 要部件包括罐体、搅拌器、轴封、消泡器、传 动装置、空气分布器，挡板、冷却装置、人孔 和视镜等。
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通用的机械搅拌通风发酵罐主要部件有罐体﹑搅拌器﹑挡板﹑轴封﹑ 空气分布器﹑传动装置﹑冷却管(或夹套) ﹑消泡器﹑人孔﹑视镜等。
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三、实验步骤
1、酶液稀释 用pH6.0缓冲液将粗酶液作适 当稀释。 2、标准曲线的制作:
① ② ③ ④ ⑤ 将可溶性淀粉稀释成0.2%，0.5 % ，1% 1.5%和2 %的稀释 液； 吸取淀粉稀释液2.0ml加至试管中，再加入磷酸氢二钠-柠檬 酸缓冲液1.0ml，40℃水浴保温5min； 加蒸馏水1mL，40 ℃保温30min后加入0.5mol/L乙酸10ml; 吸取反应液1mL，加稀碘液10mL,混匀，在660nm下测得吸 光度A[用2.0mL蒸馏水代替步骤（2）中的淀粉稀释液作为 对照]； 以淀粉浓度作为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线。
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四.思考讨论
1. 配制发酵培养基时应该注意什么？ 2. 使用压力蒸汽灭菌锅时要注意哪些问题？
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实验二 发酵菌种的自然选育
一.实验目的
1. 2. 学习从自然环境中分离工业微生物菌株的方法 掌握涂布分离方法
二. 实验内容
淀粉的糖化 液化结束后，将料液用盐酸将pH调至4.2-4.5，同时升温 至60℃。加入糖化酶1.0g，60℃保温。若干小时后，当 用无水酒精检验无糊精存在时，将料液pH调至4.8-5.0， 同时，将料液加热至80℃，保温20min．然后将料液温 度降至60-70℃，开始过滤。
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实验操作：1.斜面接种无菌操作技术
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①
②
③ ④
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⑤
⑥
⑦
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2.倒平板：按无菌要求，在火焰旁操作，取融化并
2.滴定
准确吸取斐林甲、乙液各5 ml，置入250ml锥形瓶，加水10ml。吸取0.05ml大米淀粉水解葡萄糖液， 摇匀后加热沸腾，继续用0.1%的标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失。记录消耗的标准葡萄糖液的总体 积V。
3.计算
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还原糖(g/100ml)=（ V0 -V) ×0.1%×1/0.05×100
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思考题
• 诱变育种过程要注意哪些关键步骤？
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实验四 大米淀粉的液化
一.实验目的
•要求学生掌握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法。
二. 实验内容
淀粉的液化 • 配制 30 ％的淀粉乳（按 200ml 升配制），调节 pH 值至 6.5 ，加入氯化钙 ( 对固形物 0.2 ％ ) ，加入液化酶 (122 0 U / g 淀 粉 ) ， 在剧烈 搅 拌下 ， 先 加热至 7 2 ℃ ， 保 温 15min，再加热至90℃，并维持30min ，以达到所需的 液 化 程 度， 碘 反 应呈 棕 红 色 。 液 化结束 后 ，再升 温 至 120℃，保持5-8min，以凝聚蛋白质，改进过滤。
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实验七 发酵罐结构与空气管道灭菌
一. 实验目的
1.掌握发酵罐的基本结构和操作方法 2.掌握空气管道灭菌的方法 3.掌握发酵罐灭菌方法
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二.发酵罐结构和基本条件
2.1发酵罐的基本条件
1.结构上具有适宜的径高比。发酵罐的高度与径高比一般为1.7~4， 罐身越长，氧气的利用率越高。 2. 有一定的刚度与强度，由于发酵罐在灭菌过程和工作时，罐内有 一定的压力和温度。因此需要一定的强度。 3.搅拌通风装置使之气液充分混合，保证发酵液一定的溶解氧。 4.足够的冷却面积。 5.尽量减少死角。 6.轴封严密。 7.维修操作检测方便
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葡萄糖聚合度与碘液的呈色表
葡萄糖聚合度பைடு நூலகம்葡萄糖 糊精16 21 与碘液呈色 无色 淡红色 红色 最高吸收波长（nm) 480 510
28
34 41 淀粉61 淀粉120 淀粉330
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红紫色
紫色 兰紫色 兰色 兰色
540
560 580 600 620
