水稻穗分化

实验二水稻穗分化过程的观察（一）
——性器官形成期
一、目的
掌握水稻幼穗剥取操作技术及识别水稻幼穗各分化时期的形态特征。

二、内容说明
按穗分化，按一定顺序形成穗的各个部分。

丁颖把稻穗分化过程分为八个时期，其中前四期为稻穗形成期（性器官形成期），其各期的形态特征如下：
（一）第一苞原基分化期稻穗开始分化时，最先从稻茎顶端生长点上分化出第一苞原基。

第一苞原基的出现，标志着原始的穗颈节已分化形成，其上就是穗轴。

因此，第一苞分化期又称穗轴分化期，这是生殖生长的起点。

第一苞原基与叶原基很相似，但在解剖镜下仔细观察时，二者有两点明显的区别：（1）叶原基突起是在前一叶原基遮住了生长点之后才开始发生，而第一苞原基则在止叶（剑叶）原基还没有遮住生长点时就发生了；（2）苞原基在生长初期与生长锥中的夹角为一明显的钝角，而叶原基为锐角（图4）。

（二）第一次枝梗原基分化期第一苞原基增大后，紧接着在生长锥上分化第二苞原基、第三苞原基……等，并在各苞的腋部产生新的突起，即第一次枝梗原基。

分化进一步发展，这些突起达到了生长锥的顶端，第一次枝梗的分化即结束。

此时在苞的着生处开始长出白色的苞毛。

（图5）。

（三）第二次枝梗原基及小穗原基分化期当生长锥最顶端的生长点停止发育时，穗顶最晚出现的和经一次枝梗原基下部又出现苞，并由下而上逐渐在苞的腋部很快分化出第二次枝梗原基，接着下一个第一次枝梗原基也逐渐由下而上在苞的腋部出现第二次枝梗原基，依次而下。

当第二次枝梗原基已经分化到各个第一次枝梗原基的上部时，稻穗全部被苞毛覆盖起来，这时稻穗的长度约0.5-1.0mm。

接着，上部第一次枝梗顶端出现颖片原基，小穗从这时开始陆续分化，随后在第二次枝梗上了分化出小穗原基，这时稻穗长度约为1.0-1.5mm左右。

（图6）。

（四）雌雄蕊形成期首先在最上部的第一次枝梗上顶端小穗的结实小花中出现雌雄蕊原基，穗最下部的第二次枝梗的小穗原基亦陆续分化完毕，一穗的小穗数就此决定，此时穗长约5mm。

接着穗轴、枝轴和小穗梗都开始显著伸长，雌雄蕊进一步发育，雄蕊原基分化为花药和花丝，还看不到花粉母细胞，雌蕊上分化出胚珠原基；此时浆片已能明显地看出；小花的内外稃已经相当发达，可将内部器官完全包住。

这时幼穗长约在5-10mm左右，幼穗的外部形态已初步形成（图7）。

其后则根据有关花粉发育的程度来表示幼穗发育进程。

三、材料及用具
不同稻穗分化时期的植株；双目解剖镜或低倍显微镜；镊子、剪刀、解剖针，稻穗分化挂图或幻灯片，录相片。

四、方法与步骤
取稻穗不同分化时期的植株，先记下心叶的未抽出量（0.1-0.9叶），再用镊子划破各展开叶的叶鞘并剥离干净，接着用解剖针剥离未展开叶及包在其内的各幼叶，直至剥出茎顶端生长点或幼穗为止，记录未抽出叶的数目，即为稻株的叶龄余数，同时将剥出的茎生长点或幼穗置于解剖镜或显微镜下观察。

取回材料如不能及时观察，则应将稻穗剥去叶片，放在FAA液或卡诺固定液（酒精-醋-酸液，简称AA）中固定。

AA液：
纯酒精（或95%酒精）3份
冰醋酸1份
固定稻穗1-24小时，如在此时间内不能处理，应更换到70%的酒精中进行保存。

FAA液（福尔马林-醋酸-酒精固定液）
50%或70%的酒精90ml
冰醋酸5ml
甲醛5ml
可以作为较长时期的保存液。

五、作业
1. 将所观察到的稻穗各分化时期的特征绘图，并说明之。

2. 根据你观察的结果，你认为要夺取高产首先要解决什么矛盾，其措施如何？
（蔡明历编写）
实验三水稻穗分化过程的观察（二）
——性细胞形成期
一、目的
学习掌握用压（涂）片法镜检水稻花粉发育过程，学习鉴定稻穗发育后期各阶段的技术。

