酶的固定化与化学修饰技术
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
(三)固定化酶最适温度
酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。由于固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是非常有利的结果。例如，汤亚杰等以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶其最适温度为80 ，比天然酶提高了30 .酶固定化后，也会出现最适温度不变或下降的例子。[3]
(四)固定化酶的稳定性
酶的固定化与化学修饰技术
【摘要】近十年中在酶的研究方面最有意义的进展，主要是酶固定化知识的拓展。本文主要叙述了固化酶的制备方法、固化酶的特点及其实际应用。而酶的固定化与化学修饰也有紧密的联系，因此简要叙述了化学修饰技术的定义、作用、原理及应用。
【关键词】固定化酶；化学修饰；技术；应用
引言
固定化酶是一种在空间的运动受到完全约束或局部约束的酶。通常这样可得到非水溶性形式的酶，由于几方面的原因使人们对这种酶产生兴趣。首先，从反应液中回收酶比较容易，因而从酶反应器的经济意义上考虑显然是重要的。其次，生物化学家把它作为在活细胞内酶与膜正常结合的模型系统是有用的。新一代基因工程酶制剂的开发研制，无疑是使酶工程如虎添翼。固定化基因工程菌、基因工程细胞技术将使酶的威力发挥得更出色，科学家们预言，如果把相关的技术与连续生物反应器巧妙结合起来，将导致整个发酵工业和化学合成工业的根本性变革。
4.分析、临床诊断和医疗上的应用
固定化生物催化剂在分析上的应用之一就是将固化酶与分光度计、荧光光度计和微量热量量计等组合起来，以此来自动进行化学分析或临床诊断。为定量液中的代谢物质、抗体、抗原和发酵液中的有用物质，为测定菌数和检测工厂中的有害物质，正在研究具有生物特异性的电极开发。例如“酶传感器”，“微生物传感器”，“细胞器传感器”，“免疫传感器”等各种传感器。[8]
四、固定化酶的应用
1.工业过程中的应用
(1)用固定化氨基酰胺化酶连续生产L-氨基酸
(2)用固定化微生物连续生产L-天冬氨酸作为医药品、食品添加剂和甜味原料而被大量使用。
(3)用固定化微生物连续生产苹果酸。
(4)其他有用物质的生产，如6-氨基青霉烷酸(6-APA)的连续生产等。[6]
2.在食品工业上的应用
4、用于蛋白质分子构象变化及运动性
5、利用亲和标记探测
6、利用交联反应研究寡聚蛋白质亚基之间的排列及受体与激素的相互作用
7、蛋白质单晶的同晶置换：X-晶体衍射
8、固定化酶改造蛋白质的性质，而化学修饰主要是让酶与载体连接得更加稳固，同时让酶活不至于降低。
四、酶化学修饰的基本原理
1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性
5.其他方面的应用
把固定化生物催化剂用于化工过程，主要障碍是酶在有机溶剂中不稳定。但如果使用福井等开发的光交联树酯或氨基甲胺酯的顶聚合物来固定化生物催化剂，则在非水溶液中是稳定的，它可用于淄体的转化。今后能研究出在非水溶液也可进行反应的固定化生物催化剂，那它的应用范围可进一步扩大。
II化学修饰技术
一、化学修饰技术定义
修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。
如何保护酶活性部位与抗抑制剂
大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或是静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。
3、如何维持酶功能结构完整性与抗蛋白水解酶
酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：
(1)大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。
