细胞破碎方法对几丁质脱乙酰酶活力的影响

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几丁质脱乙酰酶菌株的选育

几丁质脱乙酰酶菌株的选育几丁质脱乙酰酶菌株的选育几丁质是一种来源于甲壳动物外骨骼和真菌细胞壁的重要生物材料，具有生物可降解、生物相容性和生物活性等特点，因此在医药、农业、水产等领域有广泛的应用前景。

然而，由于几丁质的结构复杂，传统的化学方法生产几丁质的成本较高，且对环境造成了一定的污染。

因此，寻找一种高效、低成本的几丁质脱乙酰酶（chitinase）菌株成为了当前研究的热点之一。

几丁质脱乙酰酶是一种可以将几丁质分解为N-乙酰葡萄糖胺和几丁二糖的酶，广泛存在于微生物中，可通过筛选适应环境的菌株来获得高效的几丁质脱乙酰酶。

在几丁质脱乙酰酶菌株的选育过程中，主要包括菌种收集、分离、筛选和鉴定等环节。

首先，菌种收集是选育几丁质脱乙酰酶菌株的第一步。

可以从各种自然环境中收集土壤、水体、河流等样品，也可以从已知具有几丁质脱乙酰酶活性的菌株中进行分离。

采集的样品需要在恰当的温度和潮湿环境下进行保存和传递，以确保菌株的存活。

其次，菌种分离是选育几丁质脱乙酰酶菌株的关键环节。

样品收集后，应该在适宜的富含几丁质的培养基上进行菌种的分离。

分离方法主要有稀释板法、半固体划线法和滴法等。

采用不同的分离方法可以获得不同的菌落型，可以提高菌种的多样性。

接下来，菌种筛选是选育几丁质脱乙酰酶菌株的重要环节。

首先将菌落转移到含有几丁质的培养基上进行预筛选。

经过一段时间后，观察培养物上是否出现了透明圈附近的菌落，透明圈往往表示该菌株产生了几丁质脱乙酰酶。

然后通过测定菌株的酶活性和菌株的几丁质分解效果等指标，筛选出具有较高几丁质脱乙酰酶活性的菌株。

最后，通过鉴定确定几丁质脱乙酰酶菌株的分类和特性。

可以通过形态学观察、生理生化指标检测、分子生物学方法等来鉴定菌株的分类和特性。

鉴定的结果可以用于评估菌株的应用潜力和确定菌株是否适合于大规模生产。

综上所述，几丁质脱乙酰酶菌株的选育是一个复杂的过程，需要从环境样品中筛选适用的菌种，进一步分离、筛选和鉴定，最终得到高效的几丁质脱乙酰酶菌株。

几丁质和脱乙酰几丁质的吸附特性及其用于水中痕量铜的测定

几丁质和脱乙酰几丁质的吸附特性及其用于水中痕量铜的测定赵旌旌;王隆华;张志良【期刊名称】《海洋科学》【年(卷),期】2000(024)001【摘要】@@ 测定铜含量的方法有多种,如二乙氨基二硫代甲酸钠,原子吸收分光光度法等.几丁质(缩写为CT)广泛地存在于动植物中,它是一种天然的大分子含氮多糖化合物,是β-1,4连接的乙酰氨基葡聚糖,它具有吸附离子的能力,能富集金属离子,故对水的净化具有应用潜力[1].近年来国人对CT的研究日渐增多,在食品、医药、环保、农业、造纸、印染、日用化工以及酶制剂等方面,已陆续见诸报道.自然界甲壳质产量达100×108t,但实际用量仅2000t[2],因而尚需深入开发研究.作者利用CT和CTS(脱乙酰几丁质)的吸附特性,将溶液中微量铜离子富集之后,使得原来不能用一般分析方法检测的样品,用通常的比色方法即可测定,用该法测定水中的铜离子含量,简单方便,具有实际应用价值.【总页数】3页(P10-12)【作者】赵旌旌;王隆华;张志良【作者单位】华东师范大学生物系,上海,200062;华东师范大学生物系,上海,200062;华东师范大学生物系,上海,200062【正文语种】中文【中图分类】P7【相关文献】1.美国白蛾几丁质脱乙酰酶1(HcCDA1)的克隆表达与酶活测定 [J], 闫晓平;赵丹;孙晓彤;郭巍;李少雅;李景2.美国白蛾几丁质脱乙酰酶1(HcCDA1)的克隆表达与酶活测定 [J], 闫晓平;赵丹;孙晓彤;郭巍;李少雅;李景;3.甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶1(SeCDA1)在毕赤酵母中的表达与活性测定 [J], 孙晓彤;赵丹;闫晓平;郭巍;徐大庆;李少雅;李景4.甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶1（SeCDA1）在毕赤酵母中的表达与活性测定 [J], 孙晓彤;赵丹;闫晓平;郭巍;徐大庆;李少雅;李景;5.甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶SeCDA2a的外源表达及酶活力测定 [J], 陈祎;张伟;赵丹;郭巍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

