禽流感病毒检测方法研究进展

禽流感检测方法研究进展郑胜男本硕21摘要:禽流感是一种可以感染多种禽类和人的烈性传染病,其病毒亚型众多,宿主范围广，容易发生变异和重组，由于各亚型之间无交叉反应性,使得禽流感病毒的检测工作较为困难。

目前，该病毒的检测方法主要有病毒分离鉴定、血清学方法和分子生物学方法，同时,人们也正致力于用一些新兴检测方法来检测禽流感病毒。

现就禽流感病毒的检测方法做一综述。

关键词:禽流感病毒;检测方法;AIV；血清;诊断；分子生物；禽流感是由正黏病毒科、A型流感病毒属中的不同亚型引起的禽类的一种急性高度接触性传染病。

目前已知禽流感病毒的血凝素包括16种亚型，[1]神经氨酸酶包括9种亚型。

其中H5和H7亚型常为高致病性的禽流感病毒。

1.病原学检测方法1 .1病毒分离与鉴定病毒的分离鉴定是禽流感的经典诊断方法，最常用的为细胞接种和鸡胚接种法，以细胞发生病变，鸡胚死亡或培养物尿囊液具有凝集红细胞特性作为判定依据作初步鉴定，也可用针对NP的单抗,用免疫荧光染色作病毒的初步鉴定。

[2]确诊还需其它辅助检测手段。

其检测结果准确可靠，灵敏，极少量病毒也可检出。

但其操作程序繁杂，费用高，实验室要求高，耗时费力，周期长，检测时间需1～3 周，大面积应用推广受到较大限制。

1 .2电镜检测技术用电镜技术或免疫电镜技术诊断禽流感病毒，可以在电子显微镜下清楚观察到粒子形态，确定病毒的有无。

[3]、[4]电镜技术快速、准确，但检验结果与样品制备技术、取病材料的部位和时间有关，且本方法不能用于亚型及致病性的测定。

2.免疫学检测2 .1血凝(HA )和血凝抑制(HI)试验HA 和HI 简单、快速、特异性好，但是操作繁琐费时，不能用已知HA亚型的抗血清检出禽流感新的HA亚型。

HI试验是WHO进行全球流感监测所采用的普及方法。

[5]一般先将可疑病料接种适龄鸡胚或细胞进行病毒分离，然后用HA试验检测出培养物是否具血凝素活性，再用已知阳性血清进行HI试验来验证。

[6]2 .2琼脂扩散试验(AGP)AGP试验是用来检测A型流感病毒群特异性血清抗体，适用于鉴定所有A型流感病毒。

AGP试验操作简单，既可以定性又可以定量。

但敏感性差，易有有假阳性。

现已在AIV快速定型双扩散法[7]基础上建立了AGP诊断试剂盒。

AGP试验可以用敏感性、准确性良好的尿素- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法作为补充或辅助诊断手段。

[8]2 . 3乳胶凝集试验(LAT)LAT 是以聚苯乙烯乳胶颗粒作为载体，吸附特定的抗原或抗体，当遇到血清中相应的抗体或处理过的病料中相应的抗原成份时，会形成肉眼可见的凝集颗粒。

[9]乳胶凝集试验操作简单、快速，不需要贵重的仪器设备和操作技能。

由于LAT 所识别的IgM 抗体是机体最先产生的抗体，LAT 更适合进行早期诊断。

2 .4神经氨酸酶抑制试验(NIT)神经氨酸酶抑制试验是依据A型流感病毒的表面抗原神经氨酸酶的特性来鉴定流感病毒。

van Deuson R A等[10]对常量NIT试验方法进行改进建立了平板微量NIT方法,不仅降低了抗原用量,而且可对多种分离物同时进行抗原分类。

,此法一直被世界卫生组织推荐用于神经氨酸酶亚型的分类。

[11]2 . 5病毒中和试验（NT）NT试验是最经典的血清学方法之一,只有在抗体与病毒粒子上的表面抗原相对应,特别是与吸附到宿主细胞上的病毒抗原相对应时,才能在实验中取得满意效果。

