养殖对虾中氯霉素的分析

中图分类号：中图分类号：S859.796; 文献标识码：A；文章篇号:1007-2764(2003)03-0028-66 养殖对虾中氯霉素残留的放射免疫分析

徐美奕 孟庆勇

(广东医学院分析中心 湛江 524023)

摘 要：采用放射免疫分析法测定了湛江市水产市场3份新鲜养殖对虾及2份出口养殖对虾氯霉素残留量。结果表明，本方法的检测限量为0.15ppb，3份新鲜养殖对虾体内氯霉素残留量均大于0.15ppb，2份出口养殖对虾氯霉素残留量均小于0.15ppb。提示放射免疫分析法可作为水产品中氯霉素残留量的有效检测手段。

关键词：放射免疫分析法；氯霉素；养殖对虾

Application of RIA Method for the Determination of Remained

Chloramphenicol in Breed Prawn

Xu Meiyi, Meng Qingyong

(Analysis Center of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023)

Abstract: The content of remained chloramphenicol in 3 kinds of fresh breed prawn and 2 kinds of export of breed prawn from Zhanjiang aquatic products market was determined by RIA. The result showed that the limit of determination of RIA method was 0.15ppb. The content of remained chloramphenicol in 3 kinds of fresh breed prawn was higher than 0.15ppb, and it was lower than 0.15ppb in that of 2 kinds of export of breed prawn. It suggested that RIA could be regard as an efficacious method for determining on remained chloramphenicol in aquatic products.

Key words: RIA; chloramphenicol; breed prawn

氯霉素(Chloramphenicol, CAP)是一种有效的广谱抗生素，已广泛应用于动物各种传染性疾病的治疗。CAP在被治疗动物中易造成残留，食用含CAP的动物食品后会引起机体再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症等疾病，对人体健康构成潜在威胁[1,2]。长期以来，动物性食品中CAP残留问题一直备受关注[3]，各国对氯霉素残留规定了最大允许限量(MRL)[4]：欧盟1ppb，美国、加拿大0.3ppb，日本50ppb。因此，有效监测对虾中CAP的残留量，对于保障人体健康、保证外贸产品质量有着重要意义。本文采用放射免疫法测定对虾体内氯霉素含量，检测限量可达0.15ppb，可应用于水产品中氯霉素残留量的痕量检测。

1 材料与方法

1.1 材料

从湛江市霞山水产批发市场购买的3份新鲜养殖对虾，剥壳取虾仁作为分析样品1#、2#、3#，2份出口养殖收稿日期:2003-5-15

作者简介：徐美奕，男，1967,12,广东医学院分析中心实验师,从事实验核医学工作。对虾虾仁为分析样品4#、5#，样品前处理及测定过程中戴一次性手套，防止引入氯霉素污染品。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 仪器

LS-6000SC标准架液体闪烁系统(美国Beckman公司产)；高速匀浆机；高速冷冻离心机；电热恒温水浴箱；XW-80A漩涡混合器；微量可调加样器。

1.2.2 试剂

美国CHARM公司的Charm II Test for Chloram -phenicol 3H-氯霉素放射免疫试剂盒；溶水性闪烁液：PPO 4.0g、POPOP 0.1g、无水乙醇150ml、Triton X-100 50ml加二甲苯至1000ml，PPO、POPOP、Triton X-100均为进口试剂，无水乙醇、二甲苯均为分析纯试剂。

1.2.3 试剂配制

按试剂盒说明书[5]溶解、配制有关试剂。

1.3 测定方法[5]

1.3.1 实验原理[6]

放射免疫分析(Radioimmunoassy, RIA)是建立在免疫反应基础上的核技术，最基本的原理是放射性核素标记的抗原和被测抗原(或标准品)对有限量的抗体

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进行可逆性的竞争结合反应。

Ag(不定量)+Ab（有限量）⇔Ag-Ab(非标记复合物) Ab（有限量）+*Ag (一定量) ⇔*Ag-Ab(标记复合物)

*Ag是放射性核素标记的抗原，与Ag为同种抗原，对抗体(Ab)具有相同的特异结合能力，*Ag、Ag与Ab 以相同的结合率生成复合物，复合物的多少取决于Ag、*Ag的浓度。当[Ag]高时，生成的[Ag-Ab]也多。有限量的Ab被Ag结合多了，与*Ag结合生成的[*Ag-Ab]就少，表现为*Ag-Ab的放射性计数率降低。反之，系统内[Ag]低时，与*Ag结合生成的[*Ag-Ab]多，放射性计数率则升高。因此，*Ag-Ab的放射性(cpm)与待测Ag的含量呈逆相关关系。

