蛋白质组学期末作业

1、一、常用的样品制备技术：

1、高丰度蛋白去除技术（抗体亲和法：通过抗原抗体反应原理，用针对样品中多种高丰度蛋白的单克隆或多克隆抗体来特异性去除样品中的高丰度蛋白；染料亲和法：通过高丰度蛋白与染料环结构之间复杂的静电、疏水及氢键相互作用去除样品中的高丰度蛋白，其特异性相对较低。）

2、自由流电泳技术（FFE）（FFE分离原理－IEF（等电聚焦）条件下：根据等电点的不同进行样品分离，主要用于分离蛋白质。ZE（区带电泳）条件下：根据样品表面电荷密度不同进行分离，主要用于分离细胞器。FFE的特点：1、是基于液体的样品分离/制备技术，与所有下游分离技术兼容；2、分离非常快；

3、液相分离保证初始样品具有很高的回收率；

4、采用连续模式，上样和分离连续同时进行；

5、分析对象广泛；

6、分离条件温和，适合活性生物材料的分离纯化。

二、2－DE技术，即双向电泳，是当前蛋白质组学研究中分辨率最高、信息量最大的分离技术。

它的优点有：1. 可以将上千种不同的蛋白质分离开来，并得到每种蛋白质的等电点、表观分子量和含量等信息。2.如果双向电泳后续接一系列自动化操控，就能大大增加蛋白质分析与鉴定的能力。3.可检测翻译后和翻译过程的蛋白质修饰。

缺点有：1、不能进行可完全的2-DE分析。 2、许多较大的疏水蛋白质在IEF分析中的结果不理想。3、对相对分子质量过大（）100000）的蛋白质分离分析能力差 4、双向电泳不易实现自动化操作，不能适应大规模蛋白质组分析的需要5、双向电泳首先由的主要染色技术（考马斯亮兰染色、银染色）的检测灵敏度较差，且局限在越100倍的动态范围，而细胞中蛋白质表达的动力学范围为百万倍，而且从胶上切割下的蛋白点消化后所产生的肽的回收率常常低于60%，这更会妨碍MS对低丰度蛋白的鉴定。

二亚细胞组份的分离与鉴定。分离：最好的分级分离方法是亚细胞器的分离，然后对各细胞器的蛋白质组进行单独研究。一般从三个方面对亚细胞器的纯度进行评价：1．电子显微镜检测 2.标志酶活性测定 3.Western blot

质膜的纯度鉴定方法：

质膜的纯度鉴定方法

11、形态学方法（常规透射电镜、免疫电镜观察其切片，纯细胞膜成空的膜泡或片状结构）

2免疫印迹法（常用抗体:抗caveolin、Na+--K+--ATPase、flotillin、5`-nucleotidase 等）

3、酶活测定法（测 AP、ADP、Na+-K+-ATPase、5`-nucleotidase的活性）

4、膜组分分析法（分析脂质与蛋白质的比例）

由于细胞器在细胞内结构上与许多其他亚细胞组分相关联，和细胞器组成的动态性，所以分离得到的细胞器很难达到100% 的纯度。所以，亚细胞组分的纯度问题和亚细胞组分生物学功能的深入挖掘是亚细胞蛋白质组研究所面临的挑战。现在已经有一些研究策略来解决这一难点问题，如Schirmer等提出的差减蛋白质组学方法来解决核膜的内质网污染问题；Andersen 等提出的蛋白质校正谱图分析法(protein correlation profiling，PCP)来分析可能定位于中心体的蛋白质；Jiang 等运用ICAT 技术和生物信息学手段的方法来确证线粒体蛋白质，排除污染蛋白。

三、药物蛋白质组学就是蛋白质组学技术在药物研发中的应用。

药物蛋白质组学主要应用于：（1）临床前研究-发现所有可能的药物作用靶点，以及针对这些靶点的全部可能的化合物，以及应用蛋白质组学方法研究药物作用机制和毒理学；（2）临床研究方面-发现药物作用的特异蛋白作为患者选择有效药物的依据和临床诊断的标志物，或以蛋白质谱的差异将患者分类并给予个体化治疗。

举例：药物蛋白质组学在药物靶点发现和确认中的应用

（1）研究人员通过比较给药前后的蛋白质组，找到了药物阿霉素抗乳腺癌的一个作用靶标Hsp27。（2）疟原虫入侵血红细胞的阻断靶点探测：半胱氨酸蛋白水解酶是疟原虫生存必需的酶，Greenbaum等利用靶向半胱氨酸蛋白水解酶的化学探针I125-DCG-04打靶，然后通过抗DCG-04的生物素纯化，得到了半胱氨酸蛋白水解酶类的亚蛋白质组；通过酶活性分析，最终发现在疟原虫的入侵血红细胞的裂殖期，仅有一个有半胱氨酸蛋白水解酶活性的蛋白质—falcipain 1；从数据库筛选到falcipain 1的抑制剂YA29-Eps，结果证实YA29-Eps 可阻断疟原虫的入侵红细胞。

四、免疫共沉淀原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。

技术用途：1.鉴定两种目标蛋白质是否在体内结合，以及进行结合位点分析；2.筛选一种特定蛋白质的新的作用搭档。

优点：相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响。

缺点：1.需要高质量的抗体进行IP；2.两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；3.检测不到弱或瞬时的相互作用。

Pull down 实验原理：利用GST、HIS等标签蛋白将一种蛋白质（诱饵蛋白）固定于某种基质上(如Sepharose)，当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，通过改变洗脱液或洗脱条件即可回收所吸附的蛋白。

用途：1.鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用；2.筛选与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质

优点：1.灵敏、周期短；2.不需要构建基因文库；3.抗体质量要求不高；4.可鉴定直接相互作用。

缺点：1.需要纯化的蛋白；2.体外相互作用（假阳性、假阴性）。

五、1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)

2. 电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制 (2) 样品处理(3) 上样与电泳

3. 转膜(Transfer)

4. 封闭(Blocking)

5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)

6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

7. 蛋白检测(Detection of proteins)

8. 膜的重复利用(Membrane recovery)

六、质谱仪的组成要件：样品导入系统、离子源、质量分析器、检测器四个部分。其中离子源又分为电子轰击源、化学电离源、场致电离源、电喷雾电离源。

基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization / Time of Flight Mass Spectra），离子源是基质辅助激光解吸电离，质量分析器是飞行时间管。MALDI-TOF MS是近年来获得快速发展的一种软电离生物质谱，它的建立突破了生物大分子质谱分析的难题，该技术无论在理论上还是在设计上都具有简单、高效、灵敏、快速、准确、测定质量范围大等特点。

肽质量指纹谱（Peptide Mass Fingerprinting, PMF）是蛋白质被识别特异酶切位点的