二、内容说明
稻穗发育进入性细胞形成期，包括两个同时进行的过程：一个是在子房内进行雌性生殖细胞发育过程；另一个是在花药内进行的雄性生殖细胞（花粉）发育过程。

由于雌性生殖细胞的发育过程一般要通过复杂的切片技术才能观察到，而花粉发育过程只需要通过较简便压片方法即可观察到，故一般用花粉发育过程来表示稻穗发育后期，即性细胞发育过程，这一过程可划分为四个时期：
（一）花粉母细胞形成期随着小花和花药的长度增长，在小花长度达2mm左右时，花药明显地分为四室，且出现花粉囊间隙。

小穗顶端出现叶绿素，花丝稍伸长，花粉母细胞形成。

初期的花粉母细胞不规则，有棱角，后期呈圆形。

此时，雌蕊原基上出现柱头突起。

这一时期约经历4~5天，稻穗长约为1.5-4.0cm。

（二）花粉母细胞减数分裂期花粉母细胞形成以后，逐渐增大呈圆形，即进行连续两次分裂（第一次为减数分裂，第二次为有丝分裂），形成四分体。

一个花粉母细胞自开始第一次分裂，再经过第二次分裂，直到形成四分体所需的时间约24-48小时。

从外形上看，此时期小花长约为最后长度的一半左右，花药变成明显的黄色，柱头上开始出现乳头状小突起。

整个稻穗由第一朵小花减数分裂开始，到所有小花减数分裂完成，约需经历5-7天左右。

（三）花粉内容充实期四分体分散并收缩成不规则形，这时小花的大小达到全长的85%左右；随后花粉外壳逐渐形成，体积增大，花粉内容物逐渐充实，直到内容充满之前为花粉内容物充实期。

内外稃纵向伸长接近停止，横向则迅速增大。

当内稃长宽增加都接近停止时，便开始硅化变硬，叶绿素不断增加，雄蕊雌蕊迅速增长，柱头上依次出现羽毛状突起，而颖片退化。

（四）花粉完成期在抽穗前1-2天内，花粉内容物充满花粉壳内，称为花粉完成期。

此时，内外稃全面出现大量叶绿素，花丝迅速伸长，花粉内雄核和营养核正在分裂，至开花前雄核才形成，至此，花粉发育已经完成。

三、材料配备
（一）用具显微镜、天平、电炉、酒精灯、烧杯、漏斗、滤纸、培养皿、量筒、广口瓶、解剖刀、解剖针、载玻片、盖玻片、滴瓶、滴管等。

（二）药品95%酒精，冰醋酸，正丁醇，硫酸高铁铵，洋红，苏木精，加拿大树胶或中性树胶等。

（三）试剂（染液）配制
1. 酒精-冰醋酸固定液（卡诺固定液）见前实验。

2. 醋酸铁苏木精：45%醋酸100ml，加入0.5g苏木精，待充分溶解后过滤。

过滤后的溶液作为原谅。

用时，取原液少许，用45%的醋酸稀释3-4倍，再滴入醋酸铁，使染液由棕黄色变为蓝色为止。

染液配制数日后，染色效果变差，故必须随配随用。

醋酸铁的配法，是在45%的醋酸中加入过量的硫酸高铁铵即成。

3. 醋酸铁洋红：45%醋酸100ml，置入烧杯中煮沸，缓缓加入1g洋红，边加边搅拌，用小火维持2分钟后，去掉热源，让其慢慢冷却，至完全冷却后过滤，再添加1-2滴醋酸铁液（醋酸铁的配制法同前）。

