禽流感病毒分子生物学检测方法综述

5基础科学中国畜牧兽医文摘2012年28卷第11期禽流感（AI ）是由A 型流感病毒（AIV ）引起的一种以禽类呼吸系统及全身性败血症为特征的禽类疾病综合征。

自禽流感被发现至今100多年来，人类并没有掌握特效的防治该病方法。

暴发疫情时，一般还是依靠消毒、隔离、大量宰杀等方法防止其蔓延，经济损失巨大。

能否及时发现该病流行，尽快采取有效措施，是降低经济损失的有效途径。

因此，快速、准确的检测十分重要。

1　聚合酶链式反应1986年，Bea rd 用PCR 技术诊断AI ，大大缩短了AI 的诊断时间。

1993年，Kaw aoka 应用PCR 和Southern-blotting 联合辨别A IV 血凝素基因序列，现已建立了可以直接从临床病料的感染组织中检测AIV 的RT-PCR 诊断技术，可用于所有亚型AIV 感染的早期快速诊断。

1997年，黄平等用PCR-RFL P 方法分析流感病毒H 3N 2亚型毒株，认为该方法作为一种分子流行病学筛选试验在流感变异研究中具有重要作用。

1998年，崔尚金等首次建立了针对H 7亚型A IV 的RT-PCR 诊断技术。

2000年，Schw eiger 等应用荧光PCR 法对呼吸道标本中的流感病毒进行型别、亚型鉴定，并将该方法应用于德国近2个流感流行季节监测中。

2001年，M ing-Shiuh Lee 等建立了以HA 蛋白序列为模板的H 5、H 7亚型特异性RT-PCR 诊断技术和以NP 或M 蛋白序列为模板的型特异性RT-PCR 诊断技术。

同年，Herrmann 报道，用巢式RT-PCR 可以同时检测A 型流感、B 流感。

Spackman 建立了RRT -PCR 方法，将荧光素标记的探针与引物一起在荧光PCR 仪中反应，电脑对整个反应进行实时监测，避免了交叉污染。

利用探查流感M 基因可以迅速诊断病毒感染，同时加入H 5、H 7亚型血凝素特异性探针，研究出一种可以鉴别这2个亚型的RRT-PCR 方法。

2000年，No to mi 等建立了环介导恒等温扩增（LAM P ）技术，这是一种新型的核酸扩增技术。

该方法应用广泛，适用于基层实验室进行快速检测。

2008年，侯佳蕾等根据H 5亚型A IV HA 基因序列，设计了一套特异识别HA 基因序列中6个不同区段的环介导恒等温扩增引物，并以此套引物建立了一种基于LAMP 技术的H 5亚型禽流感病毒诊断方法，结果表明，该方法对H 5亚型A IV RNA 的最小检测限为10-6，灵敏度高于RT-PCR 方法，全部反应可在1.5h 内完成。

在反应体系中添加SYBR G REEN I 染料后，可通过肉眼观察有无荧光，直接判定结果。

N ASBA 技术是一项以RNA 为模板的快速等温扩增技术，该技术特别适用于RNA 分子的检测。

Collins 研究小组于2002年首次发表了关于应用NASBA 技术检测禽流感病毒的论文，目前已成功开发出可检测禽流感群特异性（H 1～H 15）（NASBA -AIV ）、H 5亚型（N ASBA -H5）、H 7亚型（NA SBA-H 7）的NA SBA/ECLipse 检测试剂盒。

2005年，单松华等也建立了N ASBA 技术进行H 5亚型的禽流感检测。

该技术的特点是整个扩增过程在恒温条件下进行，因此不需要特殊的控温装置，大大避免了R 扩增过程中复杂的温度变化，不仅能检测出具有感染性的完整的病毒颗粒，还能检出非感染性病毒粒子以及错误包装的非感染性病毒粒子。

2　基因芯片技术由于流感病毒拥有众多的型和亚型，无论是现存的哪一种诊断方法，都无法同时对所有的流感病毒进行精确的分型。

基因芯片技术可以对成千上万个基因进行检测，它的出现为同时对流感病毒进行检测和分型提供了可能的途径。

基因芯片是指将大量的核酸分子扩增的cDN A 或合成的特异性寡核苷酸探针以大规模阵列形式固化在载玻片等芯片载体上，通过与Cy3、Cy5荧光素标记的样品进行核酸杂交，检测杂交信号的有无和强弱，进而判断样品中被检分子的种类和数量。