几丁质脱乙酰酶的研究进展

1 CDA 的研究概况 1.1 CDA 的酶学性质
由于 CDA 的来源不同，其酶学性质也存在差异性。到目前为止，自然界所发现的 CDA 都是糖蛋白。 CDA 热稳定性良好，大多数 CDA 的最适温度为 50 ℃~ 60 ℃。而最适 pH 差异较大，一般胞外酶的最适 pH 为 7~12，胞内酶最适 pH 为 4.5~6。大部分 CDA 的等电点（isoelectric point，pI）都在酸性范围内[3-4]。影响 CDA 酶学性质的因素主要有温度、pH、底物状态及浓度、相对分子质量和金属离子等。不同金属离子对 CDA 酶学性质的影响不同，同种金属离子也可能因其浓度不同而
产酶菌属红球菌[5] 毛霉（Mucor）[6] 卷柄根霉（Rhizopus circinans）[7] 短杆菌（Brevibacterium）[8] 菜豆炭疽菌（Colletotrichum lindemuthianum）[9] 蓝色犁头霉（Absidia coerulea）[10] 草酸青霉（Penicillium oxalicum）[11]
Research Advance of Chitin Deacetylase YANG Qian1，LIU Jian-hui1，JIANG Tong1，DONG Li-li1，DUAN Hong-yu1，SUN Ji-lu2，* （1. College of Science and Technology，Hebei Agricultural University，Cangzhou 061100，Hebei，China； 2. College of Food Science and Technology，Hebei Agricultural University，Baoding 071001，Hebei，China） Abstract：Chitin deacetylase（CDA）is an enzyme which can catalyze deacetylase reaction in chitin generating chitosan. Chitosan has several excellent properties，such as antibacterial，anticancer，and antiviral，with wide application prospect in the medicine，chemical，and food industries. The research situation of CDA was re－ viewed，including enzymatic properties，catalytic mechanism，the method of separation and purification，etc. Furthermore，the screening methods and process of CDA producing strains were briefly introduced，and the fu－ ture research direction of CDA was prospected. Key words：chitin deacetylase；chitin；chitosan；deacetylation

脱乙酰几丁质和几丁质脱乙酰酶

脱乙酰几丁质和几丁质脱乙酰酶脱乙酰几丁质和几丁质脱乙酰酶是两个紧密相关的概念，它们在生物学、医学等领域具有重要的研究价值和应用前景。

本文将分别从两个概念的定义、分子结构、生理作用、应用领域等方面进行介绍。

一、脱乙酰几丁质1.定义：脱乙酰几丁质（N-acetylglucosamine，简称GlcNAc）是一种常见的多糖，由N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖组成，广泛存在于动物、植物和微生物中，是细胞壁、细胞外基质、软骨等组织的重要成分之一。

2.分子结构：脱乙酰几丁质的化学式为C8H13NO5，其分子结构中含有氨基、羟基、醛基等官能团，可与其他分子发生多种反应。

3.生理作用：脱乙酰几丁质在生物体内具有多种生理功能，如参与糖代谢、免疫调节、信号传递等作用，在疾病的发生和治疗方面也发挥着重要作用。

4.应用领域：脱乙酰几丁质在医药、生物技术等领域有广泛应用，如用于细胞培养、生物传感器的制备、组织修复等。

二、几丁质脱乙酰酶1.定义：几丁质脱乙酰酶（chitinase，简称CHT）是一类水解酶，主要作用是水解几丁质中的N-乙酰葡萄糖胺结构，将其转化为低聚糖和单体糖。

2.分子结构：几丁质脱乙酰酶的分子结构包括信号肽、保守区和多个保守催化位点等，是一种高度复杂的蛋白质。

3.生理作用：几丁质脱乙酰酶在生物体内具有重要生理作用，如参与几丁质代谢、免疫调节、解毒等，还被发现与肿瘤发生、先天性免疫缺陷病等多种疾病相关。

4.应用领域：几丁质脱乙酰酶在生物技术、农业等领域有广泛应用，如可用于食品加工、畜禽饲料添加剂、生物农药等。

总结起来，脱乙酰几丁质和几丁质脱乙酰酶是两个相互关联的概念，它们在生物体内具有复杂而重要的生理功能和广泛的应用前景。

深入研究它们的分子结构、生理作用及其应用，对于探索生命的奥秘，促进科学技术的发展都具有重要意义。

蛋白质结构中的去乙酰化修饰

蛋白质结构中的去乙酰化修饰蛋白质是细胞中最为重要的宏分子之一，在细胞内具有各种功能。

一些细胞活性酶在生理状态下会进行去乙酰化修饰，这种修饰能够对酶的活性产生影响，也就是说蛋白质结构中的去乙酰化修饰是一个非常重要的问题。

1.定位去乙酰化修饰通常发生在腺苷酸酰化酶（histone deacetylases，HDACs）失败的情况下，一些酶会通过翻译后修饰的方式进行去乙酰化修饰，其中最为重要的是SIRT修饰酶，这些修饰酶大部分都是在细胞核内活动的。

2.去乙酰化修饰在蛋白质结构中的影响去乙酰化修饰能够对蛋白质结构产生深远的影响，这一修饰作用主要通过控制蛋白质带电状态来实现。

SIRT7修饰酶对机器复制元件活性有着重要的调控作用，SIRT3修饰酶则是对四氧化锇损伤引起的oksidatif stres（氧化应激反应）有着保护作用。

SIRT1修饰酶能够对ATP合成产生影响，也就是能够对细胞内部的能量代谢起到影响作用。

这一修饰作用还能够对其他生理过程产生调控作用，包括organel regülasyonu（细胞器调控）和DNA新生作用。

3. 蛋白质结构的去乙酰化修饰与肿瘤在肿瘤细胞中，随着糖酵解的启动，SIRT3修饰酶非常重要，因为这一修饰作用能够对大量ROS产生的细胞环境起到一定的保护作用。

此外，去乙酰化修饰还能够协助细胞适应一些和肿瘤相关的突变、环境刺激或药物治疗等条件。

SIRT6修饰酶在肿瘤细胞中的表达受到限制，这一修饰作用能够控制非编码RNA的生产，并使得哺乳动物细胞对葡萄糖的代谢保持稳定。

4.其他研究进展近年来，人们对去乙酰化修饰的研究不断深入，有许多研究者主要关注如何阻止蛋白质去乙酰化修饰对肿瘤细胞的影响。

另外还有一些学术论文重点研究了如何提高去乙酰化修饰酶的生理活性。

总之，蛋白质结构中的去乙酰化修饰对于细胞功能维护和疾病治疗有着广泛的作用，并且对于肿瘤的治疗和预防也具有非常重要的意义。

因此，人们对这一领域的研究将会不断深入，未来必将取得更多的进展。

几丁质脱乙酰酶产

本文献研究的不足之处
数据可靠性不够充分：碱量法测脱乙酰度时没有重复取平均值，数据缺乏波动区间

本文献研究的不足之处

仰振球,李巧霞,樊红雷,宋宝珍. NMR、FTIR及电位滴定法测定壳聚糖脱乙酰度[J]. 功能高分子学报, 2003,(03) . 中指出在采用酸碱滴定法测定壳聚糖脱乙酰度的过程中，一方面，由于接近终点时碱的局部浓度较高，会有壳聚糖沉淀析出，影响点击pH或电位的测定另一方面，壳聚糖十大分子，其酸性溶液成胶体状态，在采用一般的（如甲基橙）指示剂是，很难判断终点。前者和赵颖,杨琰,卢实,张红菱. 壳聚糖脱乙酰度两种测定方法的比较 [J]. 武汉工业学院学报, 2009,(02) .实验中均指出线性电位滴定法比酸碱指示剂法能更好地避免人为误差，具有较高的准确性和精密度，而且操作简单。

