肝脏蛋白组学及其损伤变化,库夫细胞相应的功能变化

一、肝脏蛋白质组学

1 细胞整体水平上的蛋白组学分析

以肝为整体．对大鼠肝细胞进行全面的蛋白质分析。研究分别对大鼠和小鼠肝的整体蛋白质组进行检测和分析。为提高蛋白的检出率，应用pH值不同的胶条，在l3个二维凝胶每上共切取约5000个点，鉴定约3000个蛋白点，归纳为273种的基因产物。其中，60%大鼠肝蛋白为酶和酶的亚基，7%为结构蛋白，细胞因子约6%，14种热休克蛋白占5%，转运蛋白为3%，核糖体蛋白为l%，其余的各种蛋白为19%。

肝星形细胞在肝的生理、病理过程中发挥了重要的作用。针对星形细胞也进行蛋白质组学研究门，实验鉴定了153种肝星形细胞蛋白。分别对比体外培养的静止期细胞复苏9d后和对大鼠注射四氯化碳8周后的星形细胞，43种表达水平改变的蛋白质或多肽得到鉴定。其中27种蛋白在体内和体外表达均有改变，包括钙周期蛋白、calgizzarin、galectin—1等表达上调的蛋白和肝酯酶10、丝氨酸蛋白酶抑制子等表达下调的蛋白。其中6种蛋白在体内和体外激活后有不同的蛋白质表达。随后通过Northern blots的验证，确认在mRNA 的水平上，mRNA控制着复苏后的培养细胞的钙周期蛋白、calgizzarin galectin等的表达。

2 细胞器水平上的蛋白组学分析

整个细胞溶解后蛋白质的二维电泳的分析，结果大部分是细胞溶质性蛋白，与各种细胞器上蛋白并不相同，执行的功能也不相同。细胞器的特异蛋白，决定细胞器的功能状态。高等真核细胞的蛋白组成复杂，高丰度蛋白质常掩盖低丰度蛋白质，一些细胞器上的蛋白由于丰度较低，不易检出。因此，由此提出亚细胞结构的蛋白质组的研究。

线粒体是真核细胞内的能量代谢中心，参与多种重要的细胞生理、病理过程。对线粒体蛋白质进行相应的蛋白组学分析，在6张不同pH凝胶上的1800个点中，共鉴别192种基因产物，其中8种基因产物是在线粒体上首次发现。鉴定的蛋白质中，69%为酶或酶的亚基，具有广谱催化活性。结构蛋白占9%，热休克蛋白占4%，其余的各种蛋白占18%。平均每10-15个凝胶上的点对应1个基因产物。

高尔基体是真核细胞中内膜系统的组成之一。在细胞生命活动中起重要作用，据估计高尔基体中大约有1000—3000种蛋白质。对鼠肝蛋白进行蛋白组学分析，以了解高尔基体的蛋白组成状况。当细胞处于稳定状态时，高尔基氏体内大约50%蛋白质处于转运状态。使得判定哪些蛋白是高尔基氏体固有蛋白，哪些为生产出的蛋白发生困难。改进实验技术后，应用环己酰亚胺清除转运中的蛋白，获得高度富集高尔基体片段。蛋白合成被抑制后，虽转运动力学明显降低，分泌蛋白和跨膜蛋白通过高尔基体移动到最终目的地。这种预处理方法使转运中的蛋白脱离高尔基体，而富集的高尔基体则聚集在储存槽中。通过改进后的分离技术，富增高尔基体蛋白，经过三重氢核X一114提取后，再用阴离子交换色谱技术获得最好分离，在二维凝胶上得到了588个蛋白点，并用质谱分析了其中丰度最高的99种蛋白。其中47种蛋白得到鉴定，25种为高尔基体蛋白，5种为内质网蛋白，5种为另外的细胞器蛋白，5种为血清蛋白。6种为细胞溶质蛋白，6种细胞溶质蛋白与高尔基体有无相互作用尚不清楚。

