微生物综合实验报告

实验题目：检测水中大肠杆菌群数量

组员姓名：郑伟周宇

作者单位：南京工业大学生物与制药工程学院

摘要：实验采用自来水作为样品，利用多管发酵法对样品进行培养,接种，分离，纯化，得到具有不同特征的肠杆菌。通过对肠杆菌的数量和形态特征的分析，确定自来水是否被污染和污染程度。

关键词：水源；肠杆菌；多管发酵；数量；污染

前言：水是制药和食品行业使用最为广泛的原料，也是我们日常生活离不开的、赖以生存的基础。水与药品、食品中的其他原料一样，必须符合既定的质量标准，如果水被污染就会影响多批次产品。另外，对微生物实验室来说，水是各种培养基、缓冲液、检测剂的主要组成部分。必须严格控制水的微生物学质量，以保证医药食品产品、培养基、试剂等的质量的可靠性以及人类用水的安全。

制药用水微生物监测是为了监控控制性微生物从而将水中微生物含量维持在一定水平。没有必要将水中存在的所有微生物都监测出来，只针对对产品对人具有潜在危害的致病性的微生物进行监控。流行病学研究确认，水携带的病原菌的存在与肠道来源的细菌相关，肠道病原微生物进入水体，随水流传播可引起肠道病爆发流行，所以必须对水中病原微生物严格监控。但要从水体中直接检出病原微生物比较困难，它们在水中的数量很少且培养条件苛刻，分离和鉴别都比较难，即使样品检测结果是阴性也不能保证没有病原微生物的存在。因此，常用指示微生物作为水体中病原微生物的监测指标。大肠菌群细菌在人的肠道和粪便中数量很多，受到粪便污染的水容易被检出，且检测方法比较简易。所以，常以大肠菌群为微生物评价水的卫生质量。大肠菌群是一群需氧或兼性厌氧的、在37℃培养24~48h 能发酵乳糖产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌，包括埃希菌属（Escherichia)、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、肠杆菌属（Enterobacter）、克雷伯菌属（Klebsiella）。大肠菌群数是指每升水中含有的大肠菌群的近似值，根据水中大肠菌群的数目即可判断水源是否被粪便污染，并推断水源受肠道病原菌污染的可能性。本实验主要通过多管发酵法检测水中大肠菌群的数量。

1、材料和方法

1.1 材料：

1.1.1 水样

自来水

1.1.2 培养基

乳糖蛋白胨培养基：蛋白胨2.4g；牛肉膏0.72g；乳糖1.2g；氯化钠1.2g；1.6%溴甲酚紫溶

液0.24mL；蒸馏水240mL；pH7.4（分装于试管中，内含倒置杜氏小管）。

3倍浓度乳糖蛋白胨培养基：蛋白胨1.05g；牛肉膏0.315g；乳糖0.525g；氯化钠0.525g；

1.6%溴甲酚紫溶液0.105mL；蒸馏水35mL；pH7.4（分装于试管中，内含倒置杜氏小管）。

伊红-美篮(EMB)培养基：伊红-美篮(EMB)培养基粉末4.24g；蒸馏水100mL；pH7.2。

1.1.3 灭菌水

作阴性对照。

1.1.4 接种大肠埃希菌的水样

作阳性对照。

1.1.5 试剂盒染色剂

草酸铵结晶紫染液、路歌碘液、番红染液。

1.1.6 仪器设备

超净工作台、恒温培养箱、显微镜、高压蒸汽灭菌仪等。

1.1.7 其他

灭菌移液管、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、擦镜纸等。

1.2 实验方法：

1.2.1 初发酵试验

1.2.1.1 标记试管

取5支3倍浓度乳糖蛋白胨培养基试管，标记加水量10mL；5支乳糖蛋白胨培养基试管，标记加水量1mL；5支乳糖蛋白胨培养基试管，标记加水量0.1mL。

取2支3倍浓度乳糖蛋白胨培养基试管，标记阳性对照和阴性对照和加样量10mL；2支乳糖蛋白胨培养基试管，标记阳性对照和阴性对照和加样量1mL；2支乳糖蛋白胨培养基试管，标记阳性对照和阴性对照和加样量0.1mL。

1.2.1.2 接种

用移液枪分别取10mL水样加入标记好的3倍浓度乳糖蛋白胨培养基试管内；分别取1mL水样加入标记好的乳糖蛋白胨培养基试管内；分别取0.1mL水样加入标记好的乳糖蛋白胨培养基试管内，轻轻摇匀。

1.2.1.3 制备阳性对照

用移液枪分别取接种E.coli的水样10mL、1mL、0.1mL加入以上标记好的试管中。

1.2.1.4 制备阴性对照

用移液枪分别取灭菌水10mL、1mL、0.1mL加入以上标记好的试管中。

1.2.1.5 培养

将以上接种后的所有试管放入37℃培养箱中培养48h。

1.2.1.6 观察实验结果

观察记录各加水量产酸产气的试管数，即为阳性管数。若有a支3倍浓度培养基试管产酸产气，有b支1倍浓度培养基加水量1mL的试管产酸产气，有c支1倍浓度培养基加水量0.1mL的试管产酸产气，则阳性组合为a-b-c。根据大肠菌群存在的管数查大肠菌群检数表得出每100mL水样中大肠菌群 MPN，报告每升水样中大肠菌群数。对于表中未列出的组合，可利用Thomas公式计算最大可能数。

MPN/100mL=(阳性管数*100）/exq（阴性管中水样体积*全部试管中水样体积）

单位（mL）

1.2.2 平板分离

1.2.2.1 划线接种

将产酸产气试管中的培养物在EMB平板上进行划线接种，于37℃培养箱培养24h

1.2.2.2 观察培养后的菌落特征

菌落特征类型：

菌落深紫色，有金属光泽——典型大肠菌群菌落；

菌落深紫色，无金属光泽——典型大肠菌群菌落；

菌落粉红色，黏稠状，不透明——非典型大肠菌群菌落；

其他特征。

1.2.2.3 镜检

挑选呈以上三种菌落特征的菌种进行革兰氏染色，用显微镜观察革兰氏染色结果和有无芽孢。

1.2.3 复发酵试验