据查证，有多种脱乙酰基的酶，本实验中缺乏酶的提纯本小组认为，实验中脱乙酰酶的筛选和测定采用壳聚糖，而题目命名为几丁质脱乙酰酶，由于结构不同两者的脱乙酰酶活力和种类也会不同，所以不够准确

几丁质分子中的糖残基部分脱去乙酰基就转变成壳聚糖
材料与方法

实验仪器及材料
1.仪器与试剂：PSH-2C精密型酸度计（上海伟业仪器厂），万分之一分析天平，电子天平，循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），磁力搅拌器。几丁质、壳聚糖（济南海得贝生物有限公司），新华滤纸，浓HCl（分析纯）， NaOH（分析纯），指示剂甲基橙，对硝基乙酰苯胺分析纯（分析纯），三羟甲基氨基甲烷（Tris） 2.培养基富集培养基：壳聚糖2.5g，K2HPO4 0.7g，KH2PO4 0.3g，MgSO4 0.5g，NaCl 0.1g，pH值为7.2~7.5，定容至1L。平板筛选培养基：胶体几丁质200g，K2HPO4 0.7g，KH2PO4 0.3g，MgSO4 0.5g，NaCl 0.1g，对硝基-N-乙酰苯胺0.2g，琼脂20g，定容至1L。复筛发酵培养基：壳聚糖7.5g，K2HPO4 1g，KH2PO4 1g，NaNO3 2g，玉米浆5g，定容至1L。产酶发酵培养基：蛋白胨2.5g，蔗糖5g，（NH4） 2SO4 2.5g，KH2PO4 1g， K2HPO4 1g 乙酸钠3g，玉米浆5mL，定容至1L。 3.土样来源浅海土样，埋有蟹壳的花园土样，腐败蝉蜕，虾蟹养殖场土样，湖水水样。

几丁质脱乙酰酶(CDA)的研究进展

壳聚糖（ｈｔｓｎｃｉａ）是几丁质的Ｎ一乙酰基形ｏ脱式，是自然界中数量最大的天然碱性多糖。壳聚糖
早在１７９３年，ＡｒｋａｉＹ等就从接合菌纲（ｙｏｙｅｓＺｇｍｃｔ）的双相型真菌Ｍｕｏｕｉ中发现ｅｃｒｏｘｒｉ了ＣＡ，这是从微生物中分离得到ＣＡ的最早报ＤＤ
≯ 拳拳 ≥
表１产ＣＡ的微生物Ｄ
产酶微生物
Ｍ．ＯＸ＂ＦＵｆｌ
Ｍ．ｍｉｌｌｅｅ７＂
酶活比细胞抽提物中高出６２倍， —５利于酶的纯化，而最具工业应用价值的是此酶活力不受乙酸的抑制。
自此之后，研究者对Ｍｕｏｕｉ的ＣＤｃｒｏｘｉｒＡ和
菌体的酶活力明显高于发酵液，研究了金属离子并
对酶活的影响。
工、印染、环保和生物医药等领域具有更加广泛的
应用。
１８年，ａｓＨ从植物病原体Ｃｌｔｒｈｍ９２Ｋｕ等ｓｏｅｔｃｕｌｏｉｌｄｍｔａｕｉｅｕｉｍ中提取到ＣＡ并进行了部分纯化，ｎｈｎＤ这是从非结合菌中发现该酶的最早报道，此酶与Ｍｕｏｒｕｉ中ＣＡ的差别较大，ｃｒｏｘｉＤ首先是发酵液中
组成部分。壳聚糖分子中由于存在大量游离氨基＿，３】
化学性质比较活泼，易于进行多种化学修饰，并且
溶于酸性及中性水溶液，具有良好的生物相容性和生物可降解性。壳聚糖可用作膜材料、螯合剂、吸
附剂等，相比几丁质而言，它在食品、化妆品、轻

羧甲基几丁质的体外降解研究

羧甲基几丁质的体外降解研究蒋丽霞;郭盼盼;赵淑英【摘要】研究了溶菌酶对羧甲基几丁质的降解条件.通过检测降解产物的分子量,考察了不同的缓冲液及pH值、酶浓度、温度和时间对溶菌酶降解羧甲基几丁质的影响.结果表明,在pH值较低的醋酸盐缓冲液中,羧甲基几丁质具有较高的降解效率,更有利于溶菌酶活力的发挥;羧甲基几丁质的降解速率随着酶浓度的增加以及时间的延长而加快,但当酶浓度超过一定值时,降解产物分子量下降的趋势逐步减缓;且在55℃、pH值4.5的条件下,降解速率最快,并在降解48 h后趋于降解平衡.作为羧甲基几丁质非专一性的溶菌酶,在适当的条件下,较专一性的壳聚糖酶对羧甲基几丁质的降解作用更加有效,为羧甲基几丁质这一生物可降解材料提供了更多的研究依据.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2018(035)009【总页数】5页(P60-64)【关键词】羧甲基几丁质;溶菌酶;降解【作者】蒋丽霞;郭盼盼;赵淑英【作者单位】上海其胜生物制剂有限公司,上海201106;上海其胜生物制剂有限公司,上海201106;上海其胜生物制剂有限公司,上海201106【正文语种】中文【中图分类】Q5-33几丁质、壳聚糖及其衍生物在生物医药领域得到越来越广泛的应用。