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3、淀粉酶活力测定 用2 %可溶性淀粉溶液按3(2)操作，用稀释 后 的粗酶液1mL代替3(3)中的蒸馏水，测 吸光度A660,从标准曲线中查出相应的淀粉 浓度，求出被酶消耗的淀粉量(表1-3)。
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表1-3 液化型淀粉酶活力测定
兰色
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630
淀粉 遇碘 液呈 蓝色
糊精 遇碘 液呈 紫色
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思考题： 1.淀粉液化时加氯化钙的作用？
2014-09-24
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一. 实验目的
实验五 淀粉的糖化
•要求学生掌握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法。
冷却至不烫手的固化培养基（约50℃），倒入无菌培养皿 中，倒量以铺满皿底为限，不超过培养皿高度的1/3。
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3.平板划线接种：
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1.斐林试剂的标定
准确吸取斐林甲、乙液各5 ml，置入250ml锥形瓶，加水10ml，从滴定管中预先加入约20ml0.1% 的标准葡萄糖溶液，摇匀，于电炉上加热至沸腾，在沸腾状态下(同时关掉电炉，以便滴定终点时颜 色判断）继续滴加标准葡萄糖溶液，至蓝色刚好消失为终点。记录前后总共消耗的标准葡萄糖溶液 的总体积。同法平行操作三份，取接近的两次体积的平均值V0。
2014-09-24
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二.实验内容
1.取试管斜面一接种环，放入装有45 mL无菌水的三角瓶中，
震荡10min，即为10-1的稀释液； 2.取4.5mL无菌水4枝，用记号笔编上10-2、10-3、10-4、105. 3.取10-1的稀释液，震荡后静止2min，用无菌移液管吸取 0.5mL上层细胞加至一根4.5mL无菌水的试管中，即成102的稀释液；同理，振荡2min，用无菌移液管吸取10-2的稀 释液0.5mL加至另一根4.5mL无菌水的试管中，即成10-3 的稀释液；依次类推，得到10-4，10-5的稀释液。 4.在超净台上，吸取10-5 、10-4、 10-3的稀释液0.1mL，加 至琼脂培养皿平板上，用无菌涂布棒涂布均匀。 5.将涂布的培养皿倒置培养于恒温培养箱中，32℃培养2天后 观察。
发酵工程试验
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试验一 发酵培养基配制
一.试验目的
1. 熟悉发酵培养基配制的要求 2. 熟悉玻璃器皿的包扎 3. 掌握灭菌方法
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二.试验内容
1.营养琼脂培养基 蛋白胨10g ，牛肉膏3g，NaCl 5g ，琼脂20g， 加水至1000mL，pH7.2-7.4。 通过称量、溶解和调节pH等步骤，配制上述培养 基；分装成200 ml/瓶，每人一瓶，进行灭菌。 2. 配制45mL无菌水（内装6颗玻璃珠）一三角瓶/ 人，4.5mL无菌水试管4枝/人，另外包扎好培养 皿6个/人，0.5mL和5mL移液管各1枝/人，涂 布棒1枝/人。 3. 将上述配好的培养基，无菌水，培养基，移液管 和涂布棒放入灭菌锅灭菌，备用。
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2.诱变 取9cm直径无菌培养皿1只/人，加入制备好的菌 悬液5mL和磁力搅拌棒（预先灭菌），然后放于 磁力搅拌器上，打开皿盖，在距紫外线30cm处照 射90秒，而后，从中取出0.5mL诱变后菌液，加 入4.5mL（10-2）试管中，振荡摇匀2min，再稀 释至10-3，10-4，10-5，分别取0.1mL涂布平板。 3.培养观察 32℃培养箱倒置培养，2天后观察培养结果。
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淀粉液化和糖化的终点判断
淀粉 碘液 无水酒精 蓝色 白色浑浊 糊精 紫色 白色浑浊 麦芽糖 碘液原色 微溶 葡萄糖 碘液原色 澄清
思考题
• 糖化酶分解糊精的原理是什么？
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实验六 发酵液中还原糖的测定
一.目的：
•掌握可发酵性还原糖的测定方法 •作出发酵过程的糖耗代谢曲线 二.实验步骤
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实验三 发酵菌种的诱变育种
一.实验目的
1. 了解诱变育种的基本原理 2. 掌握突变菌株的分离方法
二.紫外线诱变原理
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三.实验内容
1.菌体悬浮液的制备
取单菌落一接种环，放入装有50mL的生理盐水的 三角瓶中，用玻璃珠振荡10分钟，制得菌体悬浮 液。 用显微镜直接计数法计数悬浮液中的细胞数，并通 过稀释将悬浮液调整至大约107个/mL。
管号 1 2 3 4 5 6 7(样品)
淀粉稀释 液/mL
2 (0%) 2 (0.2%) 2 (0.5%) 2(1.0%) 2 (1.5%) 2 (2.0%) 2( 2.0%)
缓冲液/mL 1
1
1