四、方法与步骤
本实验是利用苏木精、醋酸铁洋红等染色剂使花粉细胞核、质着色程度不同，将花粉内部结构显现出来。

醋酸苏木精和醋酸铁洋红两种染色液对花粉都有较好的染色效果。

对于后期花粉，醋酸苏木精的染色效果优于醋酸铁洋红，且利于摄影。

（一）采集材料
1. 采集的时间：每天6:30-:7:00或16:00-17:00，这两段时期为减数分裂的高峰期，一般每天9时左右为减数分裂的活跃时间，16:00-17:00也是有丝分裂活跃时间。

2. 采集已进入雌雄蕊形成期以后，开始形成花粉的稻穗作观察材料时，可参考下述指标去采集。

花粉母细胞形成期：剑叶与下一叶叶枕距在-10cm左右，稻穗长1.5-5.0cm，小花长为1-3mm。

花粉母细胞减数分裂期：剑叶与下一叶叶枕距-5-0cm；叶枕距为“0”左右是减数分裂过渡到单核花粉期；穗顶接按剑叶下一叶叶枕时，是单核到双核花粉期，破口前是双核到三核花粉期。

（二）固定材料目的是将花数迅速杀死，并使花粉内部结构基本上保持取样时的状态。

将采集的稻穗放入盛有卡诺固定液的广口瓶中固定1-2小时，若不能及时进行观察，则需将材料转入高浓度酒精中，再按95%→90%→80%→70%的酒精浓度逐渐下降，每半小时转移一次以洗去醋酸，防止材料受腐蚀，最后转入
70%酒精中保存。

（三）染色压片
1. 用镊子从经过固定的材料上摘一个小花，置于载玻片上，用解剖针捎挑出花药1-2枚，弃去稃壳，立即滴上滴染液。

2. 若所取花药很小（即要观察早期花粉），则用解剖刀将其切成数段，并用解剖针将其捣碎，盖上盖玻片，并在盖玻片上加盖吸水纸，然后用大拇指压片（用力大小，在实践中摸索）。

若材料分散不匀，可用解剖针轻敲盖片，至材料均匀分布为止。

若取花药较大，则用解剖刀，从花药粗的一端切开，然后用解剖针从细的一端往粗的一端碾压，将花粉碾挤出来，再用镊子夹去药壳，盖上盖玻片和吸水纸，轻轻压片。

3. 压片后，将片子拿到酒精灯上通过4-5次，微微烤热（勿使染液沸腾与干涸），然后作镜检。

若发现染色不深或着色不清晰，可从盖玻片边缘加进少量染液，再拿到酒精灯上微烤。

如此可反复进行几次，直至花粉内部结构清淅可见为止，好的片子应是细胞质无色或着色很浅，细胞核或染色体与纺缍丝着色较深。

（四）保存片子若要临时保存，可用石腊封片或用加有10%甘油的染液压片。

若要长期保存，则需制成永久片。

永久片的制作视材料而定。

1. 对于四分体及其以前各期材料，按上述步骤压好片后，钭其反转过来，放入盛有冰醋酸和正丁醇等量混合液的培养皿，一端用玻棒将玻片搁起，使玻片呈倾斜状，待盖玻片在载玻片上自由落下后（此时材料主要在盖玻片上），再经过正丁醇1→正丁醇II→正丁醇III，每级经3-5分钟处理，最后用加拿大树胶封片，加拿大树胶用正丁醇溶解。

2. 单核及其以后各期花粉，因花粉壁已经形成，压片后不能紧贴在玻片上，在脱水透明过程中容易被洗掉，故改用“滴洗法”脱水透明，即压片后，分别用上述脱水透明剂多次“滴洗”，每次滴洗后，用吸水纸吸去洗液，最后用加拿大树胶封片。

除滴洗法外，还可采用整体染色脱水透明的办法完成后面的过程。

即从染色到最后一级正丁醇，花药都保存在稃壳内（小花要撕裂）进行。

最后将花药挑出，置于滴有加拿大胶的载玻片上，再挑破花药，让花粉溢出后封片。

采用整体法时，一是染色时间要延长（至花药全被染成蓝黑色），二是从最后一级正丁醇中取出至封片时动作要迅速，否则材料易碎烂。

五、作业
1. 将所观察到的花粉发育各时期的特征绘图，并说明之。

2. 水稻稻穗分化过程，其内部形态特征与植株外部形态有何对应关系？。