目前，在中国CFDA注册的几丁质及壳聚糖类二类医疗器械产品接近上百个，而作为三类植入性医疗器械产品获得批准的亦有10多个，且几丁质、壳聚糖及其衍生物作为组织工程支架材料或载体材料的应用也越来越多[1-2]。

羧甲基几丁质作为一种可降解的生物材料，有必要对其体内外的降解性进行研究。

已有研究报道动物体内的溶菌酶能够有效降解壳聚糖[3-5]。

邓倩莹等[6]研究发现，壳聚糖在含溶菌酶的醋酸溶液中降解23 d后，其相对分子质量下降50%；并且壳聚糖在相同的pH值条件下，在含溶菌酶的醋酸溶液中比在醋酸中的降解速率快，因为在含溶菌酶的醋酸溶液中存在溶菌酶和醋酸的双重催化降解作用。

细胞破碎的技巧

细胞破碎的技巧细胞破碎（cell lysis）是实验室中常见的操作，目的是将细胞破裂释放细胞内容物，以便进行后续实验，如蛋白质提取、DNA/RNA提取等。

细胞破碎的技巧主要有机械破碎、化学破碎和生物学破碎等多种方法。

一、机械破碎1. 高压均质法：使用高压均质机对细胞进行破碎，将细胞悬浮液通过小孔或喷嘴，使细胞迅速受到高速液流和切割作用，从而实现细胞破碎。

此法适用于较硬的细胞，如细菌等。

2. 超声波破碎法：利用超声波产生的剧烈涡流和液体物理性质变化，使细胞迅速破裂。

应注意控制超声波功率和时间，以避免样品过热和损伤。

3. 球磨破碎法：将含有细胞的样品与玻璃或金属珠放入球磨研钵中，并用球磨研钵进行高速摩擦研磨，利用机械力使细胞破碎。

此法适用于软组织以及大量样品。

二、化学破碎1. 胶酶破碎法：将含有细胞的样品用适量的含有胶原降解酶的缓冲液处理，利用胶原降解酶分解细胞间质蛋白，使细胞破裂。

此法适用于软组织和动物组织。

2. 高温破碎法：将含有细胞的样品置于高温中进行热处理，使细胞质膜破裂。

此法适用于耐高温的菌株和细胞。

3. 低温冻融破碎法：将含有细胞的样品在液氮中预冷，然后迅速置于高温水浴中进行冻融循环，使细胞破裂。

此法适用于一些敏感细胞。

三、生物学破碎1. 厌氧破碎法：由于一些细菌或真菌在缺氧条件下生长，在其细胞膜上富含氧化亚氮酸盐酶，可以将细胞膜破裂。

2. 超声波破碎法：有些细菌的外膜结构相对较弱，在超声波的作用下容易破裂。

3. 冻融破碎法：一些细菌在冻融过程中由于细胞膜的合并作用不够强，容易破裂。

4. 酶处理法：利用胶原酶、丝氨酸酶等刺激性酶类物质，可引起细胞质膜和细胞壁的变性与解聚，从而使细胞破裂。

在实际操作中，需要根据不同实验的要求选择适合的细胞破碎方法，并注意以下几点：1. 样品处理：样品中的细胞应尽可能保持完整，不受损伤或降解，避免过度搅拌或过高的温度处理，以保持样品的完整性。

2. 温度控制：在进行细胞破碎时，对于需要保持活性的细胞内容物，如酶、蛋白质等，应注意控制温度以避免失活。

哺乳动物几丁质酶的研究进展

22 ·2022.12试验研究0 引言几丁质又称甲壳素，是一种不溶性多糖。

完全乙酰化的几丁质由β-1,4-糖苷键将N-乙酰葡糖胺线性连接的聚合物。

但自然界中这种几丁质较为少见，大多数几丁质为N-乙酰葡聚糖和氨基葡萄糖的聚合物。

壳聚糖是组成成分大部分为氨基葡萄糖（GlcN ）的聚合物，乙酰化程度较低。

它们是无脊椎动物、节肢动物、藻类、真菌等的组成成分。

几丁质及其衍生物经常在食品、医药、农业等领域发挥重要作用。

许多节肢动物的外骨骼主要成分是几丁质，可以支持身体、维持身体的形状、发挥攻击和防御的功能。

而哺乳动物与节肢动物不同，失去了编码合成几丁质的基因，不能依靠自身合成几丁质，哺乳动物身体中出现的几丁质成分主要是由于食用的食物中含有几丁质或者微生物病原体入侵机体。

节肢动物依靠自身合成几丁质，也有着自身降解几丁质的酶系统。

这些几丁质酶由节肢动物自身合成，有着改变几丁质结构、参与节肢动物发育的功能。

哺乳动物不能合成几丁质，但研究发现有几丁质酶的合成，参与分解几丁质。

近年来，人们对几丁质和几丁质酶的研究主要在可以自身合成几丁质的微生物和无脊椎动物上，对于哺乳动物的研究比较少，所以本文综述几丁质进入哺乳动物体内的水解方式以及近年来对哺乳动物几丁质酶的研究，为饲料生产和治疗含几丁质病原引起的疾病提供思路。

1 几丁质进入哺乳动物体内的途径由于哺乳动物的食性不同，一些几丁质含量高的动物、真菌等是哺乳动物的食物来源，像啮齿目、灵长目、偶蹄目等杂食动物的食物中含有真菌。

在一些经济动物的喂养上，探索使用昆虫作为饲料的营养成分，将昆虫从作为养殖过程中的废物升级为在饲料中添加的优质蛋白质，由于营养价值高、生产成本低、环境污染小等特点使其为循环和可持续性的动物生产提供了乐观的前景，这当然也为几丁质进入哺乳动物体内提供了条件[1]。

