标准名称-检验检疫标准管理信息系统

ICS

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SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T XXXXX—XXXX

油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法

Detection and Identification of Leptosphaeria maculans (Desm)

Ces. & de Not. of colza

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（征求意见稿）

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

前言

本标准按照GB1.1-2009给出的规则起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准主要起草单位：中华人民共和国湖北出入境检验检疫局，中国检验检疫科学研究院，上海出入境检验检疫局，江苏出入境检验检疫局，华中农业大学等

本标准主要起草人：赵晖，王振华，易建平，吴翠萍，周国梁，曾宪东，李彬，吴品珊，李国庆。

本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。

油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法

1 范围

本标准规定了油菜茎基溃疡病菌的检疫鉴定方法。

本标准适用于油菜繁殖用种子和油用种子、种苗、植株等油菜茎基溃疡病菌的检疫鉴定。

2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

3 原理

3.1 分类地位

油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeria maculans (Desm) Ces. & de Not.)，属真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota)，座囊菌纲（Dothideomycetes），格孢腔菌目（Pleosporales），格孢腔菌科（Pleosporaceae），小球腔菌属（Leptosphaeria），无性态为Phoma lingam。

该病菌在世界上的分布参见附录Ａ

该病菌的寄主广泛，主要有芸苔属植物,如油菜、甘蓝、花椰菜等十字花科作物。可造成油菜茎基及根系腐朽，易于折断而死亡。

3.2 鉴定原理

根据油菜茎基溃疡病菌在培养基上生长的菌落、菌丝、分生孢子和分生孢子器形态，以及其在寄主上的为害症状、形态学特征和PCR特异扩增片段作为鉴定依据。

4 仪器设备和用具

4.1 仪器设备

生物显微镜、体视显微镜、高速冷冻离心机、纯水仪、高压灭菌器、PCR仪、凝胶成像系统、电泳系统、实时荧光PCR仪、培养箱、低温冰箱。

4.2 用具

可调微量加样器（2 μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）及其枪头、网筛（孔径2.5 mm 和1.5 mm）、研钵、吸水纸、培养皿、试管、、研钵、离心管（1.5 mL、1.0 mL）、PCR管（0.2 μL）、量筒、烧杯等。

5 试剂和培养基

除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T 6682。

5.1 1％次氯酸钠。

5.2DNA提取试剂：DNA提取试剂盒，异丙醇，无水乙醇。

5.3PCR试剂：PCR Buffer (含Tris-HCl，MgCl2)，Taq酶，dNTP。

5.4凝胶电泳试剂：琼脂粉，TAE，Loading Buffer，EB。

5.5麦芽琼脂培养基：6 g麦芽提取物，3 g琼脂，200 mL蒸馏水，调整pH至5.2，121℃，15 min灭菌。

5.6 对照菌株：油菜茎基溃疡病菌（Leptosphaeria maculans (Desm) Ces. & de Not.）标准菌株、油菜黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）。

6 检疫鉴定方法

6.1 取样

6.1.1种子：待检样品混匀，取1 kg用作试验样品，用孔径2.5 mm和1.5 mm的网筛过筛试验样品，筛上物多为豆荚等植株残体，筛下物多为油菜籽碎片或小形种子。取筛上物、筛下物和种子各1 g~2 g 用于PCR初筛。

6.1.2植株：主要检查茎根部和叶部。选取叶片上出现圆形或不规则形，稍凹陷，中部灰白色病斑，部分斑内散生许多小黑点症状的病变部位。植茎则选取不规则形淡褐色斑；或灰白色病斑，稍凹陷，上生黑色小点；或茎基及根系溃疡、枯萎症状的病变部位（参见附录B）。

6.2 PCR初筛

6.2.1 样品DNA提取

取筛上物、筛下物和种子，或植株可疑病变组织各1 g ~2 g，液氮研磨后各取样0.1 g ~0.2 g，采用商业化试剂盒提取DNA（参见附录C）。取1 μL样品DNA进行PCR检测，重复3次。用油菜茎基溃疡病菌（Leptosphaeria maculans(Desm) Ces. & de Not.）标准菌株作阳性对照，用油菜黑胫病菌

（Leptosphaeria biglobosa）弱毒株作阴性对照，用蒸馏水作空白对照。

6.2.2 PCR选择一

油菜茎基溃疡病菌L. maculans特异性引物一，LMR1-D：5'-GCGTAAGAAGCGTGCCTTAGAGTC-3' / 5'-TCCTGCTCCTACTCCTTCTCTAGC-3'，预期扩增产物为580 bp。

PCR反应体系为10×PCR buffer（含pH 8.3，100 mM Tris- HCl，500 mM KCl，15 mM MgCl2）2.5 µL，10 mmol/L dNTP 0.5 µL, 10 µmol/L正反引物各1 µL，2.5 U Taq DNA聚合酶，模板DNA为1 µL，总体积为25 µL。

PCR反应程序为94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 40 s，35个循环；72℃ 7 min。

6.2.3 PCR选择二

油菜茎基溃疡病菌L. maculans特异性引物二，Lmb：5’-CACCAATTGGATCCCCTA-3’

/5’-AGGCGAGTCCCAAGTGGAACA-3’，预期扩增产物为276 bp。

PCR反应体系为10×PCR buffer（含pH 8.3，100 mM Tris- HCl，500 mM KCl，15 mM MgCl2）2.5 µL，10 mmol/L dNTP 0.5 µL, 10 µmol/L正反引物各1 µL，2.5 U Taq DNA聚合酶，模板DNA为1 µL，总体积为25 µL。

PCR反应程序为94℃3 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，35个循环；72℃5 min。

6.2.4 PCR扩增产物检测

扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶在1×TAE缓冲液中电泳，EB染色后用凝胶成像系统分析。

需要时可用实时荧光PCR检测（参见附录D）。

6.3 分离培养

6.3.1 样品挑选

若PCR检测结果为阳性，挑选油菜籽、病残体或植株病变组织进行分离培养。在解剖镜下挑选籽