(二)固化酶最适pH值变化
酶催化能力对外部环境pH值特别敏感。酶固定化后，对底物作用的最适pH
与游离酶不同，酶活力pH曲线常常发生偏移。[2]一般说来，用带负电荷载体制备的固定化酶会向碱性偏移，最适pH值较天然的酶高。而带正电荷的载体制备的固定化酶最适pH值向酸性偏移，最适pH值较天然酶的低。使用不带电荷的载体制备的固定化酶，pH值不发生偏移。
(2)改变了酶分子上氨基酸的离解状态和他们之间的相互结合及作用方式。许多大分子修饰剂本身就是多聚电解质，能在酶分子表面或微环境区域形成一层“缓冲外壳”[2]。
五、化学修饰在酶结构与功能研究中的应用
1、生物技术领域：改变酶的最适pH、改变酶与底物专一性、有机溶剂可溶解酶、提高耐热、酸、碱的能力。
对酶进行改造和修饰也是酶工程的一项重要内容。酶的作用力虽然很强，尤其是被固定起来之后，力量就更大了，但并不是所有的酶制剂都适合固定化的，即使是用于固定化的天然酶，其活性也往往不能满足人们的要求，需要改变其某些性质、提高其活性，以便更好地发挥其催化功能。于是，酶分子修饰和改造的任务就被提出来了。
I固定化酶
2.分散法
将酶分散于水不溶相中从而实现固定化的方法。可以通过过滤和离心的方法将酶进行分离和再利用。
二、固定化酶的性质
(一)固定化酶的活力
在同一测定条件下，固定化酶活力要低于等摩尔的原酶活力。原因可能是：①固定化过程中酶分子的空间构象发生变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；②固定化后，酶分子空间位阻受到限制，会直接影响到活性中心对底物的定位作用；③内扩散阻力使底物分子与活性中心接触受阻；④包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶接触。
(2)酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
4、如何消除酶的抗原性
酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成共价键。破坏了抗原决定簇既抗原性降低乃至消除。“遮盖”了抗原决定簇阻碍抗原、抗体结合。
5、酶微环境稳定的维持
pH值改变时：
(1)破坏了酶分子上静电形成的化学键，氢键等维持天然构象的平衡力。
（四）交联法
交联法是用具有二个或二个以上功能团的试剂作用于酶和酶蛋白中的氨基、酚基、羟基、巯基等发生反应而使酶分子交联的一种固定方法。
（五）非共价键结合法
对于在不溶的有机相中进行的反应，最简单的固定方法是结晶法和分散法。
1.ຫໍສະໝຸດ Baidu晶法
就是使酶结晶从而实现固定的方法。对晶体来说，载体就是酶蛋白本身，它提供了非常高的酶浓度。对于活力较低的酶来说，这一点就更具优越性。
一、固定化酶的制备方法
（一）包埋法
1.网格型
载体材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子化合物以及淀粉、胶原、明胶、海藻酸和角叉菜胶等天然高分子化合物。
2.微囊型
微囊型固定化酶通常直径为几微米到几百微米的球状体，颗粒比网格要小得多，比较有利于底物和产物扩散，但是反应条件要求高的制备成本也高。制备微囊型固定化酶有下列几种方法。
三、固定化酶的优缺点
(一)优点
①酶的稳定性增强；②没能反复利用；③可实现连续化酶反应；④可根据需要制成不同性质及形状的固定化酶；⑤可缩小反应器体积；⑥反应条件易控制；⑦可提高反应产物的纯度和产率；⑧具有充分利用资源、节省能源、保护环境方面的优点。
(二)缺点
①由于多一步固定化操作，有时会使活性酶的总量减少；②由于固定化需要载体，因而多了载体成本费及固定化操作费用；③因固定化酶颗粒内扩散阻力等原因会使反应速率下降。[5]
（二）吸附法
1.物理吸附法
酶被吸附于不溶性载体的一种固定方法。载体有无机载体、天然高分子载体、大孔型合成树脂等。
2.离子吸附法