除了饮食摄入这一方面，某些含有几丁质成分的病原体微生物常会随着呼吸进入哺乳动物体内，经常造成炎症，激活免疫系统，刺激吞噬细胞吞噬。

甘薯几丁质酶的分离与纯化

甘薯几丁质酶的分离与纯化刘美艳;王景景;谢逸萍;张健【摘要】以高抗甘薯黑斑病品种南京-92块根为材料,从染菌6 d的甘薯块根中得到粗酶液;经热变性、硫酸铵分级沉淀后,采用高流速二乙基氨基琼脂糖交换剂(DEAE Sepharose Fast Flow)阴离子交换层析,分离出3个蛋白峰,活性检测可知峰2为活性峰;将峰2经葡聚糖凝胶G-75(SephadexG-75)凝胶层析纯化后得到4个蛋白峰;将具有几丁质酶活性的峰2经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),凝胶上显示2条蛋白条带,分别割胶纯化测定活性,然后将有活性的条带进行10%、12%PAGE电泳,均显示为单一条带;本试验分离纯化过程中得到了电泳纯级的几丁质酶,为后续的研究奠定了基础.【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2017(045)018【总页数】3页(P186-188)【关键词】甘薯;黑斑病;几丁质酶;分离;纯化【作者】刘美艳;王景景;谢逸萍;张健【作者单位】江苏师范大学生命科学学院整合植物生物研究所,江苏徐州 221116;江苏师范大学生命科学学院整合植物生物研究所,江苏徐州 221116;江苏徐淮地区徐州农业科学研究所,江苏徐州221121;江苏师范大学生命科学学院整合植物生物研究所,江苏徐州 221116【正文语种】中文【中图分类】S435.313+.1甘薯(Iomoea batatas Lam)别称番薯、红薯、山芋等，属旋花科甘薯属。

甘薯的营养价值很高，我国的种植面积占世界种植面积的一半以上。

甘薯黑斑病是由子囊菌亚门长喙壳菌属(Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted)侵染引起的真菌病害，是严重危害甘薯生产的主要病害，产量损失高达 20%～50%[1]。