该项技术具有高通量的优点，检测禽流感病毒的时间约为7h 左右。

Li J 等建立了鉴别流感病毒型和亚型的基因芯片检测方法，设计的26对引物可从A 型流感病毒HA （H 1，H 2，H 3）、NA （N 1，N 2）和NP 基因，以及B 型流感病毒的HA （H 1，H 2，H 3）、N A （N 1，N 2）和NP 基因上的目的基因杂交，从而达到鉴别型和亚型的目的。

目前基因芯片技术在流感病毒的检测中，主要用于科研和流行病学调查，操作较繁琐，检测成本及硬件要求均较高，离实际应用还有一段距离。

3　核酸探针技术核酸探针自20世纪70年代末出现以来，在致病因子的检测中，越来越发挥出优于常规方法的长处。

它可以确认血清学反应为阴性的慢性病毒的存在，也可以检出培养困难、或不易制成高滴度抗体、或没有被膜蛋白不能制备抗体、或表面抗原分型较多难以找到共性抗体的病毒。

核酸探针灵敏度高，检测样品数量大，需要的设备要求不高，价格相对便宜，使用的探针从早期的对人体危害较大的放射性同位素，到被安全性较高的非放射性标记物所取代。

目前使用较多的是地高辛（异羟基毛地黄毒苷，Digoxigenin ，DIG ）。

D IG 标记探针的标记方法有随机引物法、缺口平移法、末端标记法和PCR 标记法。

其中，PCR 标记法是近年来刚发展起来的一种方法，其原理与PCR 相同，不同之处在于在dNTPs 中的dUTP 带上了DIG 标记物。

黄庚明等利用PCR 技术建立并优化了检测AIV 核酸的D IG 标记的cDNA 探针杂交法。

该探针具有良好的特异性和敏感性，为从分子水平探讨A I V 的发病机理及临床早期快速诊断提供了新的手段。

参考文献[1]　BEARD C W.Avian influen za antibody detection by PCR [J].AvianDisaeae ，1986，（42）：779-785.[2]　KAWAODA D K ，MUNCH M .PCR as a tool for d iagno sis of lowpathogenicity avian influenza[J].Avian Disaeae ，1993，47（2）：1075-1078.[3]　黄平，B ND R ，沈桂章，等用R RFL 方法分析流感病毒3N 亚型毒株[]疾病控制杂志，，（3）；6禽流感病毒分子生物学检测方法综述陈爱林1安亚兰1孟祥升2刘宏祥3（1.江苏省射阳县畜牧兽医站，射阳224300；2.江苏省连云港市动物卫生监督所，连云港222001；3.江苏省家禽科学研究所，225009）[摘　要]禽流感是一种以禽类呼吸系统及全身性败血症为特征的禽类疾病综合征。

