大肠埃希菌检查法

大肠埃希菌检查法

Escherichia Coli Test Method

1.目的

建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。

2.范围

适用于大肠埃希菌检查的操作。

3.责任者

QC 化验员。

4.程序：

4.1.简述

4.1.1.大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等 5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。

4.1.2.用 4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β -D-glucuronide，MUG)和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种 MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如 MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。

4.1.3.原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。

实验证明，96％的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUD)，约 10 ％的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG 被 GUD 水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG 鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG 鉴别大肠埃希菌其漏检率达 6％，鉴于98％的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUG与靛基质试验结合，比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。如MUG与Indole 试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用 EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98％。如仅用 IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。

4.2.仪器、设备及用具

4.2.1.无菌室

4.2.2.净化工作台

4.2.3.培养箱(36±1℃)

4.2.4.高压蒸汽灭菌器

4.2.

5.显微镜(1500X)

4.2.6. 微波炉

4.2.7. 恒温水浴( 45 ± 1 ℃)

4.2.8. 离心机 (500 ～ 4000r/min)

4.2.9. 0.45 μ m ± 0.02 μ m 薄膜及

4.2.10. 电冰箱

4.2.11. 匀浆仪

4.2.12. 366nm 紫外灯

4.2.13. 玻璃器皿、器具

4.3.试液、指示液

4.3.1.0.9％无菌氯化钠溶液取氯化钠 9.0g，加水使溶解成 1000ml，121℃ 灭菌 20 分钟。

4.3.2.靛基质试液取氯化二甲氨基苯甲醛

5.0g，加入戊醇(或丁醇)75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸 25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免聚热导致溶液色泽变深，或取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95％乙醇 95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸 20ml 徐徐滴入。

4.3.3.甲基红指示液取甲基红 0.1g，加95％乙醇 300ml，使溶解后加水至500ml，即得。

4.3.4.V-P 试液

α-萘酚乙醇试液：取α－萘酚 6.0g，加无水乙醇溶解使成 100ml。氢氧化钾试液：取氢氧化钾 40.0g、加水使溶解成 100ml。

4.3.

5.革兰染色液

4.3.

5.1.结晶紫染液取结晶紫 1.0g、95％乙醇 20ml、1％草酸铵

[(NH4)2C2O4] 溶液 80ml。将结晶紫溶于乙醇后，与草酸铵混合，静置48h，置密闭棕色瓶，可存放数月。

4.3.

5.2.革兰碘液碘 1.0g、碘化钾 2.0g、蒸馏水 300ml。用少量水溶碘化钾，再加碘，待全溶后，加蒸馏水至 30ml，置棕色瓶备用。

4.3.

5.3.脱色液 95％乙醇

4.3.

5.4.沙黄(番红)染液沙黄(SafranineO)0.25g、95％乙醇 10ml、蒸馏水

适量，将沙黄加入乙醇中，完全溶解后再加水至 100ml。

4.3.6.亚甲蓝指示液取亚甲蓝 0.5g，加水溶解使成 100ml。

4.3.7.溴麝香草酚蓝指示液取溴麝香草酚蓝 0.4g，加1mol/L 氢氧化钠溶液0.64ml 使溶解，再加水稀释至100ml。变色范围 pH6.0～7.6(黄→红)

4.3.8.酸性品红指示液取酸性品红 0.5g，加水 100ml 溶解，再逐渐加

1mol/L 氢氧化钠溶液 16ml，每加1 滴需将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于沸水中保持15 分钟，静置 2小时，滤过，即得。变色范围

pH6.0～7.4(黄→红)。

4.3.9.曙红钠指示液取曙红钠 2.0g，加水溶解使成 100ml。

4.3.10.无菌聚山梨酯80-氯化钠溶液取聚山梨酯80 1ml加0.9％氯化钠溶液使成 100ml，121℃灭菌 20 分钟。

4.3.11.无菌磷酸盐缓冲液(pH7.2) 取磷酸氢二钠 2

5.8g 与磷酸二氢钠 4.4g，加水稀释至 1000ml，121℃灭菌 20 分钟。

4.3.12.无菌对氨基苯甲酸试液取对氨基苯甲酸 0.1g，加入含 10ml 水的具塞试管中，121℃灭菌 20 分钟。