1.3.2 样品前处理

取50ml塑料离心管，称取虾仁20g置于离心管中，加入20ml MSU提取缓冲液。用匀浆机将虾仁搅碎、匀浆，虾仁匀浆后将离心管置于80℃水浴45min，然后取出离心管进行冰水浴10min。冰水浴完毕立即进行3300rpm离心10min，吸取上清液于10ml干净试管中，并用M2缓冲液调节其pH为7.5作为样品提取液备用。

1.3.3 氯霉素放免分析程序

取11支10ml试管编号：1~3#为阴性对照，4~6#为阳性对照，7~11#为样品。分别往试管中放进1粒氯霉素抗体药片(白色)，加入0.3ml双蒸馏水，振荡溶解。在1~3#试管中分别加入5ml阴性对照液，4~6#试管中分别加入5ml阳性对照液，7~11#试管中各加入5ml样品提取液，振荡混合15s，加盖上下翻转混匀15次。将各试管置于50℃水浴3min后，将试管移出振荡混合15s，并上下翻转15次，然后又将试管置于50℃水浴中3min。水浴完毕将试管移出，分别加入1粒3H标记的氯霉素抗原药片(绿色)，振荡混合15s，加盖上下翻转15次，将试管置于50℃水浴中3min。温育反应完毕，3300rpm 离心10min，迅速弃去上清液，分别往各试管中加入0.3ml双蒸馏水破坏、溶解抗原抗体复合物。用3ml溶水性闪烁液将抗原抗体复合物溶解液洗净移入闪烁瓶中，旋紧盖子轻轻摇匀，避光4h，待测。

1.3.4 计数率测量

用液体闪烁计数器测定氯霉素试剂阴性对照、阳性对照及样品的cpm。试剂阳性对照氯霉素含量为0.15ppb，根据计数率判断样品浓度范围。

2 结果与分析

2.1 测量数据

试剂阴性对照、阳性对照、待测样品液闪计数率及氯霉素含量见表1。

2.2 结果分析

根据试剂盒说明书，取试剂阴性对照计数率的85%作为零控制点，若样品计数率大于零控制点，则样品为阴性(即样品氯霉素含量<0.15ppb)；阳性对照计数率小于零控制点，符合试剂盒质控要求；样品计数率小于或等于阳性对照的，则样品为阳性，即样品氯霉素含量≥0.15ppb；样品计数率介于阳性对照和零控制点之间的，则样品为假阳性，需重新测定。从表1可见，1~3#样品为阳性，其氯霉素含量均>0.15ppb，5#样品为阴性，其氯霉素含量<0.15ppb，4#样品为假阳性，需重测，重新测量(重复整个测定步骤，而不是简单的重复进行液闪计数)后，测得4#样品氯霉素含量<0.15ppb。也即说，从水产批发市场购买的3份新鲜养殖对虾体内氯霉素含量均大于0.15ppb，2份出口养殖对虾内氯霉素含量均小于0.15ppb。

表1 养殖对虾中氯霉素含量

名称计数率均值(cpm) 氯霉素含量(ppb)

阴性标准542.7 -

零控制点461.3 -

阳性标准366.1 0.15

1#样品98.0 >0.15 2#样品214.5 >0.15 3#样品338.7 >0.15 4#样品460.7 >0.15 5#样品656.7 <0.15 4#样品(重测) 482.1 <0.15 2.3 回收率试验

取5份虾仁样品各20g经样品前处理后，加入适量的试剂阳性对照液，按放免分析程序进行温育、计数率测量，测得回收率分别为93.4%、102.3%、104.8%、98.4%、97.3%，平均回收率为99.24%。

3 讨论

氯霉素残留分析主要方法有微生物法、化学法(包括气相色谱法、液相色谱法等)及免疫检测法[7]。微生物法虽经济、简单，但灵敏度不高(>10ppm)，且缺乏特异性[8]；化学法虽在灵敏度和特异性上有不同程度的提高，检测限量为5~10ppb，但需要繁琐的前处理[9]；免疫检测法主要有放射酶分析法、酶联免疫法和放射免疫分析法，都具有灵敏、特异、简便的优点，但放射酶分析法的放射性物质量较大，易产生放射性污染，酶联免疫法在灵敏度上不及放射免疫分析法[10]。

放射免疫分析法灵敏度高、特异性强、检测限量低、操作简便。用Charm II Test for Chloramphenicol 3H 标记的氯霉素放射免疫试剂盒检测对虾、鱼等水产品中氯霉素含量，具有放射性活度低、放射毒性低、对环境污染少的特点，测定时间约7h，能短时间内检测几十个样品，样品预处理简单，灵敏度高，结果可靠，检测限量达0.15ppb，能满足对出口水产品氯霉素残留的检测要求，可作为水产品氯霉素残留量的检测手段。

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