黑斑病的侵染能力极强，病菌通过破坏细胞壁，侵入甘薯细胞，在甘薯的幼苗生长阶段和地窖储藏阶段均能使甘薯染病[2]。

黑斑病的预防和控制已成为甘薯种植和储藏研究中的重要任务之一。

微生物几丁质酶的特性及其应用的研究进展

微生物几丁质酶的特性及其应用的研究进展李丽;杨雪松;刘红全【摘要】几丁质酶可以降解几丁质,其降解产物可以用于抗虫、医药、化工、食品等领域.目前已从微生物中获得多种几丁质酶并克隆其几丁质酶基因.本文主要对产几丁质酶微生物的分类及其分布特点、微生物几丁质酶的性质、结构、基因调节及应用等进行综述.【期刊名称】《广西民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(017)001【总页数】5页(P92-96)【关键词】几丁质酶;微生物;分类;特性;应用【作者】李丽;杨雪松;刘红全【作者单位】广西民族大学化学与生态工程学院,广西南宁530006;广西民族大学化学与生态工程学院,广西南宁530006;广西民族大学化学与生态工程学院,广西南宁530006【正文语种】中文【中图分类】Q936几丁质又称为甲壳素，它是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖以β-1,4-糖苷键连接而成的长链多聚物[1]，也是自然界中第二丰富的多聚糖[2].每年自然界中产生的几丁质数量极其巨大，几丁质及其降解产物作为重要的有机碳源和氮源参与生态系统的物质交换和能量流动[3].几丁质酶能催化分解几丁质，产生几丁寡糖和几丁二糖.几丁质酶的水解产物低聚糖有抗菌作用，可以调节生物体的免疫力，还可以抑制肿瘤细胞的生长等.几丁质酶对植物真菌病害的防治也有作用.因此，几丁质酶在食品、医药、农业以及化妆品等行业具有独特的使用价值[4].目前，在植物、动物和微生物中都发现了几丁质酶.绝大多数高等植物中都可以产生几丁质酶，几丁质酶主要分布于植物根、茎、叶和愈伤组织中[5]，在感染了真菌的时候，这些部位几丁质酶的含量明显增高，从而避免植物遭受某些真菌或害虫的侵害[6].一些细菌和真菌能够利用几丁质，说明在这些细菌和真菌中存在几丁质酶 [7].近年来，微生物几丁质酶的研究受到人们的重视.Cottrell认为至少10%的海洋可培养细菌能水解几丁质，Wang等认为有25%～50%的土壤链霉菌能产几丁质酶[5].现已从多种微生物中分离出了几丁质酶[8]，对微生物几丁质酶的分布、定位、结构、性质、基因克隆、诱导表达以及调控机制等多方面的研究均取得了一定进展.1 产几丁质酶微生物的分类及其分布特点近年来研究发现，产生几丁质酶的微生物主要有细菌、放线菌、真菌和病毒等[9].细菌主要有杆菌属的环状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蓝黑紫色杆菌、巨大芽孢杆菌、成团肠杆菌；沙雷氏菌属的液化沙雷氏菌、粘质沙雷氏菌；单胞菌属如嗜水气单胞菌、交替单胞菌属O-7株；弧菌属的哈氏弧菌、弗氏弧菌、创伤弧菌；梭菌属的类腐败梭菌、产气荚膜梭菌、热纤维梭菌；还有蚀几丁质贝内克氏菌、铜绿假单胞、黄单胞菌属、嗜麦芽假单胞菌等.放线菌主要有褶皱链霉菌、灰色链霉菌、天蓝色链霉菌、浅天青链霉菌、热紫链霉菌、浅青紫链霉菌、淡紫灰链霉菌、橄榄绿链霉菌、葱绿毛链霉菌等.真菌主要有白僵菌、构巢曲霉、少孢根霉、木霉属酿酒酵母、白色扁丝霉、白色念珠菌等.病毒类有小球藻病毒PBCV-1、苹果蠹蛾颗粒体病毒(CpGV)、棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(HaSNPV)、苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)、杆状病毒等[8].微生物产生几丁质酶的形式并不是单一的，已发现的几丁质酶产生细菌都可以同时产生几种不同的几丁质酶，并且这些几丁质酶的类别、组成和性质等是不同的[10].例如酿酒酵母能产生2种内切几丁质酶cts1和cts2；粘质沙雷氏菌可以产生相对分子质量为21000～57000不等的5种几丁质酶；交替单胞菌属O-7株能产生chiA、chiB、chiC和chiD四种不同的几丁质酶；所以，微生物产生几丁质酶具有多样性的特点，这也使微生物适应环境的能力有所提高.产几丁质酶的微生物分布很广泛.细菌中G+和G-菌中大部分能产生几丁质酶.自然界中，海洋、河流和土壤中都分布着大量几丁质酶产生菌，其中一些滩、海水、盐碱地、盐场、温泉是碱性几丁质酶产生菌理想的分布场所.几丁质酶产生菌分布广泛这一特点，为研究几丁质酶提供了更广阔的空间[7].2 微生物几丁质酶的分类几丁质酶可以依据它的结构和性质进行分类.根据反应的所需的最适pH值，可分为酸性、中性和碱性几丁质酶.根据底物作用部位和产物的不同，可以分为外切几丁质酶和内切几丁质酶.外切几丁质酶的作用部位是底物寡糖链的非还原性末端，将单糖一次切下来；内切几丁质酶的作用部位是底物寡糖的糖苷键，所获得的水解产物是几丁寡糖和几丁二糖.根据分泌性质的不同，可以分为胞外几丁质酶和胞内几丁质酶，相当部分的微生物能够产生胞外酶.按照国际酶学的标准，根据氨基酸序列的同源性，几丁质酶又可以分为18和19两个家族.微生物几丁质酶主要是18家族，19家族主要是指植物几丁质酶.3 微生物几丁质酶的基本性质微生物几丁质酶的分子量大小有很大的差异性，大小一般在20～100 KD之间[11]，通常放线菌产几丁质酶的分子量多在30 KD[12]，而细菌、真菌所产酶分子量变化较大.一种微生物不只产生一种几丁质酶，可以同时产生几种分子大小的几丁质酶，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens )可以同时产生5种分子大小的几丁质酶，分别为21、36、48、52、57 KD[13].大部分微生物几丁质酶是酸性蛋白，等电点一般是3.6～8.6，最适pH值范围一般为3～11.如红霉素链霉菌(S.erythraeus)产几丁质酶的pI为3.7，而烬灰红链霉菌(S.cinerecruber)产几丁质酶的pI为8.6 [12].微生物几丁质酶对热比较稳定，在4℃～60℃之间都具有酶活性，有些酶的活性温度甚至接近于100℃.例如激烈热球菌的几丁质酶在98℃～100℃仍然有活性，地衣芽孢杆菌的几丁质酶在100℃处理10 min后仍有一半多活性[7].大部分微生物几丁质酶的产生需要在相应几丁质的诱导下产生，通常几丁质、脱乙酰几丁质以及几丁质水解产物对几丁质酶的产生均有诱导作用，但几丁单糖没有诱导作用.微生物几丁质酶的活性，还会受一些金属离子的影响.一些金属离子如K+、Na+、Mg2+、Ca2+等对微生物产几丁质酶活力没有抑制作用，而具有激活作用，例如1～40 mmol/L的Mg2+；Fe3+对Bt几丁质酶有一定的抑制作用，在浓度12 mmol/L时可使酶活力降低54.6 %[14].一些重金属离子如Hg2+、Pb2+、Cu2+等对几丁质酶一般有抑制作用，它们可使酶变性而导致失活[9,11].4 微生物几丁质酶的结构不同几丁质酶差异较大，多数微生物几丁质酶的基因以单拷贝形式存在，包括启动子、SD序列、结构基因和终止子，这与原核生物的基因结构相似.在相应的蛋白结构上从N端到C端依次为信号肽、几丁质酶催化区、几丁质酶结合区和一个C端区域.