二、蛋白质组学的研究方法

1 二维凝胶电泳

二维凝胶电泳(two—dimensional gel eleetrophoresis，2DE)是1975年由Klose和O’Farre在各自的实验室单独发明的。利用这项技术他们成功地分离了大肠杆菌(Escherichia

cob)溶菌液中的多种蛋白质。二维凝胶电泳的第一向为等电聚焦(iso—electric focusi~，IEr)，根据蛋白质分子的等电点(PI)的不同而将其分离；第二向为SDS—PAGE，根据分子量的大小而将其分离。最早采用的是载体两性电解质pH梯度进行等电聚焦，直到九十年代中期固相化pH梯度(immobilized pH gradient)等电聚焦技术的发明，二维凝胶电泳才成为了蛋白质组学研究的有力工具。由于其具有大规模地快速分析和鉴定蛋白质的能力以及具有较好的可重复性和可比性，Glokler和Angenendt相对于蛋白质微阵列(protein microarmy)把其称为蛋白质宏阵列(protein macroarray)。

使用二维凝胶电泳研究蛋白质组学的基本步骤是：蛋白质样品(溶液)的制备一通过2DE 上样分离一2D凝胶上蛋白质印迹点的计算机数字化处理一通过质谱技术(Ms)对所研究的蛋白质进行初步鉴定一搜索数据库获取相关信息后对蛋白质进行最终鉴定。

二维凝胶电泳的上样溶液可以是细胞裂解液，也可以是多种蛋白质的混合溶液。固向化pH 梯度凝胶L6．7 J在等电聚焦向的成功应用使二维凝胶实现了商业化和标准化，也使实验具有了较高的可重复性。蛋白质样品通过二维凝胶电泳，用考马斯亮蓝(Coomassie Blue stain)染色后可获得标准的肉眼可见的蛋白质图谱(protein map)；银染(medmed silver main)后可用于MS分析。

二维凝胶电泳技术的优点十分突出，归纳起来主要有：①二维凝胶电泳结合MS分析可以实现较大规模的蛋白质的分离和鉴定；②二维凝胶电泳特别适用于后修饰的蛋白质(如糖基化、磷酸化、脱氨等)的发现和鉴别。③二维凝胶电泳技术研究蛋白质组学的各个步骤可相互分离，相关工作可在不同的实验室完成。二维凝胶还是蛋白质的“纯化收集器”和蛋白质保存的“文件夹”。干凝胶上的蛋白质在室温下可保存数月甚至数年。长期保存在凝胶上的蛋白质用胰蛋白酶处理后同样可用于MS分析。这对于某些珍贵的样本如一些稀少的组织瘤样本的保存有十分重要的意义。④二维凝胶电泳技术相对廉价，MS分析和生物信息资源的搜寻可通过共享资源或有偿服务来实现。

二维凝胶电泳技术的不足也非常明显。其最大的不足是不可能对整个蛋白质组进行分析和研究。通过染色显示出来的蛋白质图谱只是一些高丰度的蛋白质。低丰度的蛋白质如受体、调节蛋白等很难反映出来。一些分子量比较极端的蛋白质(过大过小的蛋白质分子)以及碱性蛋白和疏水蛋白也不能进行分离和鉴定。典型的如膜蛋白，由于其高的疏水性和表达的低丰度，二维凝胶电泳技术很难应用到膜蛋白的研究中。其二，通过二维凝胶电泳分离的蛋白点(protein spot)不一定只代表一种蛋白质。据报道 8-1 0l，通过二维凝胶电泳获得的真核细胞的蛋白质图谱有20％的点包括了至少两种或两种以上的蛋白质，而原核细胞的蛋白质图谱甚至达到40％。其三．二维凝胶电泳的敏感性差，分离的蛋白质必须要有足够的丰度才能着色。

放射自显影和放射荧光显影在凝胶电泳图谱的标记上效果显著，该方法能使蛋白点的边缘更为清晰，并可直接用于质谱分析。蛋白质图谱的计算机处理技术近年来发展很快，相关的处理软件有：Melanie(Geneva Bioinformatics and Bio-Pad I．aboratories)，ImageMaste(Amersham—Pharmacia Biotech)，Phoretix 2D(Phoretix Internationa1)，Gellab(Scanalytics)，Kepler(Large Scale Pmteomics)，Z3(Compugen)，GD Impressionist (GeneData)．等。

二维凝胶电泳技术作为一种基础技术，其发展和应用在很大程度上依赖于其它新技术的发展。基于二维凝胶电泳技术的质谱技术(based一2DE MS，生物质谱技术)近年来发展迅速，在很大程度上克服了二维凝胶电泳技术的不足，拓宽了其应用范围。基于二维凝胶电泳技术的质谱技术也因此成为了当前蛋白质组学研究的有力工具。

2 生物质谱