这是酶通过离子键吸附于有离子交换的水不溶性载体的固定方法。主要载体有阴离子交换剂如DEAE－纤维素；阳离子交换剂如羧甲基纤维素等。
（三）共价偶联法
这是酶与载体以共价键结合的固定方法，是共价键偶联法中报道最多的方法。共价偶联法所用的载体主要有：天然有机载体、无机载体、合成聚合物等。酶分子中可以形成共价键的基团主要有：α、β或γ位的羟基、巯基、咪唑基、酚基等。[1]
固定化酶的稳定性较天然酶的高。Merlose曾选择50种固定化酶，就是其稳定性与固定化之前的酶进行比较，发现其中有30种酶固定化稳定性提高，12种酶无变化，只有8种稳定性降低。[4]然而目前尚未找到固定化方法与稳定性之间的规律性，因此要预测怎样才能提高稳定性还有一定的困难，但大多数情况下酶经过固定化后稳定性提高了。
通过添加或去除蛋白质或是核酸等分子上的某些功能基团而改变酶、蛋白质或基因活性的过程。
二、酶化学修饰原因
1、稳定性
2、酶反应的最适条件
3、酶的专一性
4、米氏常数过大
5、临床应用的特殊要求
6、酶的种类限制
三、化学修饰的作用
1、探测蛋白质必须集团的性质和数目
2、用于蛋白质纯度鉴定
3、用于蛋白质一级结构的测定
在食品工业中酶的应用历史相当久远，但固定化酶的应用主要是固定化乳糖酶制造低乳糖牛奶，固定化葡萄糖异构酶制造果葡糖浆（高果糖浆）等。酶的固定化在食品工业中的应用不是很多目前还有好多困难要克服，但用固定化酶进行淀粉糖化，用固定化酶制造干酪等的工业化生产也已指日可待了。
3.固定化增殖微生物的应用
固定化微生物一般与所固定化的微生物细胞的死活没有关系，它大致可分为两种情况，即利用特定酶活性的场合利用活细胞的场合。固定化生产L-天门冬氨酸和苹果酸的反应是一部反应，菌体都是死菌，但它却稳定保留着高活性的目的酶。到70年代末期，试图保持固定化细胞的生长状态象通常发酵那样，对需要ATP、氧化还原系统或辅酶再生体系等多酶反应系统做出了广泛的研究。[7]这个方法是一面不断地供给固定化微生物以营养源，同时也利用其活细胞的代谢状态。现在正在开展用这种固定化增殖微生物来生产酒精、有机酸、氨基酸、抗生素、激素及酶等有用物质的研究。
酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。由于固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是非常有利的结果。例如，汤亚杰等以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶其最适温度为80 ，比天然酶提高了30 .酶固定化后，也会出现最适温度不变或下降的例子。[3]
(四)固定化酶的稳定性
酶的固定化与化学修饰技术
【摘要】近十年中在酶的研究方面最有意义的进展，主要是酶固定化知识的拓展。本文主要叙述了固化酶的制备方法、固化酶的特点及其实际应用。而酶的固定化与化学修饰也有紧密的联系，因此简要叙述了化学修饰技术的定义、作用、原理及应用。
【关键词】固定化酶；化学修饰；技术；应用
引言
固定化酶是一种在空间的运动受到完全约束或局部约束的酶。通常这样可得到非水溶性形式的酶，由于几方面的原因使人们对这种酶产生兴趣。首先，从反应液中回收酶比较容易，因而从酶反应器的经济意义上考虑显然是重要的。其次，生物化学家把它作为在活细胞内酶与膜正常结合的模型系统是有用的。新一代基因工程酶制剂的开发研制，无疑是使酶工程如虎添翼。固定化基因工程菌、基因工程细胞技术将使酶的威力发挥得更出色，科学家们预言，如果把相关的技术与连续生物反应器巧妙结合起来，将导致整个发酵工业和化学合成工业的根本性变革。
4.分析、临床诊断和医疗上的应用
固定化生物催化剂在分析上的应用之一就是将固化酶与分光度计、荧光光度计和微量热量量计等组合起来，以此来自动进行化学分析或临床诊断。为定量液中的代谢物质、抗体、抗原和发酵液中的有用物质，为测定菌数和检测工厂中的有害物质，正在研究具有生物特异性的电极开发。例如“酶传感器”，“微生物传感器”，“细胞器传感器”，“免疫传感器”等各种传感器。[8]