信号肽在该基因结构中占很大比重，因为大多数微生物几丁质酶是胞外分泌酶，所以信号肽起着很大的作用[15].信号肽的断裂位点通常在两个Ala之间，但是有些微生物几丁质酶基因的表达体发生变化时，其信号肽的断裂位点会发生变化，断裂位点可能在Ala与另一种氨基酸之间发生.有些微生物信号肽可能会出现表达载体中无法进行分泌表达的现象.信号肽的长短因微生物的不同而不同，如果同源性高那么信号肽的相似性就比较高.有些细菌的几丁质酶基因转移到宿主细胞以后，几丁质酶基因的信号肽的断裂位点会发生改变，可能是由于不同的细菌对蛋白的输出机制不同引起的[5].几丁质酶发挥催化作用的关键部位是催化区，这一部分的同源性很高，它们都含有两个高度保守的区段.有的微生物几丁质酶有两个催化区，这样可以增强酶活性.结合区起到识别并结合相应的底物的作用，它不会增加酶催化的效率.结合区具有保守的6个半胱氨酸的结构，结合区对于酶催化不可溶的几丁质是必需的，而对于可溶的几丁质底物，结合区则不是必需的[16].结合区中的6个半胱氨酸是必需基团，任何一个半胱氨酸的缺失都会导致结合功能的丧失[17].N 端和C端合区的结合速度是不同的，一般N端催化底物结合的速度比C端快.N端表现的是外切酶的活性，C端表现的是内切酶的活性，并且有实验证明其内切活性要比外切活性高.目前对于18家族几丁质酶研究发现，催化区都含有2个Asp和1个Glu，可能是18家族几丁质酶发挥活性的关键氨基酸.位于18家族β3和β4链上的两段氨基酸序列是高度保守的.18家族几丁质酶蛋白质的三级结构是相似的，都具有由α螺旋和β折叠构成的圆桶形结构，中心是由平行的β折叠结构组成的内桶.β1～β8依次由α螺旋结构连接，β折叠和α螺旋由一段无规卷曲连接起来.19家族几丁质酶的三级结构和溶菌酶的三级结构比较相似.18和19家族的水解产物有所不同，18家族的水解产物是β异构体，19家族的水解产物是α异构体，催化水解产物的不同是由催化机理的差异产生的[8].5 微生物几丁质酶基因的表达调控微生物几丁质酶基因的表达调控是抑制物/诱导物的双向调控.几丁质或其降解物对表达起到诱导作用，而一些易被利用的碳源如葡萄糖常起到抑制剂的作用.例如在木霉的培养基中加入几丁质发现有高活性的几丁质酶表达，加入纤维素、壳聚糖则不能增加几丁质酶的合成，反而还会阻遏几丁质酶的合成.在这种抑制物/诱导物体系中，N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖的存在都会抑制几丁质酶的高水平表达，但培养基中仍有少量几丁质酶的表达.还有人发现在高诱导物存在的情况下，即使有抑制物的存在仍有少量几丁质酶表达.因此，有人推测产几丁质酶的微生物中有一部分几丁质酶是组成型表达的[8].有研究发现，微生物几丁质酶基因的调控系统对自身可能有一定保护作用.在所有的培养过程中，壳二糖酶的表达总是伴随着几丁质酶的表达，壳二糖酶的作用是对起抑制作用的几丁质酶降解产物-N-乙酰葡萄糖胺进行有效降解.那么具有这种系统的产几丁质酶微生物可能是为了满足自身营养需要，而抑制物/诱导物系统能够防止几丁质酶过量表达对微生物自身伤害[8].由于几丁质的多样性，所以产生的几丁质酶各异，不同几丁质酶可以同工酶的形式分泌并相互有顺序的进行调节，构成了几丁质酶基因调节的多样性[7].对大多数产几丁质酶的微生物来说，葡萄糖能够抑制几丁质酶的高表达.例如18家族和19家族的几丁质酶有相似与葡萄糖有关的调控系统，他们启动子区有一对相似的直接重复序列同几丁质的诱导及葡萄糖的抑制有关.该调控系统和菌体的能量代谢系统有关，且受分解代谢产物的阻遏.6 微生物几丁质酶的应用6.1 微生物几丁质酶基因在植物抗病方面的研究应用病虫害是植物所面临主要病害之一，生物防治可以有效的减少传统农药在农业病害防治中所带来的环境污染等负面影响[18].近年，许多科学家开始关注生物防治农业病害，研究出许多具有强抗虫特性的转基因植物，由于几丁质酶的抗虫特性，利用几丁质酶基因防治植物病虫害也成为人们关注的热点[19-22].昆虫的体表以及部分消化系统的成分含有几丁质，几丁质酶将昆虫的几丁质成分水解，昆虫因无法正常的生长发育而死亡，这种方法高效性强.一些科学家将真菌的几丁质酶基因转入植物增加了植物的抗病虫性，已经获得成功的转基因植物包括烟草、马铃薯、矮牵牛、大豆、棉花、水稻和玉米等[23-26].在害虫防治方面，几丁质酶还具有增效作用.比如几丁质酶对苏云金芽孢杆菌制剂有增效作用.主要原因是许多昆虫围食膜的主要成分是几丁质，围食膜是昆虫防止病原细菌或病毒感染的一道天然屏障.少量几丁质水解昆虫幼虫肠中的几丁质后，对于苏云金芽孢杆菌制剂侵染害虫幼虫起到辅助作用.从而加速幼虫患病，提高幼虫死亡率[27,28].6.2 几丁质酶的水解产物可作为生长促进因子几丁质酶的某些水解产物还是促进生长的生长因子.N-乙酰几丁寡糖可促进肠道内有益菌的增殖，同时可以抑制大肠杆菌及肠道内病原菌是生长[28].对于双歧杆菌促进因子(Bifidus factors, BF)的研究结果显示，几丁寡糖和壳寡糖是BF的重要种类，它们可以促进双歧杆菌的生长，调节动物肠道内微生物的代谢活动，改善肠道内微生物的分布.这些水解产物对于提高动物的免疫系统及营养物质的吸收发挥了重要作用.6.3 在调节生命代谢活动中的应用几丁质酶降解几丁质可获得具有生物活性的寡糖片段-氨基寡糖素.氨基寡糖素在调节植物细胞生命代谢活动中起着重要的作用.作为植物功能调节剂，可以调控植物基因的关闭与开放，还可以诱导植物产生抗性酶，调节植物的生长和增强植物对病原真菌的抗性.6.4 其他方面应用的研究进展现在的环境污染问题是全球关注的焦点问题，将产几丁质酶微生物应用于治理环境污染方面的研究进来有所进展.人们的日常生活会产生很多几丁质废弃物，例如一些蟹壳、虾壳等生活废弃物，以及这些废弃物造成水体污染都会带来很大的环境污染问题[29].当然，除了生活污染还有工业带来的污染问题.为了很好的解决这些环境问题，人们开始大量研究用产几丁质酶微生物处理几丁质来解决它所带来的污染问题.产几丁质酶微生物应用前景是相当广泛的，它们的分布和种类优势是进行相关研究的有利条件.同时，还可以进行于生物制剂生产的研究.目前，很多关于产几丁质酶微生物以几丁质作为碳源的研究有了一定进展，这一研究还可以应用于它们的抑菌研究.7 展望随着几丁质酶基础理论和应用研究日益受到重视，几丁质酶研究已成为几丁质科学中的一个重要分支，其应用前景十分广阔，可应用于医药、化工、功能食品、纺织、印染、造纸及环境保护等诸多工业部门和领域.我国对几丁质酶的研究起步较晚，但近年来国内对几丁质酶基因的研究也日益重视，目前已经分离出了多种几丁质降解菌，并已从多种微生物克隆出了几丁质酶基因.目前，虽然对几丁质酶及其基因的研究报道较多，但由于其多样性、调控机理的复杂性，再加上从自然界中分离到的酶活性不是太高，因此距离工业应用的要求还有一定距离.今后应进一步加强对几丁质酶基础理论的研究，并利用现代生物学技术对现有的几丁质酶进行定向改造或筛选出新的活性更强的几丁质酶，以适应工业化生产的需要.[参考文献]【相关文献】[1]Wen-Teish Chang, San-Lang Wang. 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什么是改性几丁质？改性几丁质生物胶的使用方法是什么？