1
1
1
1
40 ℃水浴保温5min
蒸馏水/mL 1
粗酶液/mL 0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
0
1
40℃保温30min，然后加入0.5mol/L乙酸10ml，混匀吸取反应液1mL 稀碘液/mL 10 10 10 10 10 10 10
轴封 搅拌器 齿轮箱
视镜
人孔
夹套
切向高度
内冷却盘管
叶轮
液体高度
空气分布器
底部排污阀 2014-09-24
图4 发酵罐结构图及术语
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实验八 液化型淀粉酶活力的测定
一、实验目的
• 掌握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的 基本原理和方法
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A6602014-09-24
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4、酶活力计算 酶活力以每毫升粗酶液在40 ℃,pH6.0的 条件下每小时所分解的淀粉毫克数来衡量。
四、思考题
1、是否可直接用蒸馏水作对照? 2、糊精与碘反应生成的颜色（如红色）是否 会对结果产生影响？用糊精溶液作一试验。
二、实验原理
淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷键的一 类酶，包括α-淀粉酶 ，淀粉1，4-麦芽糖苷酶（β淀粉酶），淀粉 1，4-葡萄糖苷酶（糖化酶）和淀 粉1，6-葡萄糖苷酶(异淀粉酶)。 α-淀粉酶 可从淀 粉分子内部切断淀粉的α-1，4糖苷键，形成麦芽糖、 含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，使 淀粉的黏度下降，因此又称为液化型淀粉酶。 淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm 处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶 的不断作用，淀粉长链被切断，生成小分子糊精， 使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定 时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶 的活 力。
2014-09-24
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下一次实验准备
• 50mL生理盐水（0.45gNaCl)/人，包扎灭菌； • 5.0mL,0.5mL移液管，涂布棒/人包扎灭菌； • 营养琼脂培养基每组1L,每人200mL分装后， 灭菌； • 4.5mL无菌水4枝/人,包扎后灭菌；
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三.玻璃仪器的包扎
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1.移液管的包扎
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2.试管的包扎
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2.2 发酵罐的结构组成
• 好气性机械搅拌发酵罐是密闭式受压设备，主 要部件包括罐体、搅拌器、轴封、消泡器、传 动装置、空气分布器，挡板、冷却装置、人孔 和视镜等。
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通用的机械搅拌通风发酵罐主要部件有罐体﹑搅拌器﹑挡板﹑轴封﹑ 空气分布器﹑传动装置﹑冷却管(或夹套) ﹑消泡器﹑人孔﹑视镜等。
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三、实验步骤
1、酶液稀释 用pH6.0缓冲液将粗酶液作适 当稀释。 2、标准曲线的制作:
① ② ③ ④ ⑤ 将可溶性淀粉稀释成0.2%，0.5 % ，1% 1.5%和2 %的稀释 液； 吸取淀粉稀释液2.0ml加至试管中，再加入磷酸氢二钠-柠檬 酸缓冲液1.0ml，40℃水浴保温5min； 加蒸馏水1mL，40 ℃保温30min后加入0.5mol/L乙酸10ml; 吸取反应液1mL，加稀碘液10mL,混匀，在660nm下测得吸 光度A[用2.0mL蒸馏水代替步骤（2）中的淀粉稀释液作为 对照]； 以淀粉浓度作为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线。
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四.思考讨论
1. 配制发酵培养基时应该注意什么？ 2. 使用压力蒸汽灭菌锅时要注意哪些问题？
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实验二 发酵菌种的自然选育
一.实验目的
1. 2. 学习从自然环境中分离工业微生物菌株的方法 掌握涂布分离方法
二. 实验内容
淀粉的糖化 液化结束后，将料液用盐酸将pH调至4.2-4.5，同时升温 至60℃。加入糖化酶1.0g，60℃保温。若干小时后，当 用无水酒精检验无糊精存在时，将料液pH调至4.8-5.0， 同时，将料液加热至80℃，保温20min．然后将料液温 度降至60-70℃，开始过滤。
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