四、固定化酶的应用
1.工业过程中的应用
(1)用固定化氨基酰胺化酶连续生产L-氨基酸
(2)用固定化微生物连续生产L-天冬氨酸作为医药品、食品添加剂和甜味原料而被大量使用。
(3)用固定化微生物连续生产苹果酸。
(4)其他有用物质的生产，如6-氨基青霉烷酸(6-APA)的连续生产等。[6]
2.在食品工业上的应用
4、用于蛋白质分子构象变化及运动性
5、利用亲和标记探测
6、利用交联反应研究寡聚蛋白质亚基之间的排列及受体与激素的相互作用
7、蛋白质单晶的同晶置换：X-晶体衍射
8、固定化酶改造蛋白质的性质，而化学修饰主要是让酶与载体连接得更加稳固，同时让酶活不至于降低。
四、酶化学修饰的基本原理
1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性
5.其他方面的应用
把固定化生物催化剂用于化工过程，主要障碍是酶在有机溶剂中不稳定。但如果使用福井等开发的光交联树酯或氨基甲胺酯的顶聚合物来固定化生物催化剂，则在非水溶液中是稳定的，它可用于淄体的转化。今后能研究出在非水溶液也可进行反应的固定化生物催化剂，那它的应用范围可进一步扩大。
II化学修饰技术
一、化学修饰技术定义
修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。
如何保护酶活性部位与抗抑制剂
大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或是静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。
3、如何维持酶功能结构完整性与抗蛋白水解酶
酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：
(1)大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。
(二)固化酶最适pH值变化
酶催化能力对外部环境pH值特别敏感。酶固定化后，对底物作用的最适pH
与游离酶不同，酶活力pH曲线常常发生偏移。[2]一般说来，用带负电荷载体制备的固定化酶会向碱性偏移，最适pH值较天然的酶高。而带正电荷的载体制备的固定化酶最适pH值向酸性偏移，最适pH值较天然酶的低。使用不带电荷的载体制备的固定化酶，pH值不发生偏移。
(2)改变了酶分子上氨基酸的离解状态和他们之间的相互结合及作用方式。许多大分子修饰剂本身就是多聚电解质，能在酶分子表面或微环境区域形成一层“缓冲外壳”[2]。
五、化学修饰在酶结构与功能研究中的应用
1、生物技术领域：改变酶的最适pH、改变酶与底物专一性、有机溶剂可溶解酶、提高耐热、酸、碱的能力。
对酶进行改造和修饰也是酶工程的一项重要内容。酶的作用力虽然很强，尤其是被固定起来之后，力量就更大了，但并不是所有的酶制剂都适合固定化的，即使是用于固定化的天然酶，其活性也往往不能满足人们的要求，需要改变其某些性质、提高其活性，以便更好地发挥其催化功能。于是，酶分子修饰和改造的任务就被提出来了。
I固定化酶
2.分散法
将酶分散于水不溶相中从而实现固定化的方法。可以通过过滤和离心的方法将酶进行分离和再利用。
二、固定化酶的性质
(一)固定化酶的活力
在同一测定条件下，固定化酶活力要低于等摩尔的原酶活力。原因可能是：①固定化过程中酶分子的空间构象发生变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；②固定化后，酶分子空间位阻受到限制，会直接影响到活性中心对底物的定位作用；③内扩散阻力使底物分子与活性中心接触受阻；④包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶接触。
(2)酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
4、如何消除酶的抗原性
酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成共价键。破坏了抗原决定簇既抗原性降低乃至消除。“遮盖”了抗原决定簇阻碍抗原、抗体结合。
5、酶微环境稳定的维持
pH值改变时：
(1)破坏了酶分子上静电形成的化学键，氢键等维持天然构象的平衡力。
（四）交联法
交联法是用具有二个或二个以上功能团的试剂作用于酶和酶蛋白中的氨基、酚基、羟基、巯基等发生反应而使酶分子交联的一种固定方法。
（五）非共价键结合法
对于在不溶的有机相中进行的反应，最简单的固定方法是结晶法和分散法。
1.ຫໍສະໝຸດ Baidu晶法
就是使酶结晶从而实现固定的方法。对晶体来说，载体就是酶蛋白本身，它提供了非常高的酶浓度。对于活力较低的酶来说，这一点就更具优越性。
一、固定化酶的制备方法
（一）包埋法
1.网格型
载体材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子化合物以及淀粉、胶原、明胶、海藻酸和角叉菜胶等天然高分子化合物。
2.微囊型
微囊型固定化酶通常直径为几微米到几百微米的球状体，颗粒比网格要小得多，比较有利于底物和产物扩散，但是反应条件要求高的制备成本也高。制备微囊型固定化酶有下列几种方法。
三、固定化酶的优缺点
(一)优点
①酶的稳定性增强；②没能反复利用；③可实现连续化酶反应；④可根据需要制成不同性质及形状的固定化酶；⑤可缩小反应器体积；⑥反应条件易控制；⑦可提高反应产物的纯度和产率；⑧具有充分利用资源、节省能源、保护环境方面的优点。
(二)缺点
①由于多一步固定化操作，有时会使活性酶的总量减少；②由于固定化需要载体，因而多了载体成本费及固定化操作费用；③因固定化酶颗粒内扩散阻力等原因会使反应速率下降。[5]
（二）吸附法
1.物理吸附法
酶被吸附于不溶性载体的一种固定方法。载体有无机载体、天然高分子载体、大孔型合成树脂等。
2.离子吸附法
这是酶通过离子键吸附于有离子交换的水不溶性载体的固定方法。主要载体有阴离子交换剂如DEAE－纤维素；阳离子交换剂如羧甲基纤维素等。
（三）共价偶联法
这是酶与载体以共价键结合的固定方法，是共价键偶联法中报道最多的方法。共价偶联法所用的载体主要有：天然有机载体、无机载体、合成聚合物等。酶分子中可以形成共价键的基团主要有：α、β或γ位的羟基、巯基、咪唑基、酚基等。[1]
固定化酶的稳定性较天然酶的高。Merlose曾选择50种固定化酶，就是其稳定性与固定化之前的酶进行比较，发现其中有30种酶固定化稳定性提高，12种酶无变化，只有8种稳定性降低。[4]然而目前尚未找到固定化方法与稳定性之间的规律性，因此要预测怎样才能提高稳定性还有一定的困难，但大多数情况下酶经过固定化后稳定性提高了。
通过添加或去除蛋白质或是核酸等分子上的某些功能基团而改变酶、蛋白质或基因活性的过程。
二、酶化学修饰原因
1、稳定性
2、酶反应的最适条件
3、酶的专一性
4、米氏常数过大
5、临床应用的特殊要求
6、酶的种类限制
三、化学修饰的作用
1、探测蛋白质必须集团的性质和数目
2、用于蛋白质纯度鉴定
3、用于蛋白质一级结构的测定
在食品工业中酶的应用历史相当久远，但固定化酶的应用主要是固定化乳糖酶制造低乳糖牛奶，固定化葡萄糖异构酶制造果葡糖浆（高果糖浆）等。酶的固定化在食品工业中的应用不是很多目前还有好多困难要克服，但用固定化酶进行淀粉糖化，用固定化酶制造干酪等的工业化生产也已指日可待了。
3.固定化增殖微生物的应用
固定化微生物一般与所固定化的微生物细胞的死活没有关系，它大致可分为两种情况，即利用特定酶活性的场合利用活细胞的场合。固定化生产L-天门冬氨酸和苹果酸的反应是一部反应，菌体都是死菌，但它却稳定保留着高活性的目的酶。到70年代末期，试图保持固定化细胞的生长状态象通常发酵那样，对需要ATP、氧化还原系统或辅酶再生体系等多酶反应系统做出了广泛的研究。[7]这个方法是一面不断地供给固定化微生物以营养源，同时也利用其活细胞的代谢状态。现在正在开展用这种固定化增殖微生物来生产酒精、有机酸、氨基酸、抗生素、激素及酶等有用物质的研究。