生物芯片阅读仪

调研报告生物芯片阅读仪【概述】生物芯片，是指利用微细加工技术并结合有关的化学合成技术，将大量探针分子固定于载体即微小的基片（如玻璃、硅片、有机材料薄膜等）上，然后与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强弱，对靶分子的序列和数量进行分析检验的微型器件。

生物芯片阅读仪是生物芯片能否得到广泛应用的重要仪器。

通过生物芯片阅读仪可以将芯片上测定的结果转变成可供分析处理的图像数据，正确、有效的获取芯片上的生物信息。

目前的生物芯片阅读仪主要有两种：CCD系统生物芯片阅读仪和激光共聚焦生物芯片阅读仪。

前者具有结构简单、体积小、检测速度快、成本低等优点，对于点阵相对较低的生物芯片的检测有明显的优势；后者以激光作光源，采用共聚焦探测光路，结合高速X向扫描和Y向步进，实现了对生物芯片的扫读和分析。

激光共聚焦扫描仪具有检测灵敏度高、动态范围宽、信噪比好、测量精度高等优点，可望成为今后的主流机型。

【基本原理与设备组成框图】一、CCD系统生物芯片阅读仪CCD系统生物芯片阅读仪有三种，即它激式荧光检测、化学荧光检测和对用同位素曝光的胶片进行检测，本文主要以它激式荧光检测生物芯片阅读仪为例来介绍。

该仪器适用于化学自发光、多种激发荧光等生物芯片弱光样片的检测和分析。

主要由冷却型科学零级CCD、光学物镜、氙灯光源、均匀照明系统、暗箱、电机驱动选择的发射窄带干涉滤光片和激发窄带干涉滤光片、图像采集卡等部分组成。

组成框图如图1所示。

图1 CCD系统生物芯片阅读仪设备组成框图主要组成部分的功能及作用：①光源：CCD系统生物芯片阅读仪采用高压汞灯作为光源，结构比较简单。

工作时，用均匀化处理的特殊波长的光去激发生物芯片上的荧光。

②激发滤光片：经激发窄带滤光片可去除其他波长的光，降低检测背景。

③发射滤光片、CCD和计算机：生物芯片上标记有荧光染料的靶分子在单色光激发下产生荧光，再经发射窄带干涉滤光片由摄像镜头捕获，成像在CCD相面上，再传至图像采集卡，将信号转化成数字信号进行处理。

该仪器的成像范围为36mm*28mm，空间分辨率达30μm，可检测多种荧光如cy2, cy3, cy5, cy5.5, FITC, Texas, Red等。

同时，该仪器还设有芯片架，可放24片芯片。

二、激光共聚焦生物芯片阅读仪激光共聚焦生物芯片阅读仪的原理如图2所示。

仪器工作时，利用激光照射生物芯片激发荧光，荧光收集物镜收集荧光，通过二色分光镜，经窄带滤光片滤光后，汇集在探测针孔上，由光电倍增管探测，最后经电路放大、转换传到计算机进行处理，获取其中包含的生物信息。

图2 激光共聚焦生物芯片阅读仪设备组成框图主要组成部分的功能及作用：①X向电机、Y向电机、X驱动器、Y驱动器及丝杠等组成扫描工作台，采取的扫描方式是：光源固定即光束保持不变、荧光探测器固定、扫描工作台按一定规律移动的扫描方式。

这种扫描方式被称为物体扫描，其优点是轴线平直，光路稳定，可以实现大面积的扫描。

简言之，本仪器就是利用光电倍增管对点像探测结合高速XY扫描实现对生物芯片信息的大量获取。

所以工作台系统和荧光信号接收系统都很重要。

扫描承片台可放置25mm*75mm的标准样片。

②激光器、窄带滤光片和二色分光镜等组成激光共聚焦光路；光源是两个激光器，分别用于激发cy3和cy5两种荧光染料，扫描时可以选择适当的激光器功率，也可以通过两个快门选择激光束。

③光电倍增管作为荧光信号探测器，可用来探测芯片发出的荧光信号，其增益可选。

④计算机用于处理和分析光电探测器探测到的荧光信号并合成图像。

该仪器用户可定义的扫描面积是22mm*70mm；扫描分辨率是5~100μm；灵敏度是0.2荧光分子/μm2；用户可以看到芯片扫描图像（TIFF图像或BMP图像），并可得到以Excel方式输出图像数据分析结果。

【临床应用】生物芯片阅读仪是伴随着生物芯片的产生而产生的，可以说，需要利用生物芯片技术的地方就必须利用到生物芯片阅读仪，所以生物芯片阅读仪的临床应用与生物芯片的临床应用息息相关。

以下就介绍几种生物芯片的临床应用。

一、基因表达水平的检测用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况。

Schena等采用拟南芥基因组内共45个基因的cDNA微阵列（其中14个为完全序列，31个为EST），检测该植物的根、叶组织内这些基因的表达水平，用不同颜色的荧光素标记逆转录产物后分别与该微阵列杂交，经激光共聚焦显微扫描，发现该植物根和叶组织中存在26个基因的表达差异，而参与叶绿素合成的CAB1基因在叶组织较根组织表达高500倍。

Schena等用人外周血淋巴细胞的cDNA文库构建一个代表1046个基因的cDNA微阵列，来检测体外培养的T细胞对热休克反应后不同基因表达的差异，发现有5个基因在处理后存在非常明显的高表达，11个基因中度表达增加和6个基因表达明显抑制。

该结果还用荧光素交换标记对照和处理组及RNA 印迹方法证实。

在HGP完成之后，用于检测在不同生理、病理条件下的人类所有基因表达变化的基因组芯片为期不远了。

二、基因诊断从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。

从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。

通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。

这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。

例如Affymetrix公司，把P53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成P53基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。