一旦暴发疫情，经济损失巨大。

能否及时发现该病的发生，尽快的做出应对措施是降低经济损失的途径之一。

目前，分子生物学检测方法在A I V 病原学检测及诊断方面有着较大优势，可以对其进行快速、准确的检测。

[关键词]禽流感病毒聚合酶链式反应基因芯片技术核酸探针技术7PC E E C A .PC -P H 2J .199717-178.基础科学中国畜牧兽医文摘2012年28卷第11期[4]　崔尚金，陈化兰，唐秀英，等.禽流感RT-PCR诊断法的建立[J].中国预防兽医学报，1998，（2）：42-44.[5]　SCHWE IGER B，ZADOW I，HECKLER R.Ap p lication of afluo rog enic PCR assay fo r ty ping and subty pin g of influenza viruses in respiratory sam ples[J].J Clin Microbiol，2000，（38）：15-52.[6]　Ming-Shiuh Lee.Development o f a real-time reverse transcriptasePCR assay for typ e A influenza virus and the avian H5an d H7 hem agglutinin sub types[J].J o f Clinical Micro b iology，2001，29（4）：446-449.[7]　Herrmann B，Larsso n C，Zweyg berg BW.Sim ultaneo us detectio n andty ping of influenza v iruses A an d B by a nested reverse transcription-PCR：comparison to viru s isolation and an tigen detection b y imm unofluorescence and optical immuno assay（FLU OIA）[J].J Clin M icrobio l.2001；39（1）：134-8.[8]　SPACKM AN E，DENN IS A S，MYERS T J，et al.Developmento f a real-time rev erse transcriptase PCR assay fo r type A influenza v irus and the avian H5and H7hemag glutinin subty pes[J].J o f Clinical M icrobio logy，2002，40（9）：3256-3260.[9]　LEE CW，SUAREZD L.Application o f real-tim e RT2PCR fo r th equantiatio n and co mpetitive rep lication study of H5an d H7subtype avian influenza v irus[J].J Viro lM ethods，2004，（119）：151-158.[10]　DYBKER K，MUNCH M，KURT J H，et al.RT-PCR-ELISA asa to ol for d iagnosis o f low-pathogenicity avian influenza[J].AvianDisease，2003，（47）：1075-1078.[11]　NOTOMI T，OKAYAM A H，M ASUBUC H IH，et al.Loo p-mediatedisothermal amp lification of DNA[J].Nucleic Acid s Res，2000，28（12）：63.[12]　侯佳蕾，罗开健，樊惠英，等.H5亚型禽流感病毒RT2LAM P快速检测方法的建立[J].中国兽医科学，2008，38（12）：1070-1074.[13]　COL INS R A，KO L S，SO K L，et al.Detection o f highly patho genicand lo w patho genic avian influenza subtype H5（Eurasian lineage）using NASBA[J].J VirolM etho ds，2002，103（2）：213-325. [14]　单松华，刘乐庭，陈家华，等.NASBA快速检测禽流感H5亚型病毒[J].中国病毒学，2005（3）：74-78.[15]　Gy armati P，Co n ze T，Zo hari S，et al.Simultaneo us genotyp ingof all hem agg lutinin and neuram indase subtypes of avian influenza viruses b y use of padlock p ro b es[J].J Clin M icrobiol，2008，46（5）：1747-1751.[16]　Li J，Chen S，Ev ans D H.Ty ping and sub typing influenza virususing DNA microarrays and multiple ex rev erse t ranscriptasePCR[J].J Clin M icro biol，2001，39（2）：696-704.[17]　Kessler N，Ferraris O，Palmer K，et e o f t he DNA Flo w-Th ru C hip，a th ree-dim ensional biochip，fo r ty ping and subtyping of influenza virus[J].J Clin Micro bio l，2004，（42）：2173-2185.[18]　Townsend M B，Dawson E D，M ehlm ann M，et al.Experimentalev aluation o f the Flu Chip diagno stic micro array fo r influ enza v irus surv eillance[J].J Clin M icrobio l，2006，（44）：2863-2871. [19]　王秀荣，邓国华，于康震，等.在DNA芯片平台上探测AIV不同亚型cDNA[J].中国农业科学，2005（2）：184-188.[20]　Daw so n E D，Mo ore C L，Dank bar D M，et al.Identification o f A/H5N1influenza virus usin g a single g en diagnostic microarray[J].Analytical Chem istry，2007，79（1）：378～384.[21]　徐秋林.流感病毒寡核苷酸检测芯片的初步研究[D].广东广州：第一军医大学，2005：68-72.[22]　Sengupta S，On o dera K，Lai A，et al.M olecular detection an did en tificatio n of influenza viruses b y oligo n ucleo tide microarray hybridizatio n[J].J Clin M icrobio l，2003，（41）：4542-4550. [23]　刘毅新，刘仲明，王弘，等.用于禽流感H9亚型检验的牙点免疫蛋白芯片的研制[J].中国卫生检验杂志，2007，17（2）：217-219.[24]　黄庚明，辛朝安.PCR制备地高辛标记的探针检测禽流感病毒核酸[J].中国兽医杂志，2001，（12）：3-7.康养殖业生产是一项系统工程，任何一项措施的作用效果，都会在时空上受制于其他要素因子的影响。