[12]因此,NT试验是最敏感而特异的血清学方法,检出率也相当高，但操作繁琐且耗时。

2·6免疫荧光技术(IFA)免疫荧光技术是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体上，与其相应的抗原结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应,包括直接荧光抗体法和间接荧光抗体法,后者较常用。

IFA特异性强、敏感性好,[13]可用于鉴定和定位禽流感病毒感染的细胞中特异性的抗原,主要是核蛋白和基质蛋白抗原。

但是对抗原制备要求高,结果判定的客观性不足,出现假阳性的概率较高,因此,只是一种筛选方法。

2 . 7酶联免疫吸附试验(ELISA)ELISA是用酶标记抗原或抗体,通过显色反应来检测相应抗体或抗原的一种方法,可进行定性和定量测定。

ELISA方法的敏感性和特异性与包被抗原或抗体的纯度直接相关,高于传统方法的AGP试验和HAI试验,而且更快速，既可检抗原也可检抗体。

目前已建立了禽流感病毒重核蛋白ELISA法、禽流感抗体斑点-ELISA(Dot-ELISA)检测法等。

[14]2·8侧流免疫测定(LFA)LFA技术的检测原理是乳胶珠或胶体金标识的抗原-抗体复合物侧向迁移,直至遇到在一种固定表面(膜支持物)上的抗体,结合滞留后可肉眼观察显色反应。

LFA具有分析迅速的优点,可用于现场检测。

[15]2·9胶体金免疫层析法(GICA)GICA应用免疫层析的原理,将抗原或单克隆抗体固定在层析介质上,待检标本的抗原或抗体通过毛细脉动,结合后滞留在该位区,根据胶体金免疫显色反应做出判断。

GICA是一种快速简便的方法,可在15~30 min内获得诊断结果,具有不需实验设备、可用肉眼判定、试剂用量少、稳定性和重复性好,特异性强等优点,适合于现场快速初筛定性。

缺点是对禽流感检测的敏感性较低，容易漏检或假阳性,不易定量,不方便大批量的集约操作。

[16]2.10压电生物传感器检测仪该技术采用戊二醛交联法,将禽流感H5、H9、禽流感全抗原(HI)等抗原固定于银电极表面,制成多通道的压电免疫传感器,判定标准为检测阳性样品的响应值与阴性样品的噪声值之比>3，可用于AIV的定性定量检测。

生物传感器灵敏度高、响应快,不需要标记,可同步进行禽流感病毒的定性定量和分型诊断检测,具有高灵敏度、小体积、快速、低成本、便于携带等优点。

[17]但需要压电蛋白芯片分析仪等仪器设备,限制了其实际应用。

3.分子生物学检测方法3·1逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)RT-PCR是提取禽流感病毒的总RNA,用逆转录酶反转录成cNDA后进行PCR扩增。

整个检测过程约需8h,可检测出禽流感病毒核酸分子,并可用针对性的引物来进行分型鉴定。

RT-PCR禽流感病毒检测法仅用一对引物即可扩增出H1~H15的HA基因,产物由双脱氧核酸链止法测序分析。

[18]PCR-ELISA方法能从更微量的水平检测禽流感病毒,既适合于快速的定性筛选又可进行定量分析。

[19]多重RT-PCR(mRT-PCR)能一步同时检测多种亚型的禽流感病毒,更为快速和经济。

采用巢式或半巢式RT-PCR可提高扩增的灵敏度和特异性,并使检测的亚型范围进一步扩展。

[20] 3·2实时荧光定量RT-PCR(RRT-PCR)实时荧光定量是在反应体系中利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线或公式法对禽流感病毒的RNA模板进行定性和定量分析的方法。