什么是改性几丁质？改性几丁质生物胶的使用方法是什么？产品主要成分1.改性几丁质几丁质又名甲壳素，是从深海贝壳中提取的一种生物活性物质，去掉乙酰胺基后生成几丁聚糖(壳聚糖)能溶于烯酸。

几丁质脱乙酰化程度越高，生物活性越强，当其脱到分子量低于10万时，能溶于水，称之改性几丁质，具有以下作用：(1)止血止痛，杀菌消毒，从而促进伤口愈合;(2)促进细胞的活化作用，可大量产生胶原纤维，使伤口不留下疤痕，促进创面愈合;(3)有很强的吸附作用，可以吸附毒素和炎症介质，减轻对局部的损伤作用从而缩短炎症过程，加快组织修复。

2.聚维酮碘聚维酮碘(PVP-I)它具有广谱，高效，无毒，稳定性好，无刺激性，无过敏性反应等特点。

PVP作为载体，能增加碘的稳定性及溶解度，而其本身是优良的表面活性剂，它有助于药液对组织，物具的湿润，渗透，从而增加了碘的杀菌作用。

聚维酮碘与皮肤粘膜接触后释放出活性碘，后者能直接作用于菌体蛋白质，干扰氨基酸的合成，降低脂质膜流动性，从而使微生物死亡。

活性碘对各种细菌，病毒，真菌，原虫，衣原体，支原体均有杀灭作用，如金黄色葡萄糖菌，溶血性链球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌，淋球菌，白色念球菌，梅毒螺旋菌，人乳头瘤样病毒，单纯疱疹病毒等。

二.产品特点1.杀菌力强、抗菌谱广、无耐药性;2.调节创面、病变部位及阴道等内环境，增强其免疫力;3.生物活性极强，能使创面、粘膜、皮肤等组织迅速得到修复;4.无毒，无排异性，使用方便，患者依从性好。

三.临床适应症本品适用于各型阴道炎、宫颈糜烂等妇科疾病;手术及外伤创口等皮肤创面感染;细菌性、真菌性、病毒性皮肤感染;烧烫伤、褥疮、痔疮、溃疡、皮肤湿疹;户外运动的防护等。

1、妇产科本品能杀菌止痒，修复粘膜，调节引导内环境，消除阴道异味，恢复阴道正常的生理环境。

本品利用光滑导管将生物胶送到病变部位，迅速地铺展于粘膜上，能迅速有效地杀灭和清除阴道内致病菌，且本品具有很好的生物相溶性，在一定时间内会自然降解，安全无残留，是一种集治疗、预防和保健于一体的高端妇科产品。

几丁质——精选推荐

⼏丁质简介收起⼏丁质⼜名甲壳素、甲壳质，其有效成分是⼏丁聚糖（壳聚糖）。

在⾃然界中，⼏丁质存在于低等植物菌类、藻类的细胞，节肢动物虾、蟹、昆⾍的外壳，⾼等植物的细胞壁等，是除纤维素以外的⼜⼀重要多糖。

因⼏丁质的化学结构和植物纤维素⾮常相似，故⼏丁质⼜称做动物性纤维。

值得⼀提的是，节肢动物的外壳中有35%的蛋⽩质、30%的钙和⽆机盐、剩下的就是35%甲壳质。

在提取⼏丁质的加⼯⼯艺中，需要经过酸液及碱液的处理才能得到⼏丁质，⽽后再经脱⼄酰化的处理才能得到具有⽣理活性的⼏丁聚糖（壳聚糖）。

因此可以说，⼏丁质脱⼄酰化的程度越⾼，其有效成分的浓度就越⾼，相对⽽⾔对⼈体的⽣理功能也就越强。

组成收起⼀般由虾蟹壳提炼的⼏丁质，约含有 15% 的胺基（-NH2）与 85% 的⼄酰基（-COCH3）。

结构为β-聚- N-⼄酰葡糖胺。

这种物质含碳⽔化合物和氨，性柔软，有弹性，与钙盐混杂则硬化，形成节肢动物的外⾻骼。

⼏丁质不溶于⽔、酒精、弱酸和弱碱等液体，有保护功能，但可溶于浓盐酸、硝酸、硫酸。

在强碱作⽤下分解成脱⼄酰⼏丁质和⼄酸，脱⼄酰⼏丁质进⼀步在浓盐酸的作⽤下则⽔解成葡糖胺和⼄酸。

另外，⼏丁质脱⼄酰化的程度越⾼，发挥的⽣理效应也越强，当脱⼄酰度达到90%以上时，在⼈体中的利⽤率会越⾼。

国际医学营养⾷品学会将这种物质命名为除糖、蛋⽩质、脂肪、维⽣素、矿物质、⽔和纤维素七⼤⽣命要素后的第⼋⼤⽣命要素，越来越受到⼴泛关注。

抗癌特性收起⼏丁质能够利⽤机体⾃⾝的免疫⼒去战胜体内种种致病因⼦，抑制肿瘤⾎管内⽪细胞的⽣成，使癌肿的⽑细⾎管不能加长，癌肿不能向周围组织浸润或转移，抑制癌细胞毒素，活化能杀死癌细胞的淋巴细胞、抑制癌细胞转移。

在⼈体内⼏丁质通过直接活化巨噬细胞、⾃然杀伤细胞（NK细胞）、攻击肿瘤细胞（LAK细胞）、B淋巴细胞、T淋巴细胞的活性，增强机体免疫监视功能，消除体内有毒有害因⼦，因⽽成为众多癌症患者的良友。

⼏丁质还可通过其带正电荷碱性氨基，帮助降低⾎压、⾎脂、⾎糖，具有强化肝功能，调节神经和内分泌系统，促进体内微量元素的代谢等功效。