又如，Heller等构建了96个基因的cDNA微阵，用于检测分析风湿性关节炎（RA）相关的基因，以探讨DNA芯片在感染性疾病诊断方面的应用。

现在，肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系列诊断芯片逐步开始进入市场。

基因诊断是基因芯片中最具有商业化价值的应用。

三、药物筛选如何分离和鉴定药的有效成份是目前中药产业和传统的西药开发遇到的重大障碍，基因芯片技术是解决这一障碍的有效手段，它能够大规模地筛选、通用性强，能够从基因水平解释药物的作用机理，即可以利用基因芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异。

如果再c DNA表达文库得到的肽库制作肽芯片，则可以从众多的药物成分中筛选到起作用的部分物质。

还有，利用RNA、单链DNA 有很大的柔性，能形成复杂的空间结构，更有利与靶分子相结合，可将核酸库中的RNA或单链DNA固定在芯片上，然后与靶蛋白孵育，形成蛋白质-RNA或蛋白质-DNA复合物，可以筛选特异的药物蛋白或核酸，因此芯片技术和RNA库的结合在药物筛选中将得到广泛应用。

在寻找HIV药物中，Jellis等用组合化学合成及DNA芯片技术筛选了654536种硫代磷酸八聚核苷酸，并从中确定了具有XXG4XX样结构的抑制物，实验表明，这种筛选物对HIV感染细胞有明显阻断作用。

生物芯片技术使得药物筛选，靶基因鉴别和新药测试的速度大大提高，成本大大降低。

基因芯片药物筛选技术工作目前刚刚起步，美国很多制药公司已开始前期工作，即正在建立表达谱数据库，从而为药物筛选提供各种靶基因及分析手段。

这一技术具有很大的潜在应用价值。

四、个体化医疗临床上，同样药物的剂量对病人甲有效可能对病人乙不起作用，而对病人丙则可能有副作用。

在药物疗效与副作用方面，病人的反应差异很大。

这主要是由于病人遗传学上存在差异（单核苷酸多态性，SNP），导致对药物产生不同的反应。

例如细胞色素P450酶与大约25%广泛使用的药物的代谢有关，如果病人该酶的基因发生突变就会对降压药异喹胍产生明显的副作用，大约5%~10%的高加索人缺乏该酶基因的活性。

现已弄清楚这类基因存在广泛变异，这些变异除对药物产生不同反应外，还与易犯各种疾病如肿瘤、自身免疫病和帕金森病有关。

如果利用基因芯片技术对患者先进行诊断，再开处方，就可对病人实施个体优化治疗。

另一方面，在治疗中，很多同种疾病的具体病因是因人而异的，用药也应因人而异。

例如乙肝有较多亚型，HBV基因的多个位点如S、P及C基因区易发生变异。

若用乙肝病毒基因多态性检测芯片每隔一段时间就检测一次，这对指导用药防止乙肝病毒耐药性很有意义。

又如，现用于治疗AIDS的药物主要是病毒逆转录酶RT和蛋白酶PRO的抑制剂，但在用药3-12月后常出现耐药，其原因是rt、pro基因产生一个或多个点突变。

Rt基因四个常见突变位点是Asp67→Asn、Lys70→Arg、Thr215→Phe、Tyr和Lys219→Glu,四个位点均突变较单一位点突变后对药物的耐受能力成百倍增加。

如将这些基因突变部位的全部序列构建为DNA芯片，则可快速地检测病人是这一个或那一个或多个基因发生突变，从而可对症下药，所以对指导治疗和预后有很大的意义。

五、测序基因芯片利用固定探针与样品进行分子杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品的序列，这种测定方法快速而具有十分诱人的前景。

Mark chee等用含135000个寡核苷酸探针的阵列测定了全长为16.6kb 的人线粒体基因组序列，准确率达99%。

Hacia等用含有48000个寡核苷酸的高密度微阵列分析了黑猩猩和人BRCA1基因约3.4kb长度范围内的核酸序列同源性在98.2%到83.5%之间，提示了二者在进化上的高度相似性。

据未经证实的报道，去年有一种不成熟的生物芯片在15分钟内完成了1．6万个碱基对的测定，96个这样的生物芯片的平行工作，就相当于每天1．47亿个碱基对的分析能力！【发展历史及研究现状】国外的生物芯片及其阅读检测仪器获得了长足的发展，各生物芯片公司或相关仪器公司均推出了各自的生物芯片阅读仪，但迄今为止，还没有相关的国际标准或行业标准出台，所以各商家推出的阅读仪的原理、性能、用途和技术指标等各异。

下面给出了几种国外主要厂家的阅读仪：（1）美国Packard公司于2000年开发的基因芯片阅读仪ScanArray4000，采用激光共聚焦光路。

（2）Axon公司出品的GenePix 4000B激光阅读仪，采用非共聚焦光路。

（3）Genomic SolutionsGene公司的GeneTACLS IV激光阅读仪，采用非共聚焦光路。

近几年来国内研发生物芯片阅读仪的单位比较少，主要的研发单位有浙江大学、中国科学院光电技术研究所以及上海数康公司等。

据目前的信息所知，上海数康公司开发了HD-2001系列生物芯片阅读仪，主要用于阅读生物芯片信号，并对信号进行智能化处理，分析测定结果，实现了生物芯片图像摄取、处理、分析、打印一体化。

HD-2001系列生物芯片阅读仪有助于临床检验人员快速、并行的检测多种肿瘤标志物。

浙江大学等单位也在研制生物芯片仪器。