荧光化学方法应用较多的为TaqMan水解探针、FRET杂交双探针和SYBR green荧光染料法等。

RRT-PCR使检测时间缩短为4 h,敏感性接近鸡胚病毒分离;探针的应用使假阳性达到最小化,并且采用全封闭反应,杜绝了PCR产物的气溶胶污染。

[21]RRT-PCR技术实现了PCR从定性到量的飞跃。

3·3环介导的等温扩增(LAMP)LAMP是一种新的基因高效扩增技术,反应体系简单,由模板DNA、4对特异性引物、BstDNA聚合酶、dNTP和反应缓冲液构成。

在65℃左右的恒温条件下,BstDNA聚合酶催化引物反复进行高效的链置换反应和环介导扩增,整个反应约需30~60 min。

[22]LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法,不需要特殊的试剂和仪器设备,因此,可以建立起总成本低廉的检测体系,适用于现场监测和大量样品高通量筛检,在禽流感检测和防治领域具有广阔的应用前景。

3·4依赖核酸序列的扩增(NASBA)NASBA是一项以RNA为模板,以转录原理为基础的快速等温扩增技术。

该技术需使用逆转录酶、T7 RNA聚合酶和RNA 酶H(RNaseH),以及2条特别设计的寡核苷酸引物,NASBA技术从禽流感病毒核酸分离、扩增以检测整个过程只需4 h,灵敏度与鸡胚培养相当,扩增效率高于传统RT-PCR,在适宜条件下,扩增倍数可达1012。

NASBA技术操作简便,一般为42℃等温扩增,不需要PCR仪等设计,并且在即使有基因组DNA污染的情况下也可以特异性扩增出目的RNA。

NASBA是全封闭反应,产物为RNA,不易对实验仪器造成交叉污染,[23]而且还是一种高通量的方法,非常适合于大规模样品的筛查。

在NASBA技术上进一步发展出的实时NASBA技术,[24]使检测的敏感性和特异性更为提高3·5基因芯片(gene chips)基因芯片是指将大量的核酸分子以大规模阵列形式固化在载玻片等芯片载体上,通过与Cy3、Cy5荧光素标记的样品进行核酸杂交,检测杂交信号的有无和强弱进而判断样品中被检分子的种类和数量。

根据探针的特点不同可以将基因芯片技术分为3类: cDNA芯片、寡核苷酸芯片、基因芯片。

目前,最新的核酸探针检测技术是以微电子为平台的芯片技术，该项技术通量高，,检测禽流感病毒的时间7 h左右，[25]但是操作较繁琐,检测成本及硬件要求均较高,离实际应用还有一段距离。

3.6 核酸探针与原位杂交技术核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片断，能与其互补的核酸序列杂交，形成双链。

原位杂交是经适当处理后使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA 杂交。

地高辛标记cDNA探针具有较好的特异性和敏感性，为从分子水平探讨AI 的发病机理和临床早期快速诊断提供了新的研究手段。

制备NP保守性的探针感染病毒MDCK细胞进行原位杂交检测禽流感病毒RNA 的方法，[26]不但能很好地呈现病毒和细胞的位置关系，而且具有较好的特异性和灵敏性。

3 .7基质检测法将色素原标记在新合成的Neu5Ac上会形成基质底物，当A型和B型流感病毒存在时，基质底物就被病毒包膜表面存在的基质分解，释放出色素原，通过光测定装置就可以检测出。

其敏感性高达96%，特异性为77%，阳性符合率59%，阴性率98%。

[27]但是基质检测法只能用于A型和B型流感病毒的检测，而不能用于C型流感病毒的检测。

该方法简便、快速及敏感性高,适用于各个基层及病毒实验室进行临床诊断。

3.8焦测序技术焦测序技术即在核酸聚合酶的作用下,依次加入4种脱氧核糖核苷酸中的1种,如果加入的脱氧核苷酸与模板互补,则发生延伸反应,释放出等摩尔量的PPi;PPi在三磷酸腺苷硫酸化酶的催化作用下,与5’-磷酸化硫酸腺苷(APS)反应生成三磷酸腺苷(ATP);ATP激活荧光素酶(1uciferase)发出荧光,产生的荧光强度与结合的dNTP数成正比;如果加入的dNTP与模板不互补,则无荧光产生,